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开花是植物生命周期中的重要发育阶段，受自身遗传和外界环境因素的影响[1]。FCA（FLOWERING LOCUS CA）参与拟南芥Arabidopsis thaliana开花调控，通过多腺苷酸化（polyadenylation）和介导FLC（FLOWERING LOCUS C）染色质的组蛋白去甲基化（demethylation）调控开花[2-4]。拟南芥的fca突变后会抑制开花促进因子FT（FLOWERING LOCUS T）和SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS）的表达，fca突变体在不同光周期下均表现出晚花表型[5]。另外，FCA可以激活LFY（LEAFY）和AP1（APETALA1）的活性促进拟南芥开花[6]。将水稻Oryza sativa和巴西橡胶树Hevea brasiliensis的FCA基因转入拟南芥fca突变体，会导致晚花性状出现逆转和恢复[7-8]。由此可见，FCA在植物花期调控方面发挥着重要作用。环境温度影响植物开花时间。植物FCA基因是温敏途径（thermosensory pathway）中的重要基因，可响应温度变化调控植物的花芽分化[9]。与16 ℃相比，23 ℃可促进拟南芥FCA的转录，使FCA蛋白水平升高，fca突变体对温度不敏感[10]。FCA通过诱导FT表达在高温下促进拟南芥开花[11]。与1年生拟南芥相比，一些多年生植物对温度变化的反应及其对开花的影响表现出多样性。例如，在多年生拟南芥的1个祖先近源种Boechera stricta中，与18 ℃相比，25 ℃处理下开花延迟[12]；同样，在菊花Chrysanthemum morifolium中，也发现夏季温度升高能延迟菊花开花[13]。目前，对环境温度调控其开花的机理主要集中于模式植物中，木本植物种类繁多，且开花差异很大，关于木本植物中如何响应环境温度变化调控开花的机理仍不清楚。本研究通过对桂花Osmanthus fragrans OfFCA基因的同源克隆和定量聚合酶链式反应（PCR），分析OfFCA在不同温度下桂花不同花芽分化时期不同组织中的表达情况，初步探究OfFCA参与桂花花芽分化的调控作用，为桂花的花期调控、遗传改良以及新品种培育提供一定理论基础。
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从浙江农林大学桂花种质资源圃中，选取株龄相同且生长一致的桂花‘堰虹桂’O. fragtans‘Yanhonggui’，分别于19和25 ℃处理。当处理0、10、20、30、40、50和60 d时，分别采集‘堰虹桂’的叶和花芽，一部分进行显微解剖结构观察；另一部分液氮处理后-80 ℃冻存，用于基因克隆和定量PCR分析。
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石蜡切片制作参照刘涛等[14]的方法。主要步骤包括：①固定。采用体积比为18:1:1的700 mL·L-1乙醇、冰乙酸和甲醛将不同时期桂花的样品固定24 h以上。②切片。将经过脱水、透明、渗蜡、包埋等处理材料进行切片，厚度约12 μm。③染色及观察。固绿染色后用中性树脂封片，风干后，于显微镜（Axio Imager 2，日本）下观察。
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取花芽分化时期约0.5 g的花芽或叶片，按照RNAprep pure Plant Kit试剂盒说明书提取RNA，RNase-free DNase Ⅰ（Takara）去除DNA。cDNA反转录参照Reverse Transcriptase M-MLV（Takara，大连）说明书，产物储存于-20 ℃备用。
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通过前期转录组获得的FCA基因Unigene片段设计特异性引物（FCA-F：GCTATTCGTTGGAGGAGTT；FCA-R：GTTGTCTTGCGTAGTTGTC），以反转录的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系如下：上下游定量引物（10 μmol·L-1）各1 μL，cDNA 1 μL，2×SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）10 μL和双蒸水7 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；35次循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存备用。PCR反应产物经10 mg·g-1琼脂糖凝胶电泳检测后回收，纯化，连接到pMD18-T载体，转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，经PCR鉴定后送上海生工生物科技公司测序。
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将克隆得到的OfFCA基因用DNAMAN软件进行多重比对序列，使用MEGA 7.0软件Neighbor-Joining法构建系统发育树；利用MultiLoc 2软件（http://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/MultiLoc2）进行亚细胞定位预测；在线工具TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析OfFCA蛋白跨膜结构域、信号肽预测；利用ExPASy工具中的SOPMA软件预测蛋白质二级结构，用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）对三级结构进行预测。
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设计OfFCA荧光定量引物，送上海生工生物科技公司合成。荧光定量PCR反应体系为：SYBR Premix Ex TaqⅡ 10.0 μL，上下游定量引物（OfFCA-F：AGCATGTGTGTCCTGATGGA；OfFCA-R：GCTTATGATGCACCGGTTGT）各0.8 μL（10 μmol·L-1），cDNA 2.0 μL，双蒸水补齐至20.0 μL。反应程序如下：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。3次生物学重复。采用2-△△CT法[15]计算OfFCA的相对表达量。
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同源克隆获得桂花OfFCA基因cDNA序列，长度为1 319 bp（图 1），开放阅读框为864 bp，编码287个氨基酸，基因登录号为MK737873。通过DNAMAN软件比对发现：OfFCA与旋花科Convolvulaceae矮牵牛Ipomoea nil的IpFCA-like、茄科Solanaceae马铃薯Solanum tuberosum的SoFCA-like、胡麻科Pedaliaceae芝麻Sesamum indicum的SeFCA-like及玄参科Scrophulariaceae沟酸浆Erythranthe guttata的EryFCA和烟草Nicotiana attenuata的NiFCA-like较为相似，其氨基酸序相似度分别为76%、69%、68%、68%和68%（图 2）。
图 1 桂花OfFCA PCR电泳图
Figure 1. Electrophoretogram of OfFCA gene
图 2 OfFCA与其他物种同源蛋白氨基酸序列比对
Figure 2. Comparative analysis of OfFCA protein sequence
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ExPASy软件结构域预测发现：OfFCA蛋白具有典型的RRM基序和WW结构域（图 2），其相对分子质量为70.6 kD，理论等电点值为5.12。OfFCA蛋白不存在信号肽，亚细胞定位预测显示：OfFCA蛋白定位于细胞质。蛋白结构三级如图 3所示。亲水性指数（GRAVY）为-0.565，表明OfFCA具有较好的亲水性。
图 3 桂花OfFCA蛋白三级结构预测
Figure 3. Tertiary structure prediction for OfFCA protein
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用MEGA7.0构建‘堰虹桂’与其他物种FCA之间的系统发育树（图 4）。结果显示：OfFCA与木犀科Oleaceae油橄榄Olea europaea的OlFCA和胡麻科芝麻的SeFCA具有较近的亲缘关系。
图 4 桂花OfFCA系统进化树
Figure 4. Phylogenetic tree based on OfFCA gene
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通过对不同温度下‘堰虹桂’不同花芽分化时期的石蜡切片发现：19 ℃处理约20 d后，‘堰虹桂’进入花序分化期，约30 d后进入小花分化期，40 d左右进入花萼和花瓣分化期，50 d后进入雄蕊分化期和雌蕊退化分化期。但在25 ℃处理下，‘堰虹桂’在30 d左右进入花序原基分化期且一直处于该时期（图 5），花芽分化进程显著延迟。以上现象说明低温19 ℃能够显著促进‘堰虹桂’的花芽分化进程，从而促进开花时间提前。
图 5 不同温度处理下‘堰虹桂’花芽分化进程
Figure 5. Flower bud differentiation period of Osmanthus fragrans'Y anhonggui' under different temperature treatments
FCA基因是植物响应温度变化调控植物开花的重要基因，对桂花OfFCA基因进行定量表达检测发现：无论是在叶还是花芽组织中，OfFCA基因在19 ℃的表达均显著高于25 ℃（图 6），这说明OfFCA基因可响应相对低温19 ℃的变化，参与调控‘堰虹桂’的花芽分化。
图 6 OfFCA基因在‘堰虹桂’叶和花芽中的表达变化
Figure 6. Expression pattern of OfFCA in leaf and flower bud at different temperatures
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环境温度不同于春化作用和冷胁迫，一般处于该物种生理学和非胁迫温度之间，广泛影响植物的生长发育。不同物种对环境温度的响应具有很大差异，例如，在低温条件下，拟南芥和水稻的开花时间均延迟[16-17]，但是在朵丽蝶兰Doritaenopsis hybrid的研究中，低温能够诱导其成花转变，促进生理生化变化及花芽分化[18]。同时在烟草的研究中，低温也是促使烟草提前进入花期的重要因素之一[19]。本研究发现：与正常生长温度25 ℃相比，相对低温19 ℃显著促进‘堰虹桂’花芽分化进程，使开花时间提前（图 5）。目前，FCA同源基因在拟南芥等多个物种中已克隆得到，但是至今仍没有桂花OfFCA基因的相关报道。本研究从桂花秋桂品种‘堰虹桂’中分离得到1 319 bp的OfFCA基因（图 1），其开放阅读框为864 bp，编码287个氨基酸，基因登录号为MK737873。与其他物种FCA同源基因类似，OfFCA具有典型的RRM基序和WW结构域，与矮牵牛IpFCA-like的同源性最高（76%），且与其他物种包括马铃薯、芝麻、沟酸浆以及烟草的同源性均高达68%以上（图 2）。另外，OfFCA基因与木犀科油橄榄OeFCA和胡麻科芝麻SiFCA关系最近（图 4）。
环境温度对植物的花芽分化和开花具有重要的影响，其调控机制也存在很大的差异。FCA受转录和转录后调控，在拟南芥中，与16 ℃相比，23 ℃时FCA转录和蛋白质水平升高，进而促使成花转变使花期提前[20]。但在木本植物三叶橙Poncirus trifoliata中，与23 ℃相比，PtFCA1在较高的环境温度（27 ℃）显著下调，且35S::PtFCA1回补拟南芥fca-1突变体花期显著提前[21]。在桂花中发现，无论在叶和花芽中，19 ℃条件下OfFCA基因的表达均显著高于25 ℃（图 6）。据此可以推测，OfFCA响应环境温度变化参与桂花的花芽分化并使开花时间提前。在拟南芥等模式植物中，FCA通过抑制FLC以及SVP（SHORT VEGETATIVE PHASE）基因调控FT和SOC1的表达来促进花芽分化和开花时间[22]，但是桂花OfFCA基因是否像模式植物一样，通过直接调控FLC和SVP基因的表达进而使FT和SOC1蛋白积累促进开花，还有待更进一步的验证。
目前，关于桂花的开花分子机制的报道比较少[23]。本研究通过对桂花的FCA基因克隆和表达分析，初步探究OfFCA影响环境温度变化调控桂花花芽分化的分子机制，对桂花的花期调控、遗传改良以及新品种培育提供一些理论基础。
Cloning and expression analysis of OfFCA gene at flower bud differentiation stages in Osmanthus fragrans
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摘要:
目的 桂花Osmanthus fragrans是著名的香化植物，其花芽分化受到环境温度影响。研究环境温度对桂花花芽分化的影响对桂花的花期调控具有重要的指导意义。 方法 以桂花品种‘堰虹桂’O.fragrans ‘Yanhonggui’为材料，采用石蜡切片观察其花芽分化进程，运用聚合酶链式反应和实时荧光定量技术对影响温度FCA（FLOWERING LOCUS CA）基因分别进行克隆及表达特异性分析。 结果 克隆得到OfFCA cDNA序列长为1 319 bp，其开放阅读框为864 bp，编码287个氨基酸。序列比对及进化分析发现：OfFCA与木犀科Oleaceae油橄榄Olea europaea和胡麻科Pedaliaceae芝麻Sesamum indicum的FCA相似度较高，同源性可达68%以上。在桂花花芽分化的不同时期，无论叶还是花芽中，19℃环境低温下OfFCA基因的表达水平均显著高于25℃常温生长条件下的表达水平。 结论 桂花OfFCA基因响应环境相对低温的变化，参与桂花的花芽分化，使桂花的花期提前。 Abstract:Objective Sweet osmanthus (Osmanthus fragrans) is widely used in gardening as a fragrant plant. Its flower bud differentiation is significantly affected by ambient temperature. This research aims to find out the working mechanism of ambient temperature on the flower bud differentiation to help regulate flowering period of sweet osmanthus. Method Gene FCA (FLOWERING LOCUS CA) was studied using O. fragrans 'Yanhonggui' as the material, the process of flower bud differentiation was observed by paraffin section, and OfFCA was cloned and expression analysis was made by PCR and real-time PCR. Result The sequence length of OfFCA cDNA obtained by cloning was 1 319 bp, the Open Reading Frame(ORF) length was 864 bp, and 287 amino acids were encoded. Amino acid sequence alignment and evolutionary analysis showed that OfFCA was similar in FCA to Olea europaea, Oleaceae and Sesamum indicum, Pedaliaceae, with a homology of over 68%. The real time PCR demonstrated that the expression of OfFCA gene was higher at the low temperature (19℃) treatment than control temperature (25℃) in both leaves and flower buds at different flower bud differentiation stages. Conclusion Our work lay a foundation for the studying of regulating flowering time of O. fragrans by ambient temperature. -
Key words:
- forest tree breeding /
- Osmanthus fragrans /
- FCA gene /
- flower bud differentiation /
- gene expression
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刺槐Robinia pseudoacacia原产于北美洲的亚热带和温带地区，适应性强、繁殖容易，被广泛引种[1]，已被全球入侵物种数据库定为入侵种[2]。20世纪60年代以后，刺槐被作为黄土高原丘陵沟壑区人工林建设的主要造林树种，成为该地区造林面积最大的树种[1]。刺槐作为一种外来种，生长快、耗水强，在许多立地条件差的地方多形成低产林[3]。晋西黄土区处于干旱半干旱地区，侵蚀强烈，生态环境脆弱[4]，研究黄土区刺槐人工林林下多样性具有重要的实际意义。人工林群落物种多样性主要由林下植被反映，而且林下植被的生长发育，填补了地表空白[5]，对森林的生长繁殖以及森林结构的塑造有重要的影响[6]。从已有的研究中可知，刺槐林下阴坡物种多样性大于阳坡[7]；在相同林龄及立地条件下，刺槐林下林分密度越大，林下植被多样性越低[8]。总之，坡度、坡向、密度、林龄等都会对刺槐林下物种多样性产生一定的影响。因此，对于黄土丘陵区引种刺槐这种外来树种进行水土保持造林，会塑造成怎样的生物群落，能否促进生态系统向稳定、环境良好方向永续恢复，还需要进一步的跟踪和长期定位观测研究。本研究通过对晋西黄土区蔡家川流域长期固定观测样地刺槐人工林林下植被的分析，对比当地主要林地类型油松Pinus tabulaeformis人工林和天然次生林林下植被，揭示刺槐人工林林下结构特征、α多样性、β多样性及相似度等特征，以及与油松人工林和天然次生林存在的差异性，进一步揭示刺槐人工林形成的生物群落对当地水土保持和生态恢复的作用，旨在为晋西黄土区蔡家川流域刺槐人工林植被恢复提供基础数据，并为刺槐人工水土保持林管理提供借鉴。
1. 研究方法
1.1 样地设置与调查
研究区位于晋西黄土区蔡家川流域，地理坐标为36°14′27″~36°18′23″N，110°39′45″~110°47′45″E，海拔为900~1 513 m，属于黄河的三级支流，呈东西走向，流域面积为39.33 km2[9]。该区属暖温带半干旱大陆性气候，年平均气温为10.0 ℃，年平均降水量为470.0~600.0 mm。该区土壤为褐土，黄土母质，土壤普遍呈碱性[9]。自1990年退耕还林还草以来，蔡家川流域植被覆盖率显著增加，其中人工林以刺槐、油松、侧柏Platycladus orientalis为主，天然次生林以山杨Populus davidiana，白桦Betula platyphylla和辽东栎Quercus liaotungensis为主[10]。
选择蔡家川流域刺槐人工林作为研究对象，以当地另外2种主要林地类型油松人工林和天然次生林作为对照林地。研究样地的选择坚持代表性原则，能够代表区域内同种林型的整体情况。故根据研究内容和实地踏查情况，在研究区内共布设了15个20 m × 20 m的样地，其中包括9个刺槐人工林样地，3个油松人工林样地和3个天然次生林样地，林龄都在20 a左右，每个样地内设置3个5 m × 5 m的灌木样方，3个1 m × 1 m的草本样方。样地基本信息如表 1所示。
表 1 样地基本信息Table 1. Basic situation of sample plots样地 海拔/m 坡度/(°) 坡向 郁闭度/6 C1 1 132 22 阳坡 69 C2 1 154 20 阴坡 61 C3 1 114 13 半阴坡 68 C4 1 119 16 阴坡 63 C5 1 210 18 阴坡 64 C6 1 215 12 半阴坡 58 C7 1 238 18 阳坡 61 C8 1 289 32 半阴坡 59 C9 1 338 11 阳坡 60 Y1 1 158 15 阳坡 61 Y2 1 112 16 阳坡 10 Y3 1 358 20 阴坡 13 N1 1 109 11 半阳坡 12 N2 1 131 10 阴坡 68 N3 1 152 11 阳坡 10 说明：C，Y，N分别表示刺槐人工林、油松人工林、天然次生林 1.2 数据处理
根据样地调查数据，分析群落结构特征及多样性，其中重要值采用IV=[（相对密度+相对显著度+相对频度）/3]×100来计算。采用丰富度指数（S），Shannon-Wiener指数（H′），Simpson指数（D），Pielou均匀度指数（E）来测定植物群落的α多样性；采用Whittaker指数（βW），Cody指数（βC），Routledge指数（βR）测定植物群落的β多样性；采用Jaccard指数（q）测定植物群落的相似性，根据Jaccard相似性原理，0.00≤q＜0.25表示极不相似，0.25≤q＜0.50表示中等不相似，0.50≤q＜0.75表示中等相似，0.75≤q≤1.00表示极相似[11]。
2. 结果与分析
2.1 群落结构特征
重要值是群落中物种生态适应能力和物种在群落中所处地位的综合指标，其大小是确定优势种和建群种的重要依据[12]。由表 2可见：所有刺槐样地中共包含植物种类37种，其中灌木8种，草本29种。灌木层中黄刺梅Rosa xanthina出现频率为100%，平均重要值为53.11%；杠柳Periploca sepium出现频率为22.22%，平均重要值为9.78%；紫丁香Syringa oblata出现频率为33.33%，平均重要值为9.11%。草本层中蒙古蒿Artemisia monogolica出现频率为22.22%，平均重要值为14.11%；冰草出现频率为55.56%，平均重要值为10.22%；铁杆蒿Artemisia vestita出现频率为66.67%，平均重要值为5.22%。这一结果表明，蔡家川流域刺槐人工林下灌木层中黄刺梅为优势种，杠柳和紫丁香为次优种；草本层中蒙古蒿和冰草Agropyron cristatum为优势种，铁杆蒿Artemisia vestita为次优种。由此可知，刺槐林下灌木层以蔷薇科Rosaceae为主，草本层以菊科Compositae和禾本科Gramineae为主。高艳鹏等[13]指出晋西黄土丘陵沟壑区刺槐人工林下草本优势种主要为禾本科、菊科植物，与本研究所得结论一致。
表 2 刺槐样地内主要物种的重要值Table 2. Importance values of the main species in sample plots of Robinia pseudoacacia plantation层次 物种名 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 灌木层 紫丁香Syringa oblata - - 33 29 - - - 20 - 胡枝子Lespedeza bicolor - - - l4 l8 - - - - 黄刺梅Rosa xanthina 86 80 l9 29 55 l7 90 40 62 灰栒子Cotoneaster acutjfolius - - - - - - - - - 妙棘Hippophae rhamnoides - - 5 l4 - - - - - 山檀叶悬钩子Rubus crataegifolius - 7 ll 20 - - 9 - 9 酸枣Ziziphus jujuba var. spinosa 14 10 - - 27 - - - - 杠柳FeripZoca sepium - - - 14 - 74 - - - 草本层 猪毛嵩Artemisia scoparia - 12 6 - - - - - - 碱菀Tripolium vulgare - 7 2 - - - - - - 莎草Cyperus rotundus 3 9 - - - - - - - 针茅Stipa capillata 5 7 - 2 - - - - - 甘草Glycyrrhiza uralensis - 1 - - 7 - - - - 苦荬菜Ixeris denticulata - 3 1 - - 6 - 10 - 紫花地丁Viola philippica - 1 - - 2 10 - - - 委陵菜Potentilla chinensis - 3 - 11 7 10 - 7 - 油嵩Artemisia ordosica - 4 - - - - - - - 蒙古嵩Artemisia mongolica - - 43 - - - 84 - - 乳浆大戟Euphorbia esula - 1 1 7 - 9 - 9 - 早熟禾Poa annua - - 32 - - - - - - 野豌豆 Sesbania cannabina - 6 1 1 2 - - 1 - 铁杆嵩Artemisia vestita - - - 16 11 3 1 15 1 艾嵩Artemisia vulgaris - - - 3 4 - - 1 3 白头翁Pulsatilla chinensis - - - 11 2 5 - 12 7 黄花龙牙Patrinia scabiosaefolia - 1 - 3 7 1 3 5 1 冰草Agropyron cristatum - - - 1 2 2 - 2 85 蒲公英Taraxacum mongolicum - 3 - 5 2 5 - 7 - 祁州漏芦Rhaponticum uniflorum - - - 6 - 2 - 4 - 茵陈嵩Artemisia capillaris 1 11 - - 4 1 - - - 长芒草Stipa bungeana 5 13 - 3 2 2 - 11 - 柴胡Bupleurum chinense - - - 7 2 - - 2 - 白羊草Bothriochloa ischaemum - - - 6 5 - - 8 - 矮臺草Carex supina - - - - 5 - - - - 风毛菊Saussurea japonica - 1 - - 5 - - - - 芦苇Phragmites australis - - - - 4 - - - - 狭叶青嵩Artemisia dacunculus - - - - 5 - - - - 茜草Rubia cordifolia 7 9 3 7 4 11 1 1 1 说明：“-”表示该样地内没有该种植物或者IV＜1 2.2 群落α多样性分析
物种多样性是指群落中的物种数目、个体数及个体分配均匀度的综合。从图 1可以看出：D值灌木层和草本层的起伏波动比较大，没有明显的规律；H′值在所有样地中灌木层小于草本层；E值有2/3的样地灌木层小于草本层。相比灌木层，草本层多样性指数更高，多样性指数的最大值均出现在草本层，而且从平均值看，草本层的D值（0.73），H′值（1.67）和E值（0.77）均大于灌木层的D值（0.50），H′值（0.86）和E值（0.33）。总之，草本层α多样性大于灌木层的α多样性。卢宝明等[14]在研究北京山地植物群落的物种多样性中也得出，灌木层的α多样性指数明显小于草本层的α多样性指数。
结合对照组油松人工林和天然次生林的数据，分析3种林型之间的D值，H′值和E值，从而研究刺槐人工林与其他林型之间α物种多样性的差异（图 2和图 3）。图 2分别描述了3种林型灌木层的D值，H′值和E值，在灌木层，刺槐人工林的3个指数的均值、最小值都小于其他2种林型；从3个指数分布范围可以看出：灌木层的α多样性表现为刺槐人工林＜油松人工林＜天然次生林。
图 3分别描述了3种林型草本层的D值，H′值和E值。从3个指数集中范围可以看出：油松林草本层α多样性＜刺槐林＜天然林；刺槐林D值的均值与油松林较接近，都小于天然次生林；刺槐林E值的均值低于其他2种林型；H′值的均值稍大于油松人工林，但仍小于天然次生林。即2种人工林灌木层和草本层α多样性指数都小于天然林。通过对比图 2和图 3可以看出：同种林型之间，灌木层物种多样性指数小于草本层物种多样性指数。
2.3 群落β多样性分析
利用Whittaker指数（βW），Cody指数（βC）和Routledge指数（βR）求β多样性，分别计算C1~C9与Y1，Y2，Y3，N1，N2，N3之间的β多样性指数，然后求各组的平均值，得到刺槐林与油松林、刺槐林与天然林之间的β多样性指数（表 3），从而分析刺槐人工林、油松人工林和天然次生林之间的物种多样性差异。从表 3可以得出：刺槐林与油松林之间的β多样性要小于刺槐林与天然林之间的β多样性。由此表明：刺槐林与天然林之间植被差异性要大于刺槐林与油松林之间的植被差异性。同时，分析刺槐人工林和油松人工林及天然次生林之间的β多样性得出，草本层β多样性指数＞灌木层β多样性指数。
表 3 刺槐人工林与其他林型之间β多样性指数Table 3. β diversity index between Robinia pseudoacacia plantation and other communities林型 层次 βW βC βR C-Y 灌木层 1.54 1.93 7.51 草本层 3.25 6.37 28.00 C-N 灌木层 1.20 2.22 7.53 草本层 3.43 7.02 28.80 说明：C-Y表示刺槐人工林与油松人工林之间的β多样性；C-N代表刺槐人工林与天然次生林之间的β多样性 2.4 群落相似性分析
采用Jaccard相似性系数作为不同样地相似性的度量标准，分析各样地之间灌木层相似性和草本层相似性（图 4）。从图 4可以得知：在灌木层，各群落之间“中等不相似”出现概率最大，占总数的49.52%，而“极相似”概率最小，仅占总数的1.90%，所以，所调查的样地之间灌木层相似度处于中等偏低水平；在草本层，各群落之间“极不相似”占总数的66.67%，“极相似”占0.95%，所以，所调查样地之间的草本层相似度处于较低水平；同时，从图 4可以得出，灌木层相似性＞草本层相似性。分别计算不同林型和不同林层之间相似性系数的平均值，得出灌木层相似性系数均值规律为：刺槐人工林与刺槐人工林之间的相似性系数＞刺槐人工林与油松人工林之间的相似性系数＞刺槐人工林与天然次生林之间的相似性系数；草本层也满足这一规律。
图 4 样地间林下群落相似性Figure 4. The similarity index of understory communities in different sample plots3. 结果与讨论
揭示人工林林下物种组成，不仅是评估人工林生态功能的一个重要途径，也是判断人工林生态功能恢复效果的一个必要手段[15]。在本研究中，刺槐人工林林下灌木层中黄刺梅为优势种，杠柳和紫丁香为次优种；草本层中蒙古蒿和冰草为优势种，铁杆蒿为次优种；灌木层以蔷薇科为主，草本层以菊科和禾本科为主，与其他学者结论一致[16]。在杨晓毅等[17]的研究中，封山育林自然恢复10 a以后的刺槐人工林下共有58种植物，包括12种灌木和46种草本。本研究中的刺槐人工林均位于固定样地内，受到人为干扰，林下物种共有37种，包括灌木8种，草本29种，均低于封山育林后的物种数，所以适当地对人工林进行短期的封山育林可以改善林下群落结构，提高群落稳定性，其他学者也得出短期的封山育林会对林下植被的物种多样性及植被的生长产生显著的影响[18]。
本研究得出刺槐人工林林下物种α多样性、β多样性均表现出草本层＞灌木层。其他学者在相关研究中也得出森林群落植物多样性在空间上的变化顺序表现为草本层＞灌木层[19]，如果这一趋势一直持续，容易造成刺槐人工林“乔—灌—草”复层稳定的层片结构被打破，使得刺槐群落自我调节能力弱化[20]，出现土壤干化、“小老头树”等一系列生态问题。而且本研究得出，灌木层相似性＞草本层相似性，因此，当地林业管理人员应加强维护“乔—灌—草”层片结构的稳定性，调整“灌—草”结构，增强人工林生态恢复效益，提高群落稳定性。
物种多样性是一个反映一定区域内物种丰富程度和物种分布均匀度的综合指标，物种多样性的高低取决于群落中物种的个数及个体在群落中的分布状况[21]。由于人工林单一的物种组成使得多样性与天然林相比有巨大差异。本研究中，刺槐人工林林下α多样性指数与油松人工林之间的差异较小，两者都小于天然次生林，与其他学者研究结果一致[22]。同时，刺槐林与油松林之间的β多样性指数要小于刺槐林与天然林之间的β多样性指数。由此可知，刺槐林与天然林对比，林下植物种类组成存在较大差异；刺槐人工林与油松人工林林下物种组成差异较小。闫东锋等[23]得出群落多样性的高低能在一定程度上反映出群落稳定性的大小，因此，蔡家川流域刺槐人工林的稳定性仍小于天然次生林的稳定性，林业管理人员应加强刺槐人工林林下植被养护，提高其物种多样性。
在本研究中，刺槐人工林林下植被相似度处于“中等不相似”，草本层相似度处于“极不相似”水平。由于相似性水平越低，说明各样地群落间具有较大的生境差异性[24]，所以蔡家川流域刺槐人工林之间生境差异较大。生境不同，林下植被生长状况不同，所以改善刺槐人工林林下生境条件是提高人工林林下植被多样性的有效手段。有研究表明：刺槐根系的化感作用能够改善土壤微生物环境[25]。刘海燕等[26]研究得出相对于油松人工林，刺槐人工林下微生物群落多样性更丰富，刺槐的种植能够明显改善微生物群落结构，改善土壤质量，从而提高林下物种多样性。因此，引种刺槐在一定程度上可以改善区域的生态环境，提高流域内植被稳定性，起到防治水土流失的作用。
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图 5 不同温度处理下‘堰虹桂’花芽分化进程
Figure 5 Flower bud differentiation period of Osmanthus fragrans'Y anhonggui' under different temperature treatments
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