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扑草净(4,6-双异丙胺基-2-甲硫基-1,3,5-三嗪)是一种低毒、高选择的内吸性除草剂，因杀草谱广、药效长、除藻效果明显等优点被广泛应用于农业生产和水产养殖中[1]，在水中溶解度低(25 ℃，48 mg·L−1)，半衰期为1~3月，化学性质稳定，难降解，对生态环境的影响已经引起世界各国的关注[2]。2010年扑草净被农业部第1435号公告列入《兽药试行标准废止标准目录》[3]，但许多地区仍将其作为水质改良剂大量用于水产养殖中，造成水环境污染，水产品扑草净残留检出甚至超标[4-5]。此外，扑草净是一种环境内分泌干扰物质，经食物链传递进入体内，可导致生物体内分泌系统、生殖器官、神经系统和免疫系统异常等，威胁生物体健康[6-8]。因此，解决扑草净对水环境的污染问题刻不容缓。植物修复是运用植物遏制、降解或提取环境中外源性污染物的技术，具有高效、环保、无公害、成本低的优点[9]。香根草Vetiveria zizanioides又名岩兰草，为禾本科Gramineae香根草属Vetiveria多年生C4草本植物，根系发达，生物量大，适应性广，是较理想的水土保持植物[10]。近年来，香根草在环境修复领域应用广泛，对重金属铁、镍、铬、锰等有较强的富集能力，可有效净化富营养化水体并吸收降解环境中的阿特拉津[11-13]。扑草净是一种三氮苯类除草剂，化学结构与阿特拉津相似。目前，尚未有香根草修复不同质量浓度扑草净污染水体的相关报道。因此，本研究利用温室水培试验，分析不同初始质量浓度扑草净污染下，水体扑草净质量浓度和香根草体内扑草净质量分数的动态变化，为应用香根草修复农药污染水体提供理论基础。
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供试香根草购于江西红壤研究所，试验场地为西南林业大学格林温室，试验时间为2019年5−7月。选择苗龄及长势一致的香根草植株，以改良Hoagland营养液[14]为母液，稀释2倍后作为水培溶液。扑草净标准品购于济南仁诺化工有限公司。
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设置香根草种植组(T)和未种植香根草组(N)，在培养液中添加不同质量浓度(1.0、5.0、10.0、15.0 mg·L−1)扑草净，分别标记为T1、T5、T10、T15和N1、N5、N10、N15，以种植香根草未添加扑草净为对照(T0)，于第0、5、10和15天分别取样，其中T组采集水体样品和植物样品，N组采集水体样品。
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根据质量差法采集水样，用乙酸乙酯萃取。采用GC-MS(Thermo Fishsher，美国)测定水体中扑草净质量浓度。测试条件为：TG-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 µm)，进样口温度250 ℃，离子传输线温度250 ℃，离子源温度250 ℃。升温程序为：初始温度40 ℃，保持1.0 min，35 ℃·min−1升至180 ℃，保持1.0 min，然后以20 ℃·min−1的速率升至280 ℃，保持1.5 min，不分流进样。进样量为1 µL；载气为氦气；扫描离子质荷比为184、241、58。
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茎叶、根系分别称取(2.00±0.01) g，剪成2~3 mm碎片。用乙腈超声提取。采用GC-MS测定植物不同部位扑草净质量分数，仪器测定条件同水样。
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转移系数FT＝C1/C2，其中C1为茎叶扑草净质量分数(mg·kg−1)，C2为根系扑草净质量分数(mg·kg−1)。
Ct＝C0e−kt，其中Ct为t时间点水体扑草净质量浓度(mg·L−1)，C0为水体扑草净初始质量浓度(mg·L−1)，k为降解速率常数，t为施药后的天数(d)。
扑草净去除率R=[(C0−Ct)/C0]×100%。扑草净相对去除率R0=RT−RN，其中RT、RN分别为相同初始质量浓度及培养时间下，T组及N组扑草净去除率(%)。
采用WPS 2018整理数据，SPSS 19.0进行单因素方差分析，分析方法为Duncan比较法，采用R语言进行相关性分析，Oringin 2018进行绘图。
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准确称取103 mg扑草净标准品，溶于100 mL乙腈中，得到1 000.0 mg·L−1扑草净标准储备液；然后用正己烷逐级稀释为标准溶液，测定色谱峰面积。结果表明：扑草净在0~20.0 mg·L−1范围内线性良好，线性回归方程为y=2.303x+1.727，相关系数为0.999。方法的检出限为0.001 mg·L−1。
取空白水样30 mL，植物样品各2.00 g，分别添加 0.5、1.0、1.5 mg·L−1标准溶液，每个加标水平3个重复。测定不同类型样品加标回收率。其中水样加标回收率为(88.76±4.62)%，根系为(98.23±4.04)%，茎叶为(94.38±4.03)%，相对标准偏差为(4.03~4.62)%，表明该方法符合实验要求。
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由图1A可以看出：随培养时间延长，T组水体扑草净质量浓度呈下降趋势。T1、T5处理，培养15 d水体扑草净较5 d分别降低了81.08%、44.39%，T10、T15处理分别降低了48.99%、47.77%。T1处理，培养15 d后水体扑草净质量浓度为0.14 mg·L−1，为培养10和5 d的33.33%和19.92%；T15处理，培养15 d后水体扑草净质量浓度为4.56 mg·L−1，为培养10和5 d的73.43%和52.23%。表明香根草对不同初始质量浓度扑草净污染水体具有一定修复效果。对不同培养时间下的水体扑草净质量浓度与初始质量浓度进行拟合，发现水体扑草净质量浓度与扑草净初始质量浓度呈线性关系，5、10、15 d拟合方程分别为：y5=0.50+0.60x、y10=0.31+0.43x、y15=0.21+0.32x，决定系数分别为0.961、0.965、0.950；培养时间越长，拟合方程斜率越小，说明扑草净初始质量浓度对水体扑草净质量浓度影响较大。
图 1 不同处理下水体扑草净质量浓度(A)、香根草根系(B)、茎叶(C)扑草净质量分数
Figure 1. Prometryn concentration of water (A), roots (B), shoots (C) of V. zizanioides under different treatments
由图1B可知：T组不同处理根系扑草净质量分数均为第5天最大，随培养时间延长，T1、T5处理下香根草根系扑草净质量分数下降，T10、T15处理下先下降后上升。不同处理根系扑草净质量分数培养10 d较5 d分别减少了52.37%、47.87%、59.30%、47.45%，15 d较5 d分别减少了71.29%、79.23%、39.14%、31.17%。推测5 d时其根部吸收扑草净达到最大值，随后向茎叶发生转移，根系继续吸收水培溶液中的扑草净，使得根系扑草净质量分数再次上升。对不同培养时间下的扑草净初始质量浓度与根系扑草净质量分数进行拟合，发现两者呈线性关系，5、10、15 d的拟合方程分别为：y5=0.52+3.84x 、 y10=−0.10+1.86x 、 y15=−2.41+2.65x，决定系数分别为0.952、0.988和0.929，说明不同培养时间下，扑草净初始质量浓度对香根草根系扑草净质量分数影响密切。
由图1C可知：T组不同处理下香根草茎叶中扑草净质量分数在培养5 d时达到峰值，随培养时间延长持续降低；不同处理茎叶中扑草净质量分数培养10 d较5 d分别降低了35.85%、51.80%、39.77%、29.43%，培养15 d时较5 d分别降低了55.09%、70.00%、58.07%、54.30%。对不同培养时间下的扑草净初始质量浓度与茎叶扑草净质量分数进行拟合，发现茎叶扑草净质量分数与扑草净初始质量浓度正相关，斜率随培养时间延长而减小。5、10、15 d的拟合方程分别为：y5=2.37+0.84 x 、y10=0.97+0.59x 、y15=0.70+0.38x ，决定系数分别为0.816、0.954和0.941，说明随着培养时间增加，香根草茎叶扑草净质量分数降低。
由表1可知：相同培养时间下，香根草转移系数均随扑草净初始质量浓度增加而降低。相比T1，培养5 d时T5、T10、T15香根草转移系数分别降低了30.95%、70.24%、71.43%，培养10 d时分别降低了54.46%、66.96%、70.54%，培养15 d时分别降低了32.06%、87.02%、87.79%。相同初始质量浓度处理下，香根草转移系数随培养时间延长呈波动趋势。T1、T5处理，香根草转移系数培养15 d较5 d分别增加55.95%、53.45%，T10、T15处理，香根草转移系数培养15 d较5 d分别降低32.00%、33.33%。表明香根草对水体扑草净的吸收、转移受初始质量浓度、培养时间影响。
表 1 不同处理下香根草转移系数
Table 1. Transfer coefficient of V. zizanioides under different treatments
t/d T1 T5 T10 T15 5 0.84±0.02 Ab 0.58±0.08 Bb 0.25±0.04 Cab 0.24±0.02 Cab 10 1.12±0.14 Aab 0.54±0.04 Bb 0.37±0.06 Ba 0.33±0.06 Ba 15 1.31±0.14 Aa 0.89±0.06 Ba 0.17±0.01 Cb 0.16±0.01 Cb 说明：大写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)；小写字母表示不同培养时间下差异显著(P＜0.05) -
采用一级反应动力学方程拟合不同培养时间下水体扑草净质量浓度的动态分布规律。水体添加不同质量浓度扑草净后，T组(图2A)和N组(图2B)水体扑草净的降解趋势均符合一级反应动力学方程，拟合度较高，培养时间与水体扑草净质量浓度均呈指数衰减趋势，最后逐渐趋于稳定。结合表2可知：不同初始质量浓度扑草净污染水体中，T组扑草净半衰期为7.42~13.82 d，N组为22.23~33.34 d，种植组较未种植组缩短了14.80~19.78 d；T组降解速率高于N组(P＜0.05)，表明种植香根草可加速水体中扑草净的降解，使降解半衰期提前。由表3可知：不同初始质量浓度扑草净污染的水体中，水体扑草净去除率T组高于N组(P＜0.05)；培养15 d，T组水体扑草净去除率为52.27%~85.88%，N组为29.16%~39.55%，去除率提高了22.52%~55.57%(P＜0.05)，表明香根草对不同初始质量浓度扑草净污染水体均有修复效果，1.0 mg·L−1初始质量浓度处理下，香根草对水体扑草净去除率最高。
图 2 不同处理下水体扑草净质量浓度与培养时间的关系
Figure 2. Relationship between prometryn concentration and cultivation time under different treatments
表 2 不同处理下水体扑草净降解速率和半衰期
Table 2. Degradation rate and half-life of prometryn in water under different treatments
初始质量浓度/
(mg·L−1)T组 N组 降解速率/
d−1半衰期/
d降解速率/
d−1半衰期/
d1.0 0.07 b 9.61 c 0.02 a 29.39 b 5.0 0.05 c 13.82 a 0.02 a 33.34 a 10.0 0.06 bc 10.88 b 0.02 a 29.89 b 15.0 0.09 a 7.42 d 0.03 a 22.23 c 说明：不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) 表 3 不同处理下水体扑草净去除率
Table 3. Prometryn removal rate in water under different treatments
t/d 初始质量浓度/
(mg·L−1)去除率/% T组 N组 相对去除率 5 1.0 23.28±2.26 g 15.72±4.63 c 3.90±1.41 d 5.0 19.93±0.36 g 16.88±0.62 c 3.05±0.08 d 10.0 22.05±1.63 g 17.11±3.10 c 4.94±1.58 d 15.0 40.38±2.95 e 19.57±1.64 c 20.82±4.59 c 10 1.0 56.44±4.68 c 21.68±4.10 c 40.72±8.53 b 5.0 39.64±0.23 e 21.11±3.12 c 22.76±0.38 c 10.0 45.90±1.37 de 21.77±1.46 c 28.80±1.98 bc 15.0 57.56±1.14 c 29.80±3.22 b 37.99±2.31 b 15 1.0 85.88±6.58 a 30.30±1.03 b 55.57±5.66 a 5.0 52.27±4.06 cd 29.75±2.87 b 22.52±4.48 c 10.0 60.25±1.34 bc 29.16±0.15 b 31.09±1.20 bc 15.0 68.82±5.27 b 39.55±0.99 a 29.27±5.65 bc 说明：不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) -
对扑草净初始质量浓度与香根草不同部位扑草净质量分数及水体扑草净质量浓度、转移系数、去除率作相关性分析。由表4可知：扑草净初始质量浓度与香根草转移系数呈极显著负相关(P＜0.01)，与香根草茎叶、根系扑草净质量分数呈极显著正相关(P＜0.01)，与相对去除率相关性不显著(P＞0.05)，相对去除率与培养时间呈极显著正相关(P＜0.01)，与转移系数相关性不显著(P＞0.05)；转移系数与水体扑草净质量浓度、香根草茎叶、根系扑草净质量分数均呈极显著负相关(P＜0.01)。
表 4 扑草净初始质量浓度与香根草不同部位扑草净质量分数、相对去除率的相关性
Table 4. Correlation between initial concentration and the concentration of prometryn in V. zizanioides and relative removal rate
项目 初始质量浓度 培养时间 相对去除率 转移系数 水体质量浓度 茎叶质量分数 根系质量分数 初始质量浓度 1 培养时间 0.000 1 相对去除率 −0.033 0.662** 1 转移系数 −0.844** 0.163 0.328 1 水体质量浓度 0.852** −0.396* −0.349* −0.798** 1 茎叶质量分数 0.659** −0.564** −0.441** −0.610** 0.875** 1 根系质量分数 0.850** −0.298 −0.286 −0.803** 0.916** 0.793** 1 说明：*表示显著相关(P＜0.05)，**表示极显著相关(P＜0.01) -
水体农药污染修复技术中，植物修复因无二次污染、修复彻底等优点成为研究的热点[14]，核心要素是植物的选择，因此，明确香根草对不同质量浓度扑草净的净化潜力尤为关键。研究发现：种植灯心草Juncus effusus和美人蕉Canna indica可显著提高农药的去除效率。本研究发现：培养15 d时，香根草种植组水体扑草净去除率较未种植组提高了22.52%~55.57%，表明香根草对扑草净污染水体有修复效果。与LÜ等[15]和董静等[16]研究一致。但不同植物对农药的吸收和降解效果存在差异。研究发现：芦苇Phragmites australis对特丁津的去除率高于宽叶香蒲Typha latifolia[17]，蓉草Leersia oryzoides对莠去津、二嗪农的去除率高于宽叶香蒲[18]。NI等[19]研究表明：培养30 d时，铜钱草Hydrocotyle vulgaris对0.5 mg·L−1扑草净去除率较未种植植物提高了37%，就扑草净的去除效果而言，香根草优于铜钱草，可能与初始质量浓度、植物种类、生物量和根际微环境差异等多个因素有关。
自然环境中，水体中农药的去除或降解受多种因素影响，如水解、水/有机物分配、微生物降解等[20]。植物可提高降解效率，缩短农药半衰期[21]。本研究发现：不同初始质量浓度扑草净处理下，相比未种植组，香根草种植组水体扑草净半衰期显著缩短；但T15半衰期较其他处理长，可能是该质量浓度已经胁迫到香根草的正常生理活动，其修复效果受到影响，但与N15相比，仍提高了修复效率。
研究植物对有机污染物的吸收、转移特征，对明确有机污染物的环境行为、生态风险评价及植物修复等都具有重要的意义[22]。本研究中香根草体内扑草净质量分数主要与扑草净初始质量浓度有关，这与王庆海等[23]对黄菖蒲Iris pseudacorus的研究结果基本一致。本研究中各处理香根草根系扑草净质量分数培养第5天达到峰值，继续培养，高质量浓度(T10、T15)下先下降后上升，原因可能是培养5 d时，香根草根部吸收扑草净量达到饱和，随后向地上部转移，根系继续吸收水体中的扑草净。香根草茎叶扑草净质量分数与扑草净初始质量浓度呈正相关，与培养时间呈负相关。这与JIN等[24]对绿藻研究结果相似。SUN等[25]也发现香根草根系对扑草净的吸收并不呈线性关系，而是呈先上升后波动下降的趋势，与本研究一致。
转移系数可作为评价植物从根系向茎叶转移扑草净能力的指标[26]。不同培养时间下，香根草转移系数均随扑草净初始质量浓度增加而降低。低质量浓度(1.0 mg·L−1)时，转移系数大于1。这表明低质量浓度胁迫时，通过从地下部分向地上部分转移扑草净，植物根系与地上部一起协同吸收降解扑草净。高质量浓度(10 mg·L−1)时，转移系数先升高后降低，可能是随着胁迫质量浓度升高，植物地下部分向地上部分的物质传输能力降低，水体扑草净的去除以根系吸收降解扑草净为主。与何发林等[27]的结论一致。低质量浓度农药胁迫下，香根草根系活力提高，代谢速率升高，而高质量浓度农药则会对植物产生毒害作用，植物生长受到抑制甚至死亡。植物将大部分污染物滞留或固定在根部，阻止或减少其向地上部分运输，被认为是植物减轻对地上部的毒害，增强植物耐性的重要机制之一[28]。这也是高质量浓度扑草净胁迫下，香根草转移系数降低的原因，与宋清梅等[29]研究结果一致。
相关性分析表明：扑草净初始质量浓度与香根草转移系数呈显著负相关(P＜0.05)，去除率与培养时间呈极显著正相关(P＜0.01)，表明随扑草净初始质量浓度增加，转移系数降低；不同初始质量浓度扑草净胁迫下，香根草相对去除率变化不大，但随培养时间延长而增大。说明扑草净污染水体中香根草存在根际效应[30]，即植物对污染物的去除效率与其根部生物量密切相关。香根草适应性广，根系发达，生物量大[31]，是植物修复扑草净污染水体的理想选择。
Remediation potential of Vetiveria zizanioides on the water polluted with prometryn
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摘要:
目的 探究香根草Vetiveria zizanioides对扑草净污染水体的修复潜力。 方法 采用温室水培模拟实验的方法，研究香根草对水体不同初始质量浓度(1.0、5.0、10.0、15.0 mg·L−1)扑草净的吸收和去除特征。 结果 相同培养时间下，随水体扑草净初始质量浓度增加，香根草茎叶和根系扑草净质量分数显著增加(P＜0.05)，在第5天达到最大值，之后呈波动下降趋势；随培养时间延长，水体扑草净质量浓度显著降低(P＜0.05)。与未种植香根草相比，香根草种植组水体扑草净降解半衰期缩短了14.80~19.78 d，去除率提高了22.52%~55.57%。相关性分析表明：水体扑草净质量浓度与香根草转移系数呈极显著负相关(P＜0.01)，与相对去除率相关性不显著(P＞0.05)，与培养时间呈极显著正相关(P＜0.01)。 结论 种植香根草可提高水体扑草净降解速率和去除率，香根草可作为扑草净污染水体修复的先锋植物。图2表4参31 Abstract:Objective This study is aimed to explore the remediation potential of Vetiveria zizanioides on prometryn polluted water. Method The characteristics of absorption and removal of prometryn by V. zizanioides with different initial concentrations (1.0, 5.0, 10.0, 15.0 mg·L−1)were studied by hydroponic simulation experiment in greenhouse. Result With the same cultivation time, the increase of initial prometryn concentration brought about a significant increase of prometryn concentration (P＜0.05) in the shoots and roots of V. zizanioides, which reached the maximum on the 5th day, and then demonstrated a fluctuating decline. The extension of cultivation time led to a significant decrease in prometryn concentration in water (P＜ 0.05). Compared with the control without V. zizanioides, the degradation half-life of prometryn in the treatment group with V. zizanioides was shortened by 14.80−19.78 days, and the removal rate was increased by 22.52%−55.57%. The concentration of prometryn in water had a significant negative correlation with the transfer coefficient of V. zizanioides (P＜0.01), no significant correlation with relative removal rate (P＞0.05), but a significant positive correlation with the cultivation time (P＜0.01). Conclusion The planting of V. zizanioides can promote the degradation rate and removal rate of prometryn, therefore, V. zizanioides can be used as a pioneer plant in the remediation of prometryn polluted water. [Ch, 2 fig. 4 tab. 31 ref.] -
Key words:
- Vetiveria zizanioides /
- prometryn /
- absorption and removal /
- rhizosphere effect /
- phytoremediation
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金线莲Anoectochilus roxburghii为兰科Orchidaceae开唇兰属Anoectochilus多年生草本植物，别名金线草、金线兰等，主要分布在中国福建、浙江、云南和台湾等地区。金线莲因含有黄酮类、多糖类、生物碱类等成分[1]，其药用价值日益被重视。由于金线莲对生长环境要求严格，且野生资源被过度采摘，导致金线莲已濒临灭绝[2]，因此有必要开展金线莲资源的保护。种质资源收集和遗传多样性评估是金线莲资源保护的基础研究工作。分子标记可以在DNA水平上揭示植物的遗传变异，是一种稳定可靠的遗传分析方法[3]。简单重复序列间扩增多态性(inter-simple sequence repeat，ISSR)和序列相关扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)主要针对非特异性序列进行扩增，对于基因组序列信息匮乏的物种较为有效[4]。目前，分别利用ISSR、SRAP等单一分子标记对金线莲遗传多样性的评价[5-11]已取得了一定的进展，但单一的分子标记技术经常受到扩增区域限制、引物扩增能力差异、模糊显性标记主观计入等因素影响，不能完全评价生物遗传多样性[12-13]，而综合运用多种分子标记，能最大程度优化聚类分析结果[14-15]。目前，结合ISSR与SRAP分子标记技术已经应用于薄荷Mentha haplocalyx[12]、烟草 Nicotiana tabacum[16-17]、韭菜Allium tuberosum [18]、栀子Gardenia jasminoides [19]等研究。本研究采用ISSR与SRAP相结合的方法对浙江与福建等地引种、杂交与野生的金线莲样品进行研究，揭示金线莲个体间与种源间的遗传分化，为金线莲资源的保护和利用提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料
48份金线莲新鲜叶片样品详见表1。
表 1 金线莲供试样品信息Table 1 Tested samples of A. roxburghii编号 样品 来源地 编号 样品 来源地 编号 样品 来源地 1 健君1号 浙江温州 17 尖叶自交辐射选育种 福建福州 33 福建网纹种 福建厦门 2 健君2号 浙江温州 18 红霞变异种 福建厦门 34 福建无网纹种 福建厦门 3 金康1号 浙江金华 19 小叶金线莲 福建福州 35 大福星 福建厦门 4 大圆叶 福建厦门 20 温州文成野生种 浙江温州 36 大圆宝 福建厦门 5 健君1号原种 浙江温州 21 尖叶金线莲 福建泉州 37 红霞 福建厦门 6 戴云山野生种 福建泉州 22 大叶金线莲 福建三明 38 健君1号 浙江温州 7 福建永春黄带种 福建泉州 23 云南金线莲 云南昆明 39 尖叶金线莲 福建三明 8 台湾金线莲 台湾高雄 24 野生无纹 福建厦门 40 庆元无网纹 浙江庆元 9 台湾金线莲 台湾高雄 25 尖叶红杆种 福建福州 41 福建金草繁育种 福建厦门 10 无纹(G) 福建三明 26 尖叶变异筛选种 福建福州 42 小圆叶 福建三明 11 福建金线莲 福建福州 27 尖叶变异筛选种 福建福州 43 银圆宝 台湾高雄 12 大叶(H) 福建三明 28 大叶金线莲 福建三明 44 尖叶自交选育种 福建福州 13 野生种子繁育种 福建三明 29 野生种子繁育种 福建三明 45 尖叶杂交种 福建福州 14 林下尖叶(台州) 浙江台州 30 福建本地银线莲 福建厦门 46 大叶红霞 福建三明 15 林下沙畈本地无纹 浙江金华 31 福建小圆叶 福建厦门 47 尖叶变异筛选种 福建福州 16 野生金线莲 江西萍乡 32 金华本地种 浙江金华 48 无纹金线莲 福建三明 1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取与检测
参照DNA提取试剂盒说明书提取金线莲的DNA，得到的DNA用50 μL双蒸水(ddH2O)溶解。以ddH2O为对照，使用超微量分光光度计检测DNA溶解液的浓度以及纯度。
1.2.2 金线莲ISSR引物筛选及检测
采用哥伦比亚大学公布的第9套100个ISSR通用引物序列，由北京擎科生物科技有限公司合成。使用3个已提取的DNA对100个ISSR引物进行筛选，反应体系总体积为20 μL，其中2×Taq Plus MasterMix 10 μL、ddH2O 8 μL、ISSR引物 1 μL、DNA溶解液1 μL，PCR扩增程序为98 ℃预变性30 s；94 ℃变性10 s，退火(不同引物退火温度不同) 15 s，72 ℃延伸15 s，循环35次；最后72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。对产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，挑选出多态性好、扩增条带清晰的引物对48个DNA样品进行扩增。
1.2.3 金线莲SRAP引物筛选及检测
参照FERRIOL等[20]的设计原理建立SRAP标记分析体系，由北京擎科生物科技有限公司合成，包含14条上游引物(Me1~Me14)和17条下游引物(Em1~Em17)，上下游引物可随机组成238对SRAP引物组合。使用2个已提取的DNA对238对SRAP引物组合进行筛选，PCR体系及扩增程序同上。将挑选出的多态性好、扩增条带清晰的引物对48个DNA样品进行扩增。
1.2.4 数据统计及分析
对PCR扩增产物电泳胶图进行人工读带，对扩增条带按有(1)或无(0)进行统计，形成“0, 1”数据矩阵，分别得到ISSR、SRAP及两者综合的数据。利用Excel统计每个(对)引物的总扩增条带数、多态性条带数和多态位点百分率(PPB)。使用POPGENE 32.0软件计算等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样性指数(H)、Shannon’s多态性信息指数(I)、居群总基因多样性(Ht)、居群内基因多样性(Hs)、基因分化系数(Gst=1−Hs/Ht)和基因流(Nm)等遗传多样性相关参数，并计算不同种源间的遗传距离和遗传一致度，使用OmicStudio工具对遗传距离进行主坐标分析(PCoA)，使用NTSYS-PC 2.1软件对所采集的金线莲样品进行聚类分析并绘制非加权组平均法(UPGMA)树状图。
2. 结果与分析
2.1 引物筛选及扩增多态性
2.1.1 ISSR引物的筛选及其扩增多态性
经过2次筛选，共获得11条条带较为清楚的引物(表2)。11条引物共扩增出86条条带，其中多态性条带有84条，PPB平均值为97.67%，平均扩增条带数是7.82个，平均多态性条带数为7.64个。扩增条带数最多的引物是UBC880 (13条)，其次是UBC861 (12条)，扩增条带最少的是UBC810 (4条)。PPB为83.33%~100%，其中，UBC807、UBC810、UBC826、UBC834、UBC841、UBC842、UBC865、UBC68和UBC861的PPB为100%，均表现出极高的多态性，占总引物的81.82%；UBC856的PPB最低，为83.33%。
表 2 ISSR引物信息及扩增结果Table 2 ISSR primer information and amplification results编号 ISSR引物 序列
(5′→3′)扩增条
带数多态性
条带数PPB/% 1 UBC807 (AG)8T 6 6 100 2 UBC810 (GA)8T 4 4 100 3 UBC826 (AC)8C 6 6 100 4 UBC834 (AG)8YT 8 8 100 5 UBC841 (GA)8YC 10 10 100 6 UBC842 (GA)8YG 8 8 100 7 UBC856 (AC)8YA 6 5 83.33 8 UBC865 (CCG)6 6 6 100 9 UBC868 (GAA)6 7 7 100 10 UBC880 (GGAGA)3 13 12 92.30 11 UBC861 (ACC)6 12 12 100 平均 7.82 7.64 97.67 合计 86 84 说明：Y=(C, T)；PPB为多态位点百分率 2.1.2 SRAP引物的筛选及其扩增多态性
经过2次筛选，共获得11对条带较为清楚的引物组合(表3)。11对引物共扩增出88条条带，其中多态性条带有86条，PPB平均值为97.73%，平均扩增条带数是8个，平均多态性条带数为7.82个。扩增条带数最多的引物组合是Me11-Em4 (12条)；其次是组合Me4-Em13、Me2-Em14和Me13-Em10，扩增出9条条带；扩增条带最少的是Me13-Em16组合，只扩增出6条条带。PPB为88.89%~100%，其中，Me11-Em4、Me8-Em7、Me13-Em7、Me13-Em16、Me4-Em14、Me5-Em11、Me13-Em10、Me14-Em14和Me3-Em2组合的PPB为100%，均表现出极高的多态性，占总引物的81.82%；Me4-Em13和Me2-Em14组合的PPB最低，为88.89%。
表 3 SRAP引物信息及扩增结果Table 3 SRAP primer information and amplification results编号 SRAP引物 正向引物
(5′→3′)反向引物
(5′→3′)扩增条
带数多态性
条带数PPB/% 1 Me11-Em4 BACG DTGA 12 12 100 2 Me8-Em7 BTGC DCAA 7 7 100 3 Me13-Em7 BAAC DCAA 8 8 100 4 Me4-Em13 BACC DCTA 9 8 88.89 5 Me13-Em16 BAAC DGAT 6 6 100 6 Me2-Em14 BAGC DCTC 9 8 88.89 7 Me4-Em14 BACC DCTC 7 7 100 8 Me5-Em11 BAAG DCAC 7 7 100 9 Me13-Em10 BAAC DCAG 9 9 100 10 Me14-Em14 BTCC DCTC 7 7 100 11 Me3-Em2 BAAT DTGC 7 7 100 平均 8 7.82 97.73 合计 88 86 说明：B=TGAGTCCAAACCGG；D=GACTGCGTACGAATT；PPB为多态位点百分率 2.2 遗传距离和遗传一致度分析
ISSR研究中遗传一致度为0.4767~0.9070，遗传距离为0.0976~0.7408。其中，遗传一致度最高的1号与2号、3号与17号、14号与17号，均为0.9070，它们的遗传距离最小，均为0.0976，说明其亲缘关系较近；遗传一致度最低的是7号与22号，为0.4767，其遗传距离最大，为0.7408，说明其亲缘关系较远。在SRAP研究中遗传一致度为0.4659~0.9545，遗传距离为0.0465~0.7638。其中，遗传距离最小的是36号与37号，遗传距离最大的是10号与39号。综合ISSR和SRAP的数据后，遗传一致度为0.5115~0.8793，遗传距离为0.1286~0.6704。其中，遗传距离最小的是34号与37号，遗传距离最大的是10号与39号。
将48份样品按照产地来源分为5个群体(浙江、福建、台湾、江西和云南)，利用POPGENE 32软件对其遗传距离和遗传一致度进行计算，结果如表4所示。使用OmicStudio工具将ISSR+SRAP的标记结果进行PCoA分析，结果如图1所示：由于来自台湾(3个)、江西(1个)和云南(1个)的样品数目较少，故不作分析。结合表4与图1可知：浙江省与福建省金线莲种质混杂。
表 4 金线莲群体间的遗传一致度与遗传距离Table 4 Genetic agreement and genetic distance among A. roxburghii populations分子标记 产地 浙江 福建 台湾 江西 云南 ISSR 浙江 0.9577 0.8842 0.8416 0.7285 福建 0.0433 0.8916 0.7792 0.7336 台湾 0.1231 0.1148 0.7310 0.6552 江西 0.1724 0.2495 0.3133 0.5814 云南 0.3168 0.3098 0.4228 0.5423 SRAP 浙江 0.9853 0.9480 0.7960 0.8351 福建 0.0148 0.9531 0.7880 0.8233 台湾 0.0534 0.0480 0.7796 0.7978 江西 0.2282 0.2383 0.2490 0.6250 云南 0.1802 0.1945 0.2259 0.4700 ISSR+SRAP 浙江 0.9712 0.9160 0.8187 0.7818 福建 0.0292 0.9229 0.7835 0.7798 台湾 0.0878 0.0802 0.7555 0.7270 江西 0.2000 0.2439 0.2804 0.6034 云南 0.2462 0.2487 0.3188 0.5051 说明：对角线下方为Nei’s遗传距离，对角线上方为Nei’s遗传一致度 2.3 遗传多样性分析
分析浙江与福建种源的样品，结果如表5所示：ISSR分析显示，43个种源在物种水平上，Na为1.9651，Ne为1.4403，H为0.2727，I为0.4247，PPB为96.51%；在群体水平上，Na为1.7093~1.9302，Ne为1.3409~1.4325，H为0.2075~0.2668，I为0.3207~0.4147，PPB为70.93%~93.02%，相对于物种水平而言，群体间的遗传多样性水平较低。SRAP结果与ISSR结果相似。结合ISSR与SRAP的数据分析：43个种源在物种水平上，Na为1.9713，Ne为1.3797，H为0.2429，I为0.3873，PPB为97.13%；在群体水平上，Na为1.7816~1.9425，平均值为1.8621；Ne为1.3578~1.3607，平均值为1.3593；H为0.2239~0.2288，平均值为0.2264；I为0.3488~0.3664，平均值为0.3576；PPB为78.16%~94.25%，平均值为86.21%，也是群体间的遗传多样性水平更低。其中，从ISSR、SRAP及综合研究结果来看，Na、Ne、H、I及PPB中基本上是福建省大于浙江省，说明福建省的金线莲种群遗传多样性更高。
表 5 金线莲遗传多样性参数Table 5 Genetic diversity parameters of A. roxburghii分子标记 产地 等位基
因数 (Na)有效等位
基因数 (Ne)Nei’s基因多样
性指数 (H)Shannon’s多态性
信息指数 (I)多态位点百
分率 (PPB)/%ISSR 浙江 1.709 3 1.340 9 0.207 5 0.320 7 70.93 福建 1.930 2 1.432 5 0.266 8 0.414 7 93.02 群体水平 1.819 8 1.386 7 0.237 2 0.367 7 81.98 物种水平 1.965 1 1.440 3 0.272 7 0.424 7 96.51 SRAP 浙江 1.852 3 1.380 0 0.239 9 0.376 3 85.23 福建 1.954 5 1.284 8 0.191 6 0.319 1 95.45 群体水平 1.903 4 1.332 4 0.215 8 0.347 7 90.34 物种水平 1.977 3 1.320 6 0.213 8 0.350 8 97.73 ISSR+SRAP 浙江 1.781 6 1.360 7 0.223 9 0.348 8 78.16 福建 1.942 5 1.357 8 0.228 8 0.366 4 94.25 群体水平 1.862 1 1.359 3 0.226 4 0.357 6 86.21 物种水平 1.971 3 1.379 7 0.242 9 0.387 3 97.13 2.4 UPGMA聚类分析
2.4.1 基于ISSR标记的聚类
由图2可见：48份金线莲样品的遗传相似性系数为0.62~0.91，变幅为0.29。在遗传相似系数为0.67处，48份金线莲样品被划分为3类：在Ⅰ类中地理位置相同的主要有浙江温州的1、2、5、38号以及福建福州的17、25、26、27、44、45号，两地间亲缘关系相对较近；而Ⅱ类与Ⅲ类中样品的来源组成均较为分散，无明显特征。
2.4.2 基于SRAP标记的聚类
图3显示：48份金线莲样品的遗传相似性系数为0.62~0.95，变幅为0.33。在遗传相似系数为0.65处，48份金线莲样品被划分为2类，Ⅰ类中1、5、38号均来自浙江温州，且品种相似，故聚为一类；而在Ⅱ类中，各个品种难以明显划分出小类，这也是各地种质较为混乱所带来的结果。与ISSR标记相比，SRAP标记更难划分类别。
2.4.3 基于ISSR+SRAP标记聚类
图4显示：48份金线莲样品的遗传相似性系数为0.64~0.88，变幅为0.24。在遗传相似系数为0.68处，48份金线莲样品被划分为4类，Ⅰ类中地理位置相同的主要有浙江温州的1、2、5、38号以及台湾高雄的8、9号，两地间可能品种相互引种；Ⅱ类中主要为来自福建福州的样品，包括17、25、26、27、44、45号；Ⅲ类中地理位置相同的主要有福建厦门的4、18、24、31、33、34、36、37号以及福建三明的12、13、22、28、29、48号，两地间品种互引的可能性较大。2种分子标记结合的方法更易体现样品间亲缘关系、划分类别，更清楚地体现地理位置对亲缘关系的影响。
3. 讨论与结论
本研究利用ISSR与SRAP对48份不同来源金线莲样品进行遗传特性分析，共筛选获得11条ISSR引物，扩增86条条带，其中多态性条带84条，PPB为97.67%；筛选出的11对SRAP引物共扩增出了88条条带，多态性条带86条，PPB为97.73%。说明供试金线莲样本具有丰富的遗传多样性，且相较于王剑锴等[10]筛选出的用于检测金线莲资源遗传特性的RAPD分子标记，ISSR与SRAP的标记多态性明显增多，进一步验证了ISSR与SRAP在金线莲种源多态性检测方面的高效率。
基于ISSR与SRAP分子标记对金线莲样品的遗传距离与遗传一致度分析发现：遗传距离最小的是34号(福建厦门福建无网纹种)与37号(福建厦门红霞)，其亲缘关系较近；遗传距离最大的是10号(福建三明的无纹G)与39号(福建三明的尖叶)，其亲缘关系较远。从遗传多样性分析结果来看，来自福建的金线莲遗传多样性更高，同时结合金线莲群体间的遗传一致度与遗传距离结果以及PCoA分析，可以看出各地间金线莲种质资源十分混杂，其中包含了大量的野生种、半野生种和人工驯化的栽培种及杂交种，这种复杂性导致不同种源间的差异性明显，金线莲种质的遗传多样性增加。浙江省市场内流通的栽培种多为省外引入种[21-22]，各种质遗传交流频繁，这有利于培育出较优的金线莲品种。
本研究单独使用ISSR或SRAP的UPGMA聚类结果中，均出现各地间种源相互混杂的状况，并未严格按照地理距离的差异进行归类，而2种分子标记结合的聚类结果中，金线莲种质资源的聚类与不同地理位置分布的情况有比较高的一致度，表现出了一定地域性分布规律，说明2种分子标记方法结合相较于单一的分子标记方法能更准确地体现不同地区金线莲的差异性。由于2种分子标记所检测的基因座位以及所用的引物等因素存在差异，故两者得到的遗传距离不同，其聚类图也存在差异[23]，且每种分子标记方法均有其优势与不足，结合多种标记技术则能更全面、准确地揭示种质遗传特性。因此，本研究结合ISSR与SRAP能更准确地揭示金线莲资源的遗传多样性和亲缘关系，为金线莲良种培育以及野生金线莲资源保护等方面提供了帮助。此外物种的遗传特性容易受到生态环境、繁殖方式以及各种人为活动的影响，野生金线莲经过长期的自然选择，其遗传背景较为复杂；人工栽培种种源多来自于野生金线莲，品种混杂。同时金线莲在野外萌发所需的自然条件苛刻，加之生境的易碎性对其生存产生很大压力[24]，因此金线莲的遗传多样性受到生态环境极大的影响，所以有必要保护当地的生态环境以维护金线莲物种多样性。
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图 1 不同处理下水体扑草净质量浓度(A)、香根草根系(B)、茎叶(C)扑草净质量分数
大写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)；小写字母表示不同培养时间间差异显著(P＜0.05)
Figure 1 Prometryn concentration of water (A), roots (B), shoots (C) of V. zizanioides under different treatments
图 2 不同处理下水体扑草净质量浓度与培养时间的关系
Figure 2 Relationship between prometryn concentration and cultivation time under different treatments
表 1 不同处理下香根草转移系数
Table 1. Transfer coefficient of V. zizanioides under different treatments
t/d T1 T5 T10 T15 5 0.84±0.02 Ab 0.58±0.08 Bb 0.25±0.04 Cab 0.24±0.02 Cab 10 1.12±0.14 Aab 0.54±0.04 Bb 0.37±0.06 Ba 0.33±0.06 Ba 15 1.31±0.14 Aa 0.89±0.06 Ba 0.17±0.01 Cb 0.16±0.01 Cb 说明：大写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)；小写字母表示不同培养时间下差异显著(P＜0.05) 
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表 2 不同处理下水体扑草净降解速率和半衰期
Table 2. Degradation rate and half-life of prometryn in water under different treatments
初始质量浓度/
(mg·L−1)T组 N组 降解速率/
d−1半衰期/
d降解速率/
d−1半衰期/
d1.0 0.07 b 9.61 c 0.02 a 29.39 b 5.0 0.05 c 13.82 a 0.02 a 33.34 a 10.0 0.06 bc 10.88 b 0.02 a 29.89 b 15.0 0.09 a 7.42 d 0.03 a 22.23 c 说明：不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)
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表 3 不同处理下水体扑草净去除率
Table 3. Prometryn removal rate in water under different treatments
t/d 初始质量浓度/
(mg·L−1)去除率/% T组 N组 相对去除率 5 1.0 23.28±2.26 g 15.72±4.63 c 3.90±1.41 d 5.0 19.93±0.36 g 16.88±0.62 c 3.05±0.08 d 10.0 22.05±1.63 g 17.11±3.10 c 4.94±1.58 d 15.0 40.38±2.95 e 19.57±1.64 c 20.82±4.59 c 10 1.0 56.44±4.68 c 21.68±4.10 c 40.72±8.53 b 5.0 39.64±0.23 e 21.11±3.12 c 22.76±0.38 c 10.0 45.90±1.37 de 21.77±1.46 c 28.80±1.98 bc 15.0 57.56±1.14 c 29.80±3.22 b 37.99±2.31 b 15 1.0 85.88±6.58 a 30.30±1.03 b 55.57±5.66 a 5.0 52.27±4.06 cd 29.75±2.87 b 22.52±4.48 c 10.0 60.25±1.34 bc 29.16±0.15 b 31.09±1.20 bc 15.0 68.82±5.27 b 39.55±0.99 a 29.27±5.65 bc 说明：不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)
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表 4 扑草净初始质量浓度与香根草不同部位扑草净质量分数、相对去除率的相关性
Table 4. Correlation between initial concentration and the concentration of prometryn in V. zizanioides and relative removal rate
项目 初始质量浓度 培养时间 相对去除率 转移系数 水体质量浓度 茎叶质量分数 根系质量分数 初始质量浓度 1 培养时间 0.000 1 相对去除率 −0.033 0.662** 1 转移系数 −0.844** 0.163 0.328 1 水体质量浓度 0.852** −0.396* −0.349* −0.798** 1 茎叶质量分数 0.659** −0.564** −0.441** −0.610** 0.875** 1 根系质量分数 0.850** −0.298 −0.286 −0.803** 0.916** 0.793** 1 说明：*表示显著相关(P＜0.05)，**表示极显著相关(P＜0.01)
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