下载:
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Wuschel-related homeobox (WOX)是植物特有的新型转录因子，属于Homepbox (HOX)超家族，包含由60~65个氨基酸组成的螺旋-环-螺旋-转角-螺旋的保守结构域。WOX家族基因分为3个独立进化支，即现代进化支(modern clade，WUS)，中间进化支(intermediate clade)和远古进化支(ancient clade)[1-3]，其中WUS是最早发现的WOX家族成员[4]。WOXs蛋白在植物胚胎形成[5]、干细胞维持[6]和花发育[7]等方面发挥重要作用。拟南芥Arabidopsis thaliana中WOX家族有15个成员，分别是AtWUS和AtWOX1~AtWOX14[4]，其中，AtWOX10、AtWOX13和AtWOX14蛋白属于远古进化分支，AtWUS和AtWOX1~7等8个蛋白质属于WUS分支，AtWOX8、AtWOX9、AtWOX11和AtWOX12蛋白属于中间进化分支。AtWUS在胚珠、花药和茎尖分生组织中表达，是维持中央分生组织的关键基因，AtWOX11和AtWOX12参与新生根器官发生，在顶端分生组织发育阶段，AtWUS参与干细胞稳态维持[8]。超表达AtWUS促进棉花Gossypium hirsutum体细胞胚胎发育和器官发生[9]。水稻Oryza sativa中，OsWOX11激活冠根的萌发和生长，过表达OsWOX11可促进雌蕊增加[10]；OsWOX3A参与水稻叶片、小穗、分蘖和侧根的发育[11]；在茎顶端分生组织和腋分生组织中OsWOX4正调控干细胞[12]。超表达WOX11 (PeWOX11a和PeWOX11b)或WOX11/12a增加转基因植株不定根数量[13-14]。在小麦Triticum aestivum中超表达TaWUS影响外花轮状器官发育，TaWOX9促进转基因拟南芥根的发育[15]。
WOXs转录因子不仅调控植物生长发育，而且参与胁迫响应。在水稻中OsWOX12A和OsWOX12B等基因的表达受干旱、寒冷和盐胁迫差异调控，超表达OsWOX11通过促进根毛生长发育提高转基因植株干旱胁迫耐受性[16-17]。84K杨树Populus alba×P. glandulosa中，干旱胁迫诱导PagWOX11/12a基因强烈表达，促进根系伸长和生物量生长，上游调控因子PagERF35激活PagWOX11/12a表达[18]，PagWOX11/12a通过调控PagCYP736A12基因表达，调节活性氧(reactive oxygen species，ROS )清除，提高杨树耐盐性[19]。
杜仲Ecommia ulmoides是杜仲科Eucommiaceae杜仲属Eucommia的落叶乔木，为中国二级保护植物，叶片、树皮和果皮中富含杜仲胶，是重要的胶用和药用经济树种，具有极高的开发利用价值[20]。杜仲叶片中含有绿原酸、黄酮类、木脂素类、环烯醚萜类、α-亚麻酸等药用成分，具有抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤、增强免疫力等重要作用[21-22]。鉴于WOX基因在拟南芥、水稻、玉米Zea mays、杨树、油菜Brassica napus、铁皮石斛Dendrobium officinale等中的作用，推测WOX家族基因可能在杜仲叶芽的形成和激活过程中起关键作用。本研究以杜仲基因组数据为基础，对杜仲WOX家族基因进行了全基因组鉴定和生物信息学分析，基于转录组分析WOX在杜仲叶片不同发育时期以及杜仲胶形成中的表达模式，利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测杜仲WOX基因(EuWOXs)在‘紫叶’杜仲‘Ziye’叶片发育中的表达水平，以期为EuWOXs功能的深入研究奠定基础。
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自西北农林科技大学苗圃(陕西杨凌)，取生长正常长势一致的2年生‘紫叶’杜仲幼苗的叶芽(茎尖)、生长叶(3 cm长叶片)、幼叶(完全展开的新叶)，用液氮迅速处理，置于−80 ℃冰箱保存。
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拟南芥WOX蛋白序列下载于TAIR数据库(
https://www.arabidopsis.org/index.jsp )，根据Pfam号(PF00046)在杜仲基因组数据库中筛选出WOX家族基因候选序列，利用美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的保守结构域搜索服务(Conserved Domain Search Service，CD Search)检测蛋白质保守结构域，筛选出具有完整WOX结构域的蛋白质作为EuWOX家族成员，利用生物信息学方法[23]分析EuWOXs的理化性质。 -
通过杜仲基因组数据库搜索WOX基因在染色体上的位置及每条染色体长度，利用MapGene2Chromosome v2 (
http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/ )软件绘制WOX家族基因染色体定位。利用DNAMAN进行蛋白序列比对，通过Clustal X 1.83对杜仲、拟南芥、毛果杨、水稻和玉米WOXs蛋白进行多序列比对，利用MEGA 6.0邻接法(neighbor-joining)，重复次数设置为1 000次[24]，构建系统发育树，根据拟南芥同源基因对EuWOXs蛋白命名。 -
利用GSDS (
http://gsds.gao-lab.org/index.php )软件分析EuWOXs的内含子和外显子分布。利用MEME (http://meme-suite.org/ )软件分析EuWOXs基序，参数设置为：any number of Repetitions，maximum number of Motifs=20，minimum width≥6，and maximum width≤50。分离EuWOXs启动子(ATG)上游2 000 bp序列，利用Plant CARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htmL/ )分析EuWOXs启动子顺式作用元件。 -
从NCBI的Short Read Arshive (SRA)数据库中下载‘秦仲1号’‘Qinzhong No.1’叶片不同发育时期(叶芽、初生叶、幼叶、老叶)(版本号：SRP218063)[25]及高产胶杜仲品种‘秦仲2号’‘Qinzhong No.2’、低产胶杜仲品种‘小叶’‘Xiaoye’(版本号：SRP158357)[26]的转录组数据，使用每1百万个映射上的碱基中映射到外显子的每1千个碱基上的碱基个数(fragments per kilobase million，FPKM)值表示EuWOXs相对表达丰度，取对数(log2)进行统计分析，利用TBtools工具绘制基因表达图谱[27]。
使用Trizol(天根DP424)提取RNA，反转录成cDNA，通过Primer 3.0软件设计EuWOXs特异性引物(引物序列见表1)，通过Quant Studio 6(新加坡Life Technologies公司)，All-in-One SYBR Premix EX TaqTM kit(美国Gene Copoeia公司)进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)反应，10 μL反应体系：2× mix 5.00 μL、正向引物/反向引物各0.25 μL、cDNA 2.00 μL、ROX 0.20 μL、双蒸水2.30 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，45个循环。以UBCE2为内参基因[26]，通过$2^{-\Delta \Delta C_t} $法对3次生物学重复进行数据分析。
表 1 引物序列
Table 1. Primer sequences
基因名 上游引物(5′→3′) 下游引物(5′→3′) EuWOX1 ATGGTGGGTGACCAGCTTAG TTCTCTGGCCTTGTGGTTCT EuWOX2 ACCGTACCCCAACCTACTCC ACTTCCCGTTGGATGAAGTG EuWOX4-1 GGAACCCTACGCAAGAACAG GCGCTTCTGCTTTTGTCTCT EuWOX4-2 TAGAGCAGATCACGGCACAG CTAGGGTCGGATGTTGGAGA EuWOX5 GACGGAGCAAGTGAGAGTCC TCTCCCGTGCCTTATGATTC EuWOX11 ACTCGAGTTTTGTGGCCTGT AATTGGAGGCATCTGGATTG EuWOX13-1 GGTCTGAGGGCATGTGTTTT TTGGAGATATGGGTGGTGGT EuWOX13-2 GGGTTGTTCGTCAAGGTCAT GTTGGAATCCACCGTTGTCT UBCE2 AGTGGGTGGTGCTGTAGTCC AACTCCCGTTTCGTTTGTTG -
通过STRING软件(
https://string-db.org/ )上传EuWOXs蛋白质序列，利用拟南芥数据库，根据拟南芥WOXs蛋白已知互作关系，预测EuWOXs互作蛋白，通过Cytoscape 3.7.0软件对EuWOXs蛋白质互作信息进行评估和预测[28]。 -
由表2可知：从杜仲基因组中共鉴定到8个EuWOXs，分布在8条染色体上(图1)；均含有HD保守结构域，其中EuWOX1序列最长，编码352个氨基酸，EuWOX13-2序列最短，编码191个氨基酸。EuWOXs分子量为22.12~40.36 kDa，EuWOX11等电点最小，为5.62，EuWOX4-1等电点最大，为9.04；亚细胞定位预测结果显示：EuWOXs均定位在细胞核中，均为亲水性蛋白。
表 2 EuWOXs蛋白质序列特征及亚细胞定位
Table 2. Sequence characteristics and subcellular location of E. ulmoides WOX proteins
基因号 基因名 拟南芥
同源基因染色体 位置 CDS长度/
bp氨基酸数/
个分子量/
kDa等电点 亚细胞
定位EUC13591-RA EuWOX1 AT3G18010.1 Super-Scaffold_235 3540694-3544292 1059 352 40.36 5.78 细胞核 EUC12552-RA EuWOX2 AT5G59340.1 Scaffold912_obj 156744-159059 810 269 30.16 8.11 细胞核 EUC15721-RA EuWOX4-1 AT1G46480.1 Super-Scaffold_242 604979-606289 618 205 23.48 9.04 细胞核 EUC21176-RA EuWOX4-2 AT1G46480.1 Scaffold272_obj 37477-39280 642 213 24.31 8.82 细胞核 EUC18832-RA EuWOX5 AT3G11260.1 Super-Scaffold_117 336319-340482 549 182 20.70 6.92 细胞核 EUC00362-RA EuWOX11 AT3G03660.1 Super-Scaffold_154 68808-70507 765 254 27.67 5.62 细胞核 EUC00756-RA EuWOX13-1 AT4G35550.1 Super-Scaffold_233 319468-325733 810 269 30.42 6.22 细胞核 EUC02503-RA EuWOX13-2 AT4G35550.1 Super-Scaffold_71 6332599-6364092 576 191 22.11 6.54 细胞核 
图 1 EuWOXs染色体位点
Figure 1. Chromosome site of EuWOXs genes
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利用DNAMAN软件对8个EuWOXs及12个拟南芥WOXs蛋白(AtWOXs)保守结构域进行序列分析。结果(图2)显示：WOXs蛋白质HD结构域氨基酸及其分布具有显著的相似性，均包含由60个氨基酸组成的螺旋-环-螺旋-转角-螺旋，螺旋较环和转角保守。谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)和脯氨酸(Pro)是螺旋Ⅰ (Helix Ⅰ)结构域的保守氨基酸，脯氨酸、异亮氨酸(Ile)和亮氨酸是螺旋Ⅱ (Helix Ⅱ)结构域的保守氨基酸，相比之下，螺旋Ⅲ (Helix Ⅲ)结构域最为保守，其中保守氨基酸有天冬酰胺(N)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、谷氨酰胺、天冬酰胺和精氨酸(R)。EAR-like仅存在于EuWOX1、EuWOX2、EuWOX4-1、EuWOX4-2和EuWOX5中，属于WUS，暗示EuWOXs在进化过程中具有保守性。
图 2 拟南芥和杜仲WOXs的蛋白质同源结构域序列分析
Figure 2. Sequence analysis of WOX proteins homeo domain in A. thaliana and E. ulmoides
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对8个杜仲EuWOXs、15个拟南芥AtWOXs、18个毛果杨Populus trichocarpa WOX蛋白(PotriWOXs)、13个水稻OsWOXs、20个玉米ZmWOXs的蛋白质序列进行多重比对，构建无根系统发育树。结果如 图3所示：74个WOXs蛋白共分为3组[远古进化支、中间进化支和现代进化支(WUS)]，其中远古进化支含有12个WOXs蛋白，中间进化支含22个WOXs蛋白，现代进化支包含的蛋白数量最多，共有40个。8个EuWOXs中，EuWOX13-1和EuWOX13-2属于远古进化支，EuWOX11属于中间进化支，EuWOX1、EuWOX2、EuWOX5、EuWOX4-1和EuWOX4-2等5个蛋白质属于WUS。进化结果显示：杜仲与毛果杨亲缘关系最近。
图 3 杜仲、拟南芥、毛果杨、水稻和玉米WOXs蛋白系统发育树
Figure 3. WOX proteins phylogenetic trees of E. ulmoides, A. thaliana, P. trichocar, O. sativa and Z. mays
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利用GSDS软件构建EuWOXs基因内含子-外显子结构图，结果如图4显示：EuWOXs含有1~3个内含子，EuWOX13-2、EuWOX2和EuWOX5基因含有2个外显子，EuWOX11、EuWOX13-1、EuWOX4-1和EuWOX4-2含有3个外显子，EuWOX1含有4个外显子。不同进化分支基因结构差异显著，同一分支基因结构也存在差异。属于中间进化支的EuWOX11含有3个外显子，同属远古进化支的EuWOX13-1和EuWOX13-2分别含有3个和2个外显子，在WUS中，EuWOX2和EuWOX5含有2个外显子，EuWOX4-1和EuWOX4-2含有3个外显子，而EuWOX1含有4个外显子。
图 4 杜仲WOX家族基因的结构分析
Figure 4. Structural analysis of WOX gene family in E. ulmoides
蛋白质保守基序分析显示：EuWOXs含有10个保守基序，分别命名为Motif 1~Motif 10 (图5)，其中Motif 1和Motif 2最为保守，是WOX的核心基序，存在于所有EuWOXs中。Motif 6较为保守，存在于4个EuWOXs蛋白质(EuWOX4-2、EuWOX2、EuWOX1和EuWOX5)中。相同分支EuWOXs含有相似的保守基序，不同分支EuWOXs基序之间存在显著差异，Motif 4~Motif 10只存在于现代进化分支，Motif 3只在EuWOX13-1和EuWOX13-2蛋白质中存在。
图 5 杜仲WOX基因家族保守基序分析
Figure 5. Conserved motifs analysis of E. ulmoides WOX gene family
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顺式作用元件分析结果(图6)显示：EuWOXs启动子中主要包括脱落酸(ABRE)和水杨酸反应元件(TCA-element)、厌氧响应元件(ARE)、光响应元件(Box 4)及玉米蛋白代谢调节元件(O2-site)。所有顺式作用元件中光响应元件最多，达77个，其中Box 4元件有26个，所占比例是34%；G-box和GT1-motif元件均有9个，占比为12%，表明EuWOXs基因表达可能与光合作用有关。EuWOXs共含有46个激素响应元件，32个胁迫响应元件，其中ABRE和ARE元件数量最多，均含有14个，所占比例分别为31%和44%，暗示EuWOXs参与杜仲激素及胁迫响应。此外EuWOXs共含有12个生长发育调控相关元件，其中O2-site有6个，占50%。
图 6 EuWOXs基因启动子顺式作用元件分析
Figure 6. Cis-element analysis of EuWOX genes promoter
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利用‘秦仲1号’叶片不同发育时期转录组数据对EuWOXs基因的表达模式进行分析。结果(图7)可见：EuWOXs在叶片不同发育时期表达丰度存在显著差异，EuWOX11和EuWOX2在杜仲叶芽、初生叶、幼叶、老叶时期均不表达，EuWOX5仅在叶芽和老叶中低表达，EuWOX13-2在4个时期中的FPKM值均大于20，推测EuWOX13-2参与杜仲叶片的整个发育过程；EuWOX13-1和EuWOX4-1在叶芽中表达丰度最高，随着叶片发育表达水平逐渐降低，表明EuWOX13-1和EuWOX4-1主要在叶芽中发挥作用；EuWOX1在生长叶中表达量相对较高，其余EuWOXs基因表达丰度较低，FPKM值小于5。
图 7 EuWOXs在杜仲叶片不同发育阶段的表达模式
Figure 7. Expression patterns of EuWOXs at different developmental stages in E. ulmoides leaves
利用RT-qPCR检测EuWOXs在‘紫叶’杜仲叶片不同发育阶段(叶芽、生长叶、幼叶)的表达水平。结果(图8)可见：EuWOX1、EuWOX2、EuWOX4-1、EuWOX5和EuWOX13-2在生长叶中表达量最高，随着叶片发育表达水平呈先升高后降低趋势，EuWOX4-2在幼叶中表达量最高，EuWOX13-1在叶芽中表达量最高，随着叶片发育，表达量逐渐降低，暗示EuWOX13-1在叶片发育的起始阶段发挥重要作用。EuWOX1、EuWOX13-1和EuWOX13-2在‘紫叶’杜仲叶片中的表达趋势与‘秦仲1号’一致。
图 8 杜仲EuWOXs基因在杜仲叶片不同发育时期的表达模式
Figure 8. Expression pattern of EuWOX genes in E. ulmoides leaves at different developmental stages
利用‘秦仲2号’和‘小叶’杜仲成熟叶片转录组数据检测EuWOXs的表达模式。由如图9可见：大部分EuWOXs转录水平较低，其中有6个EuWOXs基因几乎不表达，EuWOX13-2表达水平最高，FPKM值＞40，不同胶含量样品之间无显著差异，推测EuWOXs在杜仲胶形成过程中发挥作用较小。
图 9 EuWOXs在杜仲胶形成中的表达模式
Figure 9. Expression patterns of EuWOX genes in the form of Eu-rubber
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植物WOXs蛋白由多基因家族编码，蛋白质之间可能存在相互作用。利用STRING数据库，构建EuWOXs蛋白相互作用网络。图10显示：该网络包含21个节点(互作蛋白)和82条边(相互作用组合)。EuWOX4-1可与20个蛋白质互作，其中包含干细胞分化抑制因子(CLE41和CLE44)，细胞增殖和愈伤组织形成蛋白(CLV1、CLV3和ACT7)，胚胎发育相关蛋白(TPL、BBM和APM1)，维管组织发育蛋白(PXY、HB-8、ATHB-15、MOL和RUL1)，细胞程序化死亡调控因子(LOL1)，参与DNA的复制和延伸(MCM1、POLD2)以及信号转导蛋白(F14K14)，花药发育关键调控因子(RPK2)，参与DNA的复制植物发育相关转录因子GRAS(HAM3和SCL27)等，推测EuWOXs全面参与了杜仲的生长发育。
图 10 EuWOXs蛋白互作网络预测
Figure 10. Prediction of interaction network between EuWOX proteins
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WOX蛋白是植物特有的高度保守的一类转录因子，广泛参与植物的生长发育、干细胞维持、组织器官发生和形成等多种生物学过程。到目前为止，WOX家族基因已在多个物种进行了研究报道，如拟南芥中含有15个、毛果杨18个、水稻中有13个、玉米中有20个、毛竹Phyllostachys edulis 中存在27个[29]，小麦中有26个[30]、茶树Camellia sinensis中包含18个[31]，黄瓜Cucumis sativus中有11个[3]，陆地棉Gossypium hirsutum中含有38个[32]。小麦(17 Gb)[33]、玉米(2 300 Mb)[34]和毛竹(2 021 Mb)[35]基因组大于杜仲(1.2 Gb)[36]，拟南芥(164 Mb)[37]、水稻(441 Mb) [38]和毛果杨(392.3 Mb)[39]基因组小于杜仲。杜仲WOX数量低于拟南芥、毛果杨、水稻、玉米、小麦和毛竹，表明WOXs基因的丰富程度与基因组大小无关，这可能与基因重复有关。
杜仲基因组中共鉴定出8个EuWOXs，分布在8条染色体上。EuWOXs均为核定位蛋白，在现代进化支(WUS)、中间进化支和远古进化支分别含有5、1和2个成员，其系统发育模式与拟南芥、水稻、陆地棉等类似[29，31-32]。EuWOXs基因启动子中含有多种生长发育、激素响应、非生物胁迫以及光周期响应元件。在水稻中，WUS的OsWOX5和中间进化支的OsWOX11、OsWOX12A和OsWOX12B基因表达受生长素、细胞分裂素和赤霉素调节，超表达OsWOX11可提高水稻抗旱性[16-17]。细胞分裂素强烈促进苹果Malus pumila WOX1和WOX3基因表达，生长素诱导黄瓜CsWOX1b和CsWOX3基因表达[3]。在拟南芥中，生长素反应因子5 (AUXIN RESPONSE FACTOR，ARF5)上调AtWOX1和PRS (AtWOX3)基因的表达，ARF2、ARF3和ARF4抑制AtWOX1和PRS的表达[40]。OsWOX3A参与水稻器官发育、叶片横向轴伸长、颖花外稃形态发生以及分蘖和侧根发育[10]，MtWOX1的同源基因STENOFOLIA是蒺藜苜蓿Medicago truncatula叶片生长和维管组织形成的必须基因[41]，PttWOX4在杨树形成层中特异表达，PttWOX4a/b RNAi干扰后导致维管形成层宽度缩小，次生生长减弱[42]。推测EuWOXs可能在杜仲生长发育、激素和胁迫响应等生物学过程中发挥重要作用。
WOX家族基因参与叶片发育。属于中间支的AtWOX9/STIMPY过表达导致拟南芥叶缘波浪化[43]，SlLAM1主要在番茄Solanum lycopersicum叶片、花和果实中表达，SlLAM1缺失导致叶片变窄，次生小叶数量减少[44]，超表达黄瓜CsWOX9导致转基因拟南芥角果变短，莲座叶和分枝数目增加[3]。来源于WUS的AtWOX3是拟南芥侧托叶发育的必需基因，Atwox1和Atwox3缺失突变体导致叶片和花器官变窄，影响叶片横向扩张和花瓣融合[45-46]；GhWOX9_At，GhWUSa_At和GhWUSb_Dt主要在棉花幼叶中高量表达[47]。远古进化分支中的OsWOX13在水稻叶、茎、根维管组织中表现为空间表达调控，在花和发育中的种子中是时间表达调控[48]。在杜仲中，EuWOX13-1在叶芽中表达量最高，随着叶片发育，转录水平逐渐降低，暗示EuWOX13-1主要在杜仲叶片发育的早期阶段发挥作用。EuWOX13-2在生长叶中表达量较高，在叶片发育过程中呈现先升高后降低的趋势。EuWOX13-1和EuWOX13-2是一对重复基因，其表达水平的差异可能与基因结构不同有关，也可能是EuWOX13-1和EuWOX13-2在重复后发生了功能分化。在甘蓝型油菜Brassica napus中，BnCWOX13a与BnCWOX13c互为同源基因，然而它们的表达趋势完全不同[49]，在拟南芥中，AtWOX13在初生根、侧根、雌蕊和胚发育中动态表达，而AtWOX13的直系同源基因AtWOX14只在侧根形成的早期阶段和发育的花药中特异表达[50]，由此推测EuWOX13-2可能只获得了EuWOX13-1基因的部分功能，具体功能还需要进一步研究。
Identification of WOX gene family and their expression in the leaf development of Eucommia ulmoides
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摘要:
目的 Wuschel (WUS)相关的同源异型盒(Wuschel-related homeobox，WOX)转录因子家族在植物生长发育中发挥重要作用。本研究旨在探索WOX转录因子在杜仲Eucommia ulmoides中的分布及表达特征。 方法 以杜仲基因组数据库为基础，利用生物信息学方法对杜仲WOX家族进行全基因组鉴定；基于转录组数据分析EuWOXs在叶片发育及杜仲胶形成中的表达特征，通过实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测EuWOXs在‘紫叶’杜仲‘Ziye’叶片不同发育时期的表达模式。 结果 杜仲基因组中共鉴定出8条EuWOXs，分布于8条染色体；EuWOXs蛋白质长度为182~352个氨基酸，理论等电点为5.10~6.47，分子量为20.7~40.4 kDa；亚细胞定位预测EuWOXs均定位在细胞核中，均为亲水性蛋白。根据系统进化关系，杜仲WOX家族包括3个亚家族，分别含2、1和5个EuWOXs基因。EuWOXs均含有内含子，并包含多个基序，启动子中富含激素、胁迫和光周期响应元件。大部分EuWOXs在杜仲叶片中表达量较低，EuWOX13-1随叶片发育表达量逐渐降低，EuWOX13-2在生长叶中表达量最高。 结论 杜仲中有8个EuWOXs基因，EuWOX13-1和EuWOX13-2可能在杜仲叶片发育中发挥重要作用。图10表2参50 Abstract:Objective This study is aimed to explore the distribution and expression characteristics of WOX (Wuschel-related homeobox) transcription factors in Eucommia ulmoides as they play an important role in plant growth and development. Method First, bioinformatics method was employed to identify the genome-wide of EuWOX gene family on the basis of E. ulmoides genome database. Then an analysis was conducted of the expression levels of EuWOXs in E. ulmoides leaf development and Eu-rubber formation based on transcriptomic data. At last, the expression patterns of EuWOXs at different developmental stages of E. ulmoides ‘Ziye’ leaves were detected by real-time quantitative PCR (RT-qPCR). Result Eight EuWOXs were identified in E. ulmoides genome, distributing in eight chromosomes and they were composed of 182−352 amino acid residues with their isoelectric points being 5.10−6.47 and molecular weight between 20.7 to 40.4 kDa. According to the subcellular localization prediction, EuWOXs were all hydrophilic proteins and located in the nucleus. EuWOX gene family was divided into three subfamilies, containing two, one and five EuWOX genes respectively. All EuWOX genes had introns, and each EuWOX protein contains multiple motifs. EuWOXs promoters contained multiple hormones, stress and photoperiod response elemens. The expression level of most EuWOXs in E. ulmoides leaves was low and the expression of EuWOX13-1 gradually decreased with leaf development whereas the EuWOX13-2 expression was the highest in growing leaves. Conclusion Of the eight EuWOXs genes in E. ulmoides, EuWOX13-1 and EuWOX13-2 may play important roles in the leaf development of E. ulmoides. [Ch, 10 fig. 2 tab. 50 ref.] -
Key words:
- Eucommia ulmoides /
- WOX gene family /
- bioinformatics analysis /
- gene expression /
- leaf development
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在自然界中，植物易受到各种病原物的侵害，植物与病原物协同进化，形成了一系列复杂的防御体系。组成型抗性和诱导型抗性是植物应对病原菌侵害和植食者取食的2种典型的防御机制，植物通过协调不同防御机制实现其最佳防御效果[1]。角质蜡质是植物表皮中由超长链脂肪酸(VLCFAs)及其衍生物构成的一类次生代谢产物。角质蜡质组成的角质层是植物在长期的生态适应过程中，为抵御恶劣生态环境、生物/非生物胁迫而形成的重要保护屏障，广泛参与植物逆境抵御、病虫害防卫等诸多抗性生理过程，在抗病、抗虫、耐盐、抗旱等方面具有重要的生态学功能[2]。近年来，角质蜡质的研究受到各国研究者的持续关注，取得了诸多新进展[3-4]。本研究以植物组成型、诱导型抗性防御反应为主线，归纳总结目前有关角质蜡质代谢及其抗病作用机制的研究进展，以期为植物抗病机理的阐明及相关病害的防治提供研究思路。
1. 角质蜡质生物合成
1.1 角质层蜡质生物合成
角质层是植物地上部分一层重要的疏水性保护膜，对植物适应复杂多变的环境具有重要意义[5]。最新研究证实：植物根冠和胚胎中也存在角质层结构，其中根冠角质层在植物应对渗透胁迫和侧根形成中发挥了重要作用，而胚胎角质层则在成熟种子中起着扩散屏障以及调控种子萌发的作用[6-7]。角质层结构可分为三部分：第1部分是由嵌入细胞壁多糖的角质以及蜡质组成的角质层基层；第2部分是由角质和镶嵌在角质内部的蜡质共同组成的真角质层；第3部分是由蜡质膜/蜡质晶体沉积在植物表面形成的蜡质层[8]。
角质层由角质和蜡质组成，其中蜡质又分为表层蜡质和内部蜡质。角质层蜡质由超过20个碳原子的超长链脂肪酸(VLCFAs)及其衍生物组成，包括醛、烷烃、支链烷烃、烯烃、伯醇、仲醇、不饱和脂肪醇、酮和蜡酯，以及萜类和甾醇类的环状化合物等[9]。利用正向和反向的遗传学手段对拟南芥Arabidopsis thaliana等模式植物开展研究，目前蜡质的生物合成途径已经基本弄清。对拟南芥中大量蜡质合成缺陷突变体ECERIFERUM(CER)的研究，已经分离鉴定出了一大批涉及蜡质生物合成的蜡质突变体基因(CER)。质体合成的C16、C18脂肪酸是蜡质合成的重要前体物，在长链脂酰辅酶A合成酶(LACS)的作用下以脂酰-COA的形式运输到内质网，通过内质网上的脂肪酸延长酶复合体以及BAHD酰基转移酶CER2及其同系物CER2-LIKE1/ CER26和CER2-LIKE2在内的一些辅助因子的协同作用进行碳链延伸[10]，生成C20以上的超长链脂酰-COA；随后通过烷烃合成途径形成醛、烷烃、次级醇和酮等蜡质组分，或通过内质网的醇合成途径形成初级醇和蜡酯等蜡质组分[11]。拟南芥烷烃合成酶CER1和WAX2/CER3基因突变体，其醛、烷烃、次级醇和酮的含量降低，这与烷烃合成通路的代谢产物一致；而CER1、WAX2/CER3和CYTB5共表达引起来自超长链脂酰-CoA的超长链烷烃的氧化还原依赖性合成，表明其可能编码烷烃合成途径中烷烃的合成[12]。作为拟南芥中编码醛脱羧酶的CER1基因家族成员之一的CER1-like1也通过与CER1相同的机制在烷烃的生物合成中起着至关重要的作用，但CER1-like1更偏向于催化短链烷烃的合成[13]。烷烃合成途径的最终反应被认为是由属于细胞色素P450家族的中链烷烃羟化酶1(MAH1/CYP96A15)催化烷烃氧化产生次级醇，并进一步催化次级醇氧化生成酮类[14]。研究表明：在醇合成途径中，编码脂酰辅酶A还原酶的CER4基因负责地上部分组织表皮细胞和根中初级醇的合成，而编码蜡酯合成酶基因的WSD1基因其拟南芥突变体表现出比野生型更低的蜡酯含量，表明WSD1可能负责蜡酯的合成[15-17]。
1.2 角质层角质生物合成
成熟角质层中还含有角质，角质是一种主要由ω端和中链羟基化的C16和C18的氧化脂肪酸以及甘油以酯键交联而成的聚合物[18]。角质单体的合成在内质网上进行，内质网对质体产生的C16和C18脂肪酸进一步修饰合成各种以单酰基甘油酯形式存在的角质单体。角质单体的合成涉及许多氧化反应，由细胞色素P450酶催化，其中末端碳链氧化反应涉及细胞色素P450末端羟化酶(CYP86A)家族成员，而中链氧化反应涉及细胞色素P450中链羟化酶(CYP77A)家族成员。拟南芥CYP86A2、CYP86A4、CYP86A7和CYP86A8突变体表现出角质层结构异常和角质组分改变，表明这几个基因与角质生物合成中ω链的羟基化密切相关[19]。ω-羟基脂肪酸则进一步经过脱氢反应生成脂肪醛，脂肪醛再经氧化反应最终生成二羧酸；虽然催化该过程的酶尚不清楚，但是由于CYP86A2和HTH(hothead)这2个基因的拟南芥突变体中缺少二羧酸，因此认为其可能涉及ω-OH脂肪酸氧化生成二羧酸的反应[20-21]。CYP77A6是目前唯一被鉴定为能够进行中链羟化的酶，CYP77A基因在花瓣中强烈表达，但在其拟南芥突变体的花瓣中却完全丢失了二羟基角质单体；其异源表达结果表明：该基因特异性催化ω-OH脂肪酸的中链羟基化，这也表明角质合成的中链羟基化反应发生在末端羟基化之后[22]。此外，CYP77A4异源表达催化环氧化羟基脂肪酸的合成，表明其可能参与环氧化脂肪酸的合成，但目前尚未完全证实。角质单体合成的最终反应由甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)催化完成，脂酰-COA在甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)催化下，酰基转移至甘油-3-磷酸生产单酰基甘油角质单体。拟南芥GPAT1-8基因被报道在细胞外脂质聚酯的合成中起着重要作用，其中GPAT4-8已经被证明有助于角质的合成，并且这几种酶相较于未被取代的脂肪酸表现出对末端羟基或羧基脂肪酸具有更强的催化效率，表明他们在氧化反应之后发挥作用[23]。
质膜ATP结合盒转运蛋白(ABCG)已经被证明可能与角质和蜡质向质外体的转运有关；而脂质转移蛋白(LTPs)被证明很可能有助于角质单体通过细胞壁向角质层的转运[24]。随着番茄Solanum lycopersicum中CD1/GDSL1这第1个角质合酶的发现，长久以来存疑的脂肪酶(GDSL)家族的酶在角质组装中的作用也得到了确证[25-27]，而拟南芥α/β水解酶蛋白基因BODYGUARD (BDG)的发现证明了植物中可能存在一些其他的角质合酶[28]。尽管目前的研究已经在角质蜡质的合成、运输、组装方面取得了一定的进展，但角质层的形成机制仍然未知。
2. 植物的抗病类型
2.1 组成型抗性
组成型抗性是植物的固有特性，是植物在遭受侵害前就己存在的抗性，包含植物固有的层和细胞壁的角质、蜡质、木质素等成分。其中，化学抗性主要包括酚类、皂苷、不饱和内酯及有机硫化合物等植保素(phytoalexins)[29]。组成型抗性是植物在长期的系统发育中产生和发展起来的[30]，由植物基因型决定，但其抗性强弱也会受到环境因素的影响。
2.2 诱导型抗性
诱导型抗性是指植物经病原物刺激后诱导产生的抗性成分或抗性反应，包括物理抗性和化学抗性2类。物理抗性包括细胞壁及角质层加固和修复、乳突的形成、木质化作用及侵填体的形成等[31]。化学抗性则包括过敏性反应的诱导、植保素的产生、水解酶的激活及病程相关蛋白的表达等。诱导型抗性类似于免疫反应，只有在遇到外界因子，如物理损伤、植食者取食和病原菌侵染时才得以表现[32]。因此，诱导型抗性具有“开-关效应”，也称作“兼性抗性”。物理抗性与化学抗性通常协同发挥作用，一些物理屏障和化学因子不仅属于组成型抗性，也会在诱导型抗性中起重要作用，典型的如角质蜡质。
诱导型抗性并非植物的原始性状，而是一种衍生性状。植物长期处于复杂的环境中，容易受到各种病原物的侵害，组成型抗性是一种被动的防御机制，并不能确保植物对病原物的完全防御。为了更好地抵御病原菌的入侵，植物进化出了一系列诱导防御反应，植物的这种抵抗外界病原物刺激所形成的防御反应又被称为植物的先天免疫。植物先天免疫由微生物、病原体和/或损伤相关的分子模式(分别为MAMP，PAMP和/或DAMP)识别相应的化学分子所触发[33]，这些化学分子在植物与微生物相互作用过程中释放，并被模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)识别。
植物的先天免疫包括两大类，病原物相关分子模式触发型免疫(PAMP-triggered immunity，PTI)和效应因子触发型免疫(effector-triggered immunity，ETI)[34]。植物-病原体互作中植物启动先天免疫的第1步是植物模式识别受体(PRRs)识别病原相关分子模式(PAMPs)的化学分子，引发病原相关分子模式触发的免疫反应(PTI)，激活植物体中促丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，从而使植物产生早期应答反应[35]。然而，病原体为了抑制植物的诱导型防御反应便于自身的入侵反应，往往会产生大量抑制PTI激活的效应因子，而植物此时会启动先天免疫的第2步反应，通过特异性的抗性蛋白(R蛋白)识别效应因子，在侵染位点启动快速剧烈的防御反应，这种防御反应即为ETI[36]。ETI诱导的抗性通常表现为入侵位点的细胞凋亡，即过敏反应[37]。
MAMPs/PAMPs或DAMPs都可以诱导PTI[38]，并且相较于特异性的ETI具有更加广谱的抗性反应，如活性氧(ROS)积累，激活MAPK依赖性信号级联反应，植物抗毒素的生物合成，水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)等防御相关激素以及相关抗性基因的诱导表达[33, 39]。植物的这2种免疫反应机制通过启动防御反应诱导植物产生局部和系统抗性，两者协同作用进而抵御病原菌的入侵[40]。植物在侵染位点启动超敏反应特异性抵御病原菌侵染的这种反应被称为植物的局部抗性，而与之相对的，植物活化抗性基因使植物在整株水平上产生抗性或者产生抵御病原菌再次入侵的抗性，这种非专化性的抗性则被称为系统抗性[41]。通常植物的系统抗性包括诱导系统抗性(ISR)和获得性系统抗性(SAR)，ISR主要由非致病菌诱导产生，而SAR则是由植物响应病原菌侵染产生的[42]。这2种系统抗性依赖于SA，JA和ET信号途径的协同效应。SA和JA作为植物中十分重要的2条信号途径，在抗病化学信号的转导中的作用尤为重要。现在也有越来越多的证据表明，角质和蜡质在植物的诱导防御反应中也扮演着重要的角色[43]。
3. 角质蜡质在植物-病原互作中的作用
3.1 角质蜡质的组成型抗性
角质蜡质组成的角质层作为植物地上部分共有的一层保护性屏障，在植物组成型抗性中扮演着重要角色。角质蜡质组成型抗性作用也可分为物理抗性和化学抗性2类[44]。角质层及其组分角质蜡质维持着植物正常生长必需的机械强度，与植物对真菌的物理抗性密切相关；许多真菌需要通过附着胞的物理穿刺刺破植物角质层进而侵染内部细胞[45]，因此，完整的具有一定机械强度的角质层会阻碍真菌对植物的侵染，如许多果腐病病原体只能通过角质层缺陷的方式侵染果实[46]。
植物角质蜡质组成对病原菌的物理抗性，不仅影响植物表皮机械强度，还会影响植物表面的疏水性(不渗透性)[44]。真菌孢子的萌发和细菌的繁殖需要高湿环境，疏水的角质层表面则不利于病原菌的停滞，能有效减少病原菌的侵染[47]。拟南芥和番茄角质蜡质合成缺陷的突变体具有强渗透性的角质层，表现出病原体感染的易感性。如拟南芥酰基载体蛋白4(ACP4)和GL1(GLABROUS 1)突变体的角质蜡质含量更低，增加了其表皮渗透性，叶片则表现出对2种病原体的高易感性[48-49]。研究表明：角质蜡质相关SHINE转录因子的突变导致角质层缺陷，进而导致了对灰霉病菌Botrytis cinerea易感性[50]。这些结果也进一步验证了角质蜡质代谢可通过调控角质层的渗透性进而影响植物的抗病性。
此外，角质蜡质组分也具有化学抗性功能。角质蜡质的某些组分可以抑制或者刺激孢子的萌发，如去蜡质处理的大麦Hordeum vulgare叶片有更多的附着胞生成，增加了其对锈菌的敏感性[51]；水稻Oryza sativa叶片角质组分十六烷二醇，可以诱导稻瘟菌Pyricularia oryzae的产生和附着胞的分化形成，并促进灰霉病真菌孢子的萌发和角质酶的表达[52-53]。此外，角质和蜡质的某些组分对某些病原体还具有直接的抑制作用，如C16和C18羟基脂肪酸对丁香假单胞菌Pseudomonas syringae有直接的抑制作用[54]，这些角质蜡质成分对病原菌的抑制作用构成了角质蜡质组成型抗性中的化学抗性。
综上所述，角质蜡质一方面能够通过影响角质层的物理性质(机械强度和疏水性)，实现对病原菌的物理屏蔽作用；另一方面也能通过羟基脂肪酸等抑菌成分直接调控病原菌的增殖分化来实现其化学防御功能。
3.2 角质蜡质的诱导型抗性
传统观点认为，角质层及其角质蜡质组分主要通过组成型抗性发挥其保护性屏障功能。现在更多研究证实：角质蜡质在植物的诱导防御反应中也发挥着重要作用[55]。与组成型抗性类似，角质蜡质的诱导型抗性也可分为物理抗性和化学抗性2类。在病原菌侵染植物的过程中，角质蜡质组分均会对病原菌的刺激作出响应。角质蜡质诱导型物理抗性功能的发挥，一般是响应病原菌的刺激，上调角质蜡质的合成，增强角质层的保护性屏障作用。如受到炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides感染的番茄果实，其角质蜡质的生物合成会显著上调[56]。柑橘Citrus sinensis花瓣感染炭疽病后，其表皮细胞脂质合成上调，角质蜡质相关代谢物沉积，并引起角质层结构的改变进而增强其物理抗性[57]。此外，大麦感染由禾谷镰刀菌Fusarium graminearum引起的赤霉病后，抗性品种小穗会上调角质层的生物合成进而增强其对病原菌的物理抗性[58]。上述这些都表明角质蜡质在植物的诱导防御反应中发挥了重要的物理屏障作用。
角质蜡质也可作为诱导型抗性成分在病原菌侵染过程中发挥化学抗性功能。病原体侵染植物后，植物产生的降解产物和释放的内生肽可作为植物损伤相关分子模式的诱导子(DAMPs)被植物模式识别受体(PRRs)所识别，继而启动下游的免疫反应(PTI)[33]。目前的研究表明：角质层被真菌角质酶降解的产物也可作为DAMPs被损伤相关模式的受体所识别[17, 59]。由此认为角质蜡质可以通过作为诱导子激活下游的诱导防御反应进而实现其化学抗性的功能(图1)。这一观点也得到了许多外施角质单体研究结果的支持，如外施无抑菌活性的角质单体增加了大麦对白粉病菌Erysiphe graminis f.sp. hordei的抗性[60]；组织培养的马铃薯Solanum tuberosum细胞外施角质单体后乙烯的合成积累和相关防御基因的表达均上调[61]；外源施加角质单体增加了番茄病程相关基因的表达水平[62]；水稻叶片外源施加角质单体16-羟基棕榈酸，脂质转运蛋白基因OsLTP5和病程相关基因PR-10的表达也上调[63]。这些都在一定程度上表明角质蜡质可能是通过调控下游抗性基因的表达进而实现其化学抗性(图1)。
进一步的研究表明：除了作为诱导子调控下游抗性相关基因，某些角质蜡质组分也可以作为活性氧的诱导子诱导活性氧的积累。如黄瓜Cucumis sativus下胚轴外施角质蜡质组分的研究表明：某些角质蜡质成分具有良好的活性氧诱导活性[64-65]，而活性氧介导了植物包括超敏反应在内的一系列防御反应。基于这些研究，目前也有一些观点认为：角质蜡质可能通过作为活性氧的诱导子来激活下游的诱导防御反应进而实现其抗性功能[43,66]。除此之外，角质蜡质被认为可能作为信号分子影响植物的系统获得性抗性(SAR)[67]。基于上述研究，可得出角质蜡质作为诱导子激活下游的诱导防御反应时，可能主要是通过调控病原物相关分子模式触发型免疫(PTI)中的包括活性氧爆发，抗病基因表达，系统获得性抗性在内的一系列的抗性反应进而实现其抗性功能(图1)。
大量研究证实：激素信号在植物-病原体互作中发挥了重要作用[68]；激素作为重要的抗病信号可能涉及了植物角质蜡质介导的抗性反应。某些激素被证明可以调控角质蜡质的合成和相关抗性，如JA处理豌豆Vicia sativa幼苗，诱导其角质单体羟基脂肪酸的合成[69]，而羟基脂肪酸作为植物的内源信号分子发挥了重要的抗性作用，这表明JA可以调控角质的生物合成进而介导其抗病性。JA和角质蜡质同属于脂肪酸代谢通路，具有共同的合成前体，因此，也有观点认为JA不仅能够直接调控角质蜡质的生物合成介导其抗病性，还和角质蜡质存在着代谢流的重定向；基于角质蜡质生物合成缺陷突变体的研究也在一定程度上支持了这一观点。如拟南芥突变体RST1角质蜡质生物合成缺陷，JA及其相关抗病基因PDF1.2上调表达，表现出对白粉病的抗性[70]；柑橘自发突变体蜡质合成缺陷，JA和相关抗病基因PDF1.2上调表达，增加了对病原菌的抗性[71]。这些结果均表明：JA和角质蜡质之间可以通过代谢流的重定向进而调控植物的抗病性(图1)。
4. 结论与展望
角质层作为植物抵御病原菌侵染的第1道防线，在植物-病原互作中具有重要作用。角质蜡质是角质层主要成分，一方面可以作为组成型抗性成分发挥物理抗性(物理屏障)和化学抗性(抑菌)作用；另一方面，也可作为诱导型抗性成分发挥作用，诱导产生的角质蜡质组分可作为信号分子或者诱导子激活下游的抗性反应进而发挥其化学抗性功能。目前，角质蜡质介导的诱导抗性研究受到广泛关注，但其作用机理尚未完全阐明；哪些角质蜡质组分参与了植物的诱导型防御反应，其作为诱导子激活下游抗性反应的具体机制如何？激素信号介导的角质蜡质抗性机制如何？诸多问题均有待深入探讨，角质蜡质抗性机理的阐释为作物抗性育种提供了新的思路。此外，虽然已有相关研究表明角质蜡质具有抑菌活性和植物免疫反应诱导子的作用，但目前尚无角质蜡质类生物农药(植物免疫诱导剂)的报道。因此，角质蜡质作为生物农药(植物免疫诱导剂)具有广阔的开发前景，同时角质蜡质类生物农药(植物免疫诱导剂)的开发也将为病害防控提供新的思路。
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图 2 拟南芥和杜仲WOXs的蛋白质同源结构域序列分析
Figure 2 Sequence analysis of WOX proteins homeo domain in A. thaliana and E. ulmoides
图 3 杜仲、拟南芥、毛果杨、水稻和玉米WOXs蛋白系统发育树
Figure 3 WOX proteins phylogenetic trees of E. ulmoides, A. thaliana, P. trichocar, O. sativa and Z. mays
图 7 EuWOXs在杜仲叶片不同发育阶段的表达模式
Figure 7 Expression patterns of EuWOXs at different developmental stages in E. ulmoides leaves
图 8 杜仲EuWOXs基因在杜仲叶片不同发育时期的表达模式
Figure 8 Expression pattern of EuWOX genes in E. ulmoides leaves at different developmental stages
图 9 EuWOXs在杜仲胶形成中的表达模式
Figure 9 Expression patterns of EuWOX genes in the form of Eu-rubber
图 10 EuWOXs蛋白互作网络预测
Figure 10 Prediction of interaction network between EuWOX proteins
表 1 引物序列
Table 1. Primer sequences
基因名 上游引物(5′→3′) 下游引物(5′→3′) EuWOX1 ATGGTGGGTGACCAGCTTAG TTCTCTGGCCTTGTGGTTCT EuWOX2 ACCGTACCCCAACCTACTCC ACTTCCCGTTGGATGAAGTG EuWOX4-1 GGAACCCTACGCAAGAACAG GCGCTTCTGCTTTTGTCTCT EuWOX4-2 TAGAGCAGATCACGGCACAG CTAGGGTCGGATGTTGGAGA EuWOX5 GACGGAGCAAGTGAGAGTCC TCTCCCGTGCCTTATGATTC EuWOX11 ACTCGAGTTTTGTGGCCTGT AATTGGAGGCATCTGGATTG EuWOX13-1 GGTCTGAGGGCATGTGTTTT TTGGAGATATGGGTGGTGGT EuWOX13-2 GGGTTGTTCGTCAAGGTCAT GTTGGAATCCACCGTTGTCT UBCE2 AGTGGGTGGTGCTGTAGTCC AACTCCCGTTTCGTTTGTTG 
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表 2 EuWOXs蛋白质序列特征及亚细胞定位
Table 2. Sequence characteristics and subcellular location of E. ulmoides WOX proteins
基因号 基因名 拟南芥
同源基因染色体 位置 CDS长度/
bp氨基酸数/
个分子量/
kDa等电点 亚细胞
定位EUC13591-RA EuWOX1 AT3G18010.1 Super-Scaffold_235 3540694-3544292 1059 352 40.36 5.78 细胞核 EUC12552-RA EuWOX2 AT5G59340.1 Scaffold912_obj 156744-159059 810 269 30.16 8.11 细胞核 EUC15721-RA EuWOX4-1 AT1G46480.1 Super-Scaffold_242 604979-606289 618 205 23.48 9.04 细胞核 EUC21176-RA EuWOX4-2 AT1G46480.1 Scaffold272_obj 37477-39280 642 213 24.31 8.82 细胞核 EUC18832-RA EuWOX5 AT3G11260.1 Super-Scaffold_117 336319-340482 549 182 20.70 6.92 细胞核 EUC00362-RA EuWOX11 AT3G03660.1 Super-Scaffold_154 68808-70507 765 254 27.67 5.62 细胞核 EUC00756-RA EuWOX13-1 AT4G35550.1 Super-Scaffold_233 319468-325733 810 269 30.42 6.22 细胞核 EUC02503-RA EuWOX13-2 AT4G35550.1 Super-Scaffold_71 6332599-6364092 576 191 22.11 6.54 细胞核
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