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沙棘Hippophae rhamnoides又名醋柳，是胡颓子科Elaeagnaceae沙棘属Hippophae的落叶性灌木[1]。作为药食同源植物的沙棘不仅在食疗、医药、农林牧渔等领域具有较大的经济价值，在水土保持、恢复生物链及防风固沙中也具有极大的生态价值[2-5]。生长过程中沙棘根部会遭受土壤中放线菌、细菌的侵染形成根瘤。部分菌种会在根瘤中高度富集发挥固氮、促生长、抵御逆境胁迫、防止有害病菌侵染等功能[6-8]。传统的微生物研究方法主要以培养基进行分离纯培养，再进而探究其培养特征、显微结构、生理特性等[9]。而自然界中90%以上的微生物为不可培养微生物，且现有培养基与培养技术不适应未知菌群的生长，或部分菌群生长缓慢、丰度较小等情况都会对菌群的多样性评估产生影响[10]。以二代高通量测序为基础的16S rDNA技术通过对编码原核核糖体小亚基rRNA的DNA序列进行测序，不仅克服了传统方法难以获得不可培养菌株的弊端，还能对样品中的物种相对丰度进行排序，并分析各群组样品中发挥重要作用的优势物种，解析样品中微生物之间的相互作用。该技术对研究沙棘根瘤内生菌微生物多样性与环境关系以及微生物资源的开发利用有重要的理论和现实意义[11-16]。
本研究通过16S rRNA测序技术对沙棘根瘤内生菌进行物种注释、分类学分析、α多样性分析、β多样性分析、组间差异显著性分析，比较高通量测序和纯培养方法的差异与优劣，为发掘具有应用价值的根瘤内生菌资源提供科学依据。
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采样地为内蒙古自治区巴彦淖尔市磴口县中国林业科学研究院沙漠林业实验中心试验林场(40°29′34″N，106°74′06″E)。该研究区海拔为1 054 m，年平均气温为7.4 ℃。2020年7月，选取人为干扰因素较少的沙漠边缘地带采集沙棘根瘤样品。在每个样地10 m×10 m的区域内用网格法定9个点，运用梅花形采样法在边角及中心共5个点分别采集根瘤样品并进行混合，共设计6组重复样，分别命名为M1、M2、M3、M4、M5、M6。
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依据文献[17-18]的方法进行修改，使其更加适宜沙棘根瘤内生菌的分离。详细步骤如下：选取新鲜饱满的根瘤，冲洗掉土粒泥沙，将根瘤团用解剖刀分割成带有单柄的瘤瓣，用纱布包裹，先用体积分数为95%的酒精溶液浸泡30 s，再用体积分数为10%的次氯酸钠溶液表面灭菌5 min，取出后用无菌水冲洗数次。在灭菌滤纸上，用无菌解剖刀先切取根瘤头部，再将其均分成2~3份薄片，置于固体培养基中28 ℃恒温暗处静置培养。根据相关研究，本研究选取BAP[19]、S[20]、JA[19]、高氏一号培养基[19]进行分离培养。
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提取纯培养的沙棘根瘤内生菌DNA后，对16S rDNA全长进行PCR扩增。序列引物采用YU等[21]设计的细菌通用引物(引物序列27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)，PCR总反应体系为50 μL，包括10×缓冲液(KOD buffer) 5 μL、2 mmol·L−1三磷酸脱氧核糖核苷酸混合液(dNTPs) 5 μL、基因组DNA (genomic DNA) 1 μL、上游引物(forward primer) (10 μm) 1 μL、下游引物(reverse primer) (10 μm) 1 μL、DNA聚合酶(KOD DNA polymerase) 1 μL、超纯水(ddH2O) 36 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳，确定有特异扩增后，进行PCR产物回收和测序注释，并参考文献[22-25]进行比对校验。
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提取沙棘根瘤总DNA后，根据16S rDNA保守区设计引物(引物序列335F：5′-CADACTCCTACGGGAGGC-3′，769R：5′-ATCCTGTTTGMTMCCCVCRC-3′)，在引物末端加上测序接头，便于建库时添加能区分样本的碱基序列的条码/索引(barcode/index)。再进行PCR扩增并对其产物进行紫外分光光度计定量及混样、过柱纯化和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序[26]。高通量测序得到的原始图像数据文件，经碱基识别分析转化为原始测序序列，结果以FASTQ (简称为fq)文件格式存储[27]。
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首先使用 Trimmomatic v.0.33软件[28]，对测序得到的原始测序序列进行过滤；其次使用cutadapt 1.9.1软件进行引物序列的识别与去除，得到不包含引物序列的高质量测序序列；然后使用FLASH v1.2.7软件[29]，按照最小重叠(overlap)长度为10 bp、重叠区允许的最大错配比率为0.2的要求，对每个样品高质量的一小段短的基因测序片段(reads)进行拼接，得到的拼接序列即原始序列质控后的高质量测序序列(clean reads)；最后使用UCHIME v4.2软件[30]，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据。使用Usearch软件对reads在97.0%的相似度水平下进行聚类，获得分类操作单元(OTU)[31]，以测序所有序列数的0.005%作为阈值过滤OTU[32]。以SILVA (
http://www.arb-silva.de/ )为参考数据库使用朴素贝叶斯分类器对特征序列进行分类学注释，可得到每个特征对应的物种分类信息，进而在各水平(门、纲、目、科、属、种)统计样品群落组成，利用QIIME软件生成不同分类水平上的物种丰度表，再利用R语言工具绘制样品分类学水平下的群落结构图[33]。使用QIIME软件对样品α多样性进行评估和t检验(显著性水平为0.01)。利用Mothur v1.30软件和R语言工具包绘制稀释曲线。基于独立OTU，采用加权分析方法和Bray-Curtis算法，使用QIIME软件进行非加权组平均法(UPGMA)分析，比较各组样品间的物种差异。 -
使用Usearch软件对clean reads在97.0%的相似度水平下进行聚类，共计获得651个OTU。各样品OTU个数分布较为均匀，样品M1~M6分别为551、583、579、518、593、589个。如图1所示：6组样品中共有的OTU数为417个。M3、M5、M6中分别有4、2、9个特有的OTU，为样品特有OTU，非单个样品特有或所有样品间共有的OTU在图1未做展示。从整体来看，不同地点的各样品间的OTU差异性远小于共性，说明采样方法设计合理。
图 1 沙棘(M1~M6)根瘤样品分类操作单元(OTU)花瓣图
Figure 1. Petal image of operational taxonomic unit (OTU) of H. rhamnoides root nodule sample (M1－M6)
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对6组样品测序共获得 810 039对reads，双端reads质控、拼接后共产生617 188条clean reads。其中质量≥20的碱基占总碱基数的比例(Q20)为98.7%，质量≥30的碱基占总碱基数的比例(Q30)为95.4%，表明测序质量较好。从图2可见：各样品稀释性曲线趋向平缓，表明在持续抽样下新物种出现的速率逐渐趋于平缓，此环境中物种数量不会随测序数量的增加而显著增多[34]，说明取样合理，能较好体现6组样品中根瘤内生菌的多样性，可以进行数据分析。M5的Shannon和Simpson指数最大(表1)，说明物种多样性最高。同理，M4的物种多样性最低。物种丰度方面M5与M6差别不大，均有较高水平。M4根瘤样品的物种丰度最低。样点的Shannon指数平均为4.24，Simpson指数平均为0.70，Ace指数平均为585.79，Chao1指数平均为595.47，样本文库平均覆盖率为99.95%。说明采样地的沙棘根瘤内生菌的物种丰富且多样性较大，各物种分配相对均匀，其微生物物种信息得到了充分体现。
图 2 各样品稀释性曲线
Figure 2. Dilution curve of each sample
表 1 各组样品的α多样性指数
Table 1. Alpha diversity index for each group of samples
样品 Shannon
指数Simpson
指数Ace
指数Chao1
指数覆盖
率/%M1 2.53 0.47 568.45 598.57 99.95 M2 4.73 0.79 595.09 600.60 99.95 M3 4.28 0.75 600.58 607.45 99.95 M4 2.52 0.44 542.32 543.52 99.94 M5 6.58 0.95 605.66 610.71 99.94 M6 4.82 0.77 602.63 611.97 99.94 平均 4.24 0.70 585.79 595.47 99.95 -
通过传统分离方法从BAP、JA、S、高氏一号培养基中得到纯培养菌株96株。所有菌株均可传代培养，但菌株之间培养周期差异较大，培养周期在1~30 d呈离散型分布。对各菌株进行分子鉴定，共有4门8纲8目13科19属。在门的分类水平分别为变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、厚壁菌门Firmicutes和柔膜菌门Tenericutes。在属的分类水平上，96株菌分属于支原体属Mycoptasma 1株、慢生根瘤菌属Bradyrhizobim 6株、土壤杆菌属Agrobacterium 7株、肠杆菌属Enterobacter 6株、小坂菌属Kosakonia 8株、柠檬酸杆菌属Citrobacter 1株、约克氏菌属Yokenella 1株、欧文氏菌属Erwinia 1株、克罗诺杆菌属Cronobacter 2株、泛菌属Pantoea 1株、莫拉菌属Moraxella 1株、贪噬菌属Variovorax 1株、草螺菌属Herbaspirillum 1株、假单胞菌属Pseudomonas 5株、链霉菌属Streptomyces 14株、小单孢菌属Micromonospora 1株、短杆菌属Brevibacterium 6株、葡萄球菌属Straphylococcus 1株和芽孢杆菌属Bacillus 32株。其中，优势门为变形菌门和厚壁菌门，优势属为芽孢杆菌属和链霉菌属。
高通量测序分析发现：6组样品共有14门34纲89目148科314属。将相对丰度大于0.1%的门与相对丰度前10的属进行汇总(图3、表2、表3)发现：在门的分类水平上，6组样品中相对丰度较高的主要为放线菌门和变形菌门，两者相对丰度之和为87.5%~97.1%。其次为拟杆菌门Bacteroidetes、杆菌门Patescibacteria、厚壁菌门、酸杆菌门Acidobacteria。在属的分类水平上，弗兰克氏菌属Frankia占绝对优势，相对丰度为20.12%~74.81%，平均相对丰度为51.49%。其次为根瘤菌属Rhizobium、类固醇杆菌属Steroidobacter、糖单孢菌属Saccharimonadales、肠杆菌属、泛菌属、欧文氏菌属、假黄色单胞菌属Pseudoxanthomonas、鞘脂单胞菌属Sphingomonas、假单胞菌属、固氮弓菌属Azoarcus、伯克氏菌属Burkholderia、芽单胞菌属Blastomonas、聚集杆菌属Congregibacter、拉恩氏菌属Rahnella、鞘氨醇菌属Chitinophaga、独岛杆菌属Dokdonella、普雷沃氏菌属Prevotella、链霉菌属、Microtrichales属。
表 2 沙棘微生物区系门水平的相对分布
Table 2. Relative abundance of microbiota taxa at the level of phylum
分类 6组样品在门水平的相对丰度/% M1 M2 M3 M4 M5 M6 放线菌门 73.55 47.56 51.24 76.09 27.73 57.68 变形菌门 22.38 41.91 41.63 21.01 60.35 29.82 拟杆菌门 0.89 1.42 1.30 0.40 2.18 4.42 杆菌门 0.31 5.66 3.89 0.73 1.42 1.72 厚壁菌门 2.18 2.74 1.30 1.21 2.18 4.42 酸杆菌门 0.15 0.26 0.42 0.18 1.16 0.53 其他 0.54 0.45 0.22 0.38 0.75 0.60 表 3 沙棘微生物区系属水平的相对分布
Table 3. Relative abundance of microbiota taxa at the level of genus
分类 6组样品在属水平的相对丰度/% M1 M2 M3 M4 M5 M6 弗兰克氏菌属 72.62 44.45 49.50 74.81 20.12 47.41 根瘤菌属 1.17 1.97 2.89 2.04 3.13 4.13 类固醇杆菌属 0.73 0.83 1.05 2.20 7.19 2.87 糖单孢菌属 0.28 5.61 3.85 0.71 1.41 1.68 肠杆菌属 6.93 2.19 1.05 0.08 0.22 0.40 泛菌属 0.63 5.19 4.69 0.01 0.05 0.11 欧文氏菌属 0.60 4.66 3.77 0.10 0.18 0.23 假黄色单胞菌属 0.85 1.98 1.67 0.75 3.56 0.68 鞘脂单胞菌属 0.39 1.06 2.10 1.55 2.10 1.64 假单胞菌属 0.51 1.27 5.60 0.03 0.21 0.09 其他 15.29 30.79 23.83 17.72 61.83 40.76 
图 3 6组根瘤样品的非加权组平均法(UPGMA)聚类树与物种分布柱状图
Figure 3. UPGMA clustering tree and the species distribution histogram of the six groups of nodule samples are combined drawing
在门、纲、目、科、属的各分类单元中，高通量测序的检测灵敏度(高通量测序/纯培养)依次是纯培养方法的3.50、4.25、11.20、11.38和16.53倍。在门水平上，纯培养菌株中占比较高的厚壁菌门在高通量测序中占比并不高。在属水平上，纯培养菌株中占比较高的芽孢杆菌属和链霉菌属皆在高通量测序中占比很低。该对比结果差异性较大，说明高通量测序在微生物多样性分析中占据优势地位，要优于纯培养方法。同时也说明，沙棘根瘤内共生细菌群落结构更为复杂，群落更为稳定。
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在运用传统方法分离纯培养微生物时，共分离纯培养菌株96株，分属于4门8纲8目13科19属，未获得弗兰克氏菌属的菌株，可能是培养基中弗兰克氏菌属的菌株生长缓慢，易被其他菌群取代，因此仍需探索新的培养基与培养方法以遏制根瘤中其他菌株的繁殖。在微生物多样性分析中，由于环境中的微生物复杂多样，各环境之间组成差异较大，通常采用非加权方法进行分析。该方法简单易操作，主要考虑物种的有无，但未考虑物种的丰度，所以采用非加权的方法难以区别各样品间的差异。
高通量测序分析共检测到14门34纲89目148科314属。在门、纲、目、科、属的各分类单元中，高通量测序的检测灵敏度(高通量测序/纯培养)依次是纯培养方法的3.50、4.25、11.20、11.38和16.53倍。与纯培养获得的菌株相比，高通量测序分析结果更加完整地揭示了沙棘根瘤内生菌的微生物多样性。高通量测序表明：在门的分类水平上，样品中相对丰度较高的主要为放线菌门和变形菌门，两者相对丰度之和为87.5%~97.1%。在属的分类水平上，弗兰克氏菌属占绝对优势，相对丰度为20.12%~74.81%，平均相对丰度为51.49%。
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张爱梅等[35]和刘志强等[36]分别对甘肃榆中、辽宁通辽、内蒙古赤峰等地沙棘根瘤内生菌微生物多样性做过类似研究，其高通量测序所得的微生物多样性高于本研究结果，说明沙棘根瘤内生菌微生物多样性受地理位置、土壤成分、气候条件、宿主种类及生长环境等多种因素的影响。本研究的沙棘取样于内蒙古乌兰察布沙漠边缘地带，采样地荒漠化土壤与干旱少雨气候对内生菌多样性有特别影响。
属于非豆科Leguminosae植物的沙棘根瘤共生固氮体系是以弗兰克氏菌属为主导的[37]微生物—微生物—植物互作体系。高通量测序分析显示：弗兰克氏菌属所占比例较高，然而本次传统方法分离却未得到纯培养菌株，这可能是由于培养基中缺乏某种信号物质或与其他菌属竞争存在劣势导致的，建议添加制霉菌素、萘啶酮酸和放线菌酮抑制其他菌群的繁殖[18]。非豆科植物结瘤固氮过程，单一属的菌株难以完成此任务。有研究[38]表明：纯培养分离的贪噬菌属是复杂微生物组中维持根生长的核心菌属，并且具有产生和降解生长素的能力，是细菌—细菌—植物通讯网络的关键角色。小单孢菌是植物益生菌，在促进植物生长的同时还可以分泌细胞壁降解酶促进细胞壁的降解，进而便于弗兰克氏菌的侵染[39-40]，但是小单孢菌的快速繁殖也对弗兰克氏菌的生长起到抑制作用。沙棘作为胡颓子科植物，根部结瘤侵染方式为细胞间侵入。研究[41]表明：草螺旋菌属Spirillum、慢生根瘤菌属、肠杆菌属的相关细菌与弗兰克氏菌存在负相关性(即抑制关系)，以上3个菌属均在豆科、禾本科Poaceae植物中发挥固氮相关的重要作用，但在胡颓子科中此类细菌与弗兰克氏菌属相互作用的机制尚未明确。
Construction of endophytic strain bank of seabuckthorn nodule and an analysis of microbial diversity
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摘要:
目的 沙棘Hippophae rhamnoides根瘤中拥有丰富的微生物资源，探究根瘤内生菌微生物多样性，比较高通量测序与纯培养方法的优劣。 方法 运用16S rRNA高通量测序技术探究沙棘根瘤内生菌相对丰度和多样性差异，并对根瘤内生菌进行分离纯培养，以完成内生菌株库初步构建。 结果 ①传统分离方法得到纯培养菌株96株，共4门8纲8目13科19属。在门分类水平上，相对丰度较高的主要为变形菌门Proteobacteria和厚壁菌门Firmicutes。②高通量测序分析6组样品(M1~M6)中共有14门34纲89目148科314属。在门分类水平上，相对丰度较高的主要为放线菌门Actinobacteria和变形菌门，两者相对丰度之和为87.50%~97.10%。在属的分类水平上，弗兰克氏菌属Frankia占绝对优势，相对丰度为20.12%~74.81%，平均相对丰度为51.49%。③高通量测序与纯培养方法的结果有明显差异，在科和属的分类单元上差异较大。 结论 2种方法都体现沙棘根瘤内生菌的多样性，但纯培养方法仅能够分离到部分内生菌，难以评估物种组成及相对丰度。高通量测序分析能够更为全面地反映多样性信息，且为优化纯培养条件而分离特定物种奠定基础。图3表3参41 -
关键词:
- 根瘤内生菌 /
- 微生物多样性 /
- 16S rDNA高通量测序 /
- 菌株库构建 /
- 沙棘
Abstract:Objective This study is aimed to conduct an investigation of the microbial diversity endophytic bacteria in rhizobia of Hippophae rhamnoides which play an important role in nitrogen fixation and plant growth and research the construction of rhizobia endophytes. Method With the employment of 16S rRNA high-throughput sequencing technology, an exploration was conducted of the relative abundance and diversity of endophytes in Ulange wood rhizobia of Mongolian H. rhamnoides in Dengkou County before the endophytes were isolated and purely cultured to complete the construction of endophytic strains library. Result (1) A total of 96 pure culture strains were obtained by traditional isolation, with 4 phyla, 8 classes, 8 orders, 13 families, and 19 genera and Proteobacteria and Firmicutes are of relatively higher relative abundances in terms of phyla classification. (2) With an analysis of 6 groups of samples (M1−M6) consisting of 14 phyla, 34 classes, 89 orders, 148 families, and 314 genera by high-throughput sequencing, Actinomycota and Proteobacteria have higher relative abundance, and the sum of the relative abundance of the two is between 87.50%−97.10% in terms of phylum classification. As for the taxonomic level of the genus, the genus Frankia occupies an absolute advantage with the relative abundance being between 20.12% and 74.81%, and the average relative abundance being 51.49%. With M5 having the largest Shannon and Simpson indexes and M4 having the lowest species diversity, both M5 and M6 have higher levels of species abundance whereas M4 species has the lowest abundance. (3) The results of high-throughput sequencing and pure culture methods are significantly different, especially in the taxa of families and genera. Conclusion Both methods reflected the diversity of endophytes in sea buckthorn rhizobia, but the pure culture method could only isolate some endophytes, and it was difficult to evaluate the species composition and relative abundance. Also, high-throughput sequencing analysis could reflect the diversity better and lay the foundation for optimizing pure culture conditions for the isolation of specific species. [Ch, 3 fig. 3 tab. 41 ref.] -
小麦Triticum aestivum是世界范围内种植面积最广、产量最多的粮食作物之一。随着自然进化与人类科技进步，世界农业育种已经历了驯化育种、传统育种和分子育种3个时代[1]。目前，仅依靠常规育种技术，包括小麦在内的主要作物的产量已经达到了相当高的水平，但仍然不能满足未来需求[2]。小麦传统育种以杂交育种为中心，选育出了许多高产、稳产、高抗的优异品种。但传统育种周期长、效率低和遗传背景狭窄等问题日益突出[3]。基因组学、系统生物学、合成生物学和人工智能等前沿学科的交叉融合，催生了融合遗传学、细胞生物学、现代生物工程技术和信息技术等现代生物育种技术[4−5]。
文献计量学是以文献或文献相关媒介为研究对象，采用数学、统计学等计量方法，研究文献和文献工作系统的数量关系和规律，以及探讨科学技术动态特征的一门学科[6]。在小麦研究领域，王瑞[7]、GIRALDO等[8]和孟静等[9]分别对2018年以前发表的小麦相关学术文献或专利开展了文献计量学分析，并探索了小麦研究的不同研究主题和研究前沿。2014年国际小麦研究联盟发表了首个小麦基因组草图，2018年发布了第2版小麦基因组序列[10]。此后，人工智能、自动表型、基因组育种等现代生物技术得到了广泛应用，小麦生物育种进入了快速发展的时代[11]。因此，了解这个阶段小麦生物育种的发展过程和特点，有助于预测小麦生物育种的未来研究方向，对保障粮食安全至关重要。近年来，随着人工智能的发展，利用机器学习方法处理大量文字信息，建立文本模型的自然语言处理(NLP)被应用到医学研究和社会科学等领域[12−13]，然而该方法在农业生物领域应用较少。
为全面了解小麦生物育种的发展态势和研究趋势，本研究基于Web of Science核心合集数据库检索小麦生物育种相关文献，结合文献计量学和机器学习方法，分析了国内外小麦生物育种相关的学术文献，包括发文的年代分布特点、主要发文国家、发文机构、研究热点与前沿、研究主题等，旨在揭示小麦生物育种领域的学术研究态势，为小麦育种的理论研究和学科发展提供参考。
1. 材料与方法
1.1 数据来源
本研究文献数据来源于Web of Science核心合集数据库，引文索引数据库包括科学引文索引(SCIE)、社会科学引文索引(SSCI)、会议论文引文索引(CPCI-S、CPCI-SSH)和化学信息数据库(IC、CCR)。通过文献调研、专家咨询和多次试检索，本研究以转基因、基因组育种、基因编辑、合成生物学等生物育种关键技术在小麦中的应用为检索策略，检索年限为2013—2024，检索得到的16 151篇文献作为本研究的数据来源。检索日期为2024年8月31日。
1.2 数据分析
分析国家、研究机构、作者的发文量和影响力时，使用WoS数据库平台中自带的分析功能，并结合Excel软件进行分析。由于本研究数据来源截止到2024年8月31日，数据库中2024年的相关文献仍在更新中，所有年度趋势仅显示2013—2023的分析结果。使用VOSviewer 1.6.20构建知识图谱。在进行国家合作网络分析时，国家最少发文数量设为35篇。在对作者关键词进行共现网络分析时，关键词最小频次设为30次，分析前对关键词进行清洗，合并同义关键词。
潜在狄利克雷分配(LDA)用于确定每篇文章中的研究主题[14]。LDA模型是一种非监督机器学习的文本挖掘方法，能够从大规模的文档集中识别出潜藏的主题信息。LDA算法的主题网络分析突出了相互关联的主题集群共同出现的区域，并将相似的主题进行聚类，突出主题之间的关系。通过分析所有索引文章的摘要来对主题进行建模，并将确定的主题数量设置为50。根据算法计算出每个主题的概率，最终确定每篇文章所属的主题，并进行手动检查来命名每个主题。通过计算每个文档中不同主题同时出现的次数，建立1个主题互作网络，明确主题之间的联系。所有R和Python代码参考文献[14]。
2. 结果与分析
2.1 年度发文分布
2013—2024年小麦生物育种领域发表的16 151篇文献的年度发文量显示(表1)：从2013年开始每年发文量均在900篇以上，且呈逐年上升趋势，在2022年达到了1 931篇，2023年发文量略有下降。从每年的发文量增量来看，2014—2018年以每年33~107篇的速度稳步增加，2019年发文量出现跳跃式增长，比2018年增加了223篇。2019年后小麦生物育种发文量的快速增长可能与2018年发布第2版小麦基因组序列有关。虽然2023年后小麦生物育种发文量出现下降趋势，但小麦生物育种仍处于快速发展的重要阶段，是近年来的热门研究领域。
表 1 小麦生物育种领域2013—2023年度发文量Table 1 Annual publications of wheat bio-breeding during 2013－2023出版年份 发文量/篇 出版年份 发文量/篇 出版年份 发文量/篇 出版年份 发文量/篇 2013 906 2016 1 113 2019 1 520 2022 1 931 2014 1 013 2017 1 217 2020 1 671 2023 1 681 2015 1 080 2018 1 297 2021 1 760 2.2 主要发文国家
小麦是世界三大粮食作物之一。共有123个国家参与了小麦生物育种研究(图1)，说明小麦生物育种研究是全球广泛关注的学科领域。在所有国家中，中国发文量最多(5 389篇)，随后是美国(2 695篇)、澳大利亚(1 489篇)和印度(1 398篇)。中国发文量明显高于其他国家，在全球小麦生物育种研究领域具有竞争优势。在文献影响力方面，中国的总被引频次最高，美国次之，随后是澳大利亚、英国和德国。在篇均被引频次方面，挪威、瑞士、英国、德国、法国、荷兰等发达国家普遍高于发展中国家。中国发表论文数量远远超过其他国家，但篇均被引仅为20.5次，说明中国小麦生物育种研究在提高科研产出数量的同时，还需要进一步提高科研影响力。
图 1 小麦生物育种全球发文情况和被引频次Figure 1 Worldwide scientific production and citations in the research field of wheat bio-breeding本研究使用VOSviewer软件对小麦生物育种的主要发文国家进行合作网络分析(图2)。由图2可见：发文量较多的58个国家形成了5个不同合作集群，分别以中国和美国(紫色)、英国和德国(绿色)、土耳其和伊朗(红色)、巴基斯坦和埃及(蓝色)、澳大利亚和印度(黄色)为代表。其中，中国是发文最多的国家，但美国是国际合作最多的国家(链接数为58个，总链接强度为2 855)。与中国合作最多的5个国家是美国(链接强度为536)、澳大利亚(链接强度为375)、巴基斯坦(链接强度为271)、加拿大(链接强度为135)和墨西哥(链接强度为129)。国际合作不仅能促进了中国小麦生物育种科研产出的数量，也能提高论文的国际影响力。
2.3 主要发文机构
从机构发文量来看，在小麦生物育种领域发文较多的机构有美国农业部、中国农业科学院、国际农业研究磋商组织、西北农林科技大学、国际玉米小麦改良中心等(表2)。西北农林科技大学是发文量进入前5位的高等学校，在此领域的科研实力较强。在学术影响力方面，英国生物技术与生物科学研究理事会(BBSRC)、英国研究与创新署(UKRI)、法国国家农业食品与环境研究院(INRAE)、英联邦科学与工业研究组织(CSIRO)、堪萨斯州立大学具有较高的篇均被引频次。中国在小麦生物育种领域的主要研究机构是中国农业科学院、西北农林科技大学、中国科学院等，在世界上处于第一梯队。
表 2 小麦生物育种领域的主要发文机构Table 2 Most publishing institutions in the research field of wheat bio-breeding机构 发文量/
篇总被引
频次/次篇均被引
频次/次机构 发文量/
篇总被引
频次/次篇均被引
频次/次美国农业部 1 145 29 407 25.7 堪萨斯州立大学 498 20 780 41.7 中国农业科学院 1 115 25 663 23.0 四川农业大学 432 6 742 15.6 国际农业研究磋商组织 970 29 080 30.0 英联邦科学与工业研究组织 428 17 861 41.7 西北农林科技大学 861 17 803 20.7 法国国家农业食品与环境研究院 388 18 639 48.0 国际玉米小麦改良中心 818 26 104 31.9 埃及知识库 383 7 608 19.9 印度农业研究理事会 732 12 926 17.7 华盛顿州立大学 381 9 639 25.3 中国科学院 702 21 794 31.0 中国农业大学 377 9 910 26.3 中国农业与农村部 605 11 806 19.5 河南农业大学 371 7 505 20.2 英国研究与创新署 504 24 995 49.6 加拿大农业与农业食品部 348 10 435 30.0 生物技术与生物科学研究理事会 503 24 980 49.7 南京农业大学 328 6 900 21.0 2.4 研究热点和趋势
为了探索小麦生物育种的研究热点和趋势，利用VOSviewer对小麦生物育种领域发表文献的关键词进行共现和演化分析，生成关键词共现标签视图(图3A)。可以看出：在频次大于30的关键词中，产量(yield)这一关键词的节点最大，说明产量是小麦生物育种的重点，其次是数量性状位点 (QTL)、硬粒小麦(durum wheat)、全基因组关联分析(GWAS)、干旱(drought)、 基因表达(gene expression)、育种(breeding)、单核苷酸多态性(SNP)和分子标记(molecular markers)。
图 3 小麦生物育种研究关键词共现图谱(A)和新兴关键词年度分布(B)Figure 3 Co-occurrence overlay visualization of author keyword (A) and yearly trends of newly emerging keywords (B) in the research field of wheat bio-breeding由图3A可见小麦生物育种领域研究热点的演变。代表性的蓝色节点有简单序列重复 (SSR)、小麦叶锈菌Puccinia triticina、RNA干扰(RNAi)等。这些技术或领域在较早的时期就被大量研究，而近年来的研究进展缓慢或有下降趋势，说明小麦生物育种中的相关研究已经相当成熟或有新的技术方法得到应用。代表性的绿色节点，如yield、breeding、QTL、durum wheat、drought等关键词增长平缓。黄色节点的关键词在近几年的研究中较为活跃，可能代表新兴的研究方向，代表性的关键词包括GWAS、竞争性等位基因特异性PCR (KASP)、候选基因 (candidate genes)、基因组编辑 (genome editing)、转录组 (transcriptome)、 机器学习(machine learning)等，说明这些技术或领域是近年来的研究热点，科研产出上升较快。
为了清楚地了解这些词的变化趋势，选取了平均出版年数值大于2020(即关键词所在文献的平均出版年在2020年之后)，并且出现频次较高的前30个关键词，对其年度分布进行了分析(图3B)。可以看出：GWAS相关的年度产出要明显高于其他关键词。GWAS在2017前发文还较少(出现频次低于10次)，2017年后迅速增长，2022年已成为小麦生物育种研究中最大的热点(出现频次高于同年其他关键词)。有些关键词在2017年以前没有或只有少量相关研究，2017年后逐渐兴起，如KASP、CRISPR、 高通量表型分析(high-throughput phenotyping)、基因组编辑、无人机 (UAV)、机器学习等。这与近年来组学、生物技术、高通量表型和人工智能等现代生物育种技术的发展和广泛应用相关。
2.5 LDA研究主题分析
本研究提取了16 151篇文献的摘要，进行LDA分析，建立语言模型，识别研究主题，最终将所有文献归为50个研究主题。进一步根据Luovian聚类将50个主题分为了5个主题网络集群，以5种不同的颜色显示(图4A)。
图 4 小麦生物育种研究LDA主题网络聚类分析(A)和年度发文量分析(B)Figure 4 Topic cluster network by LDA (A) and yearly trends of different research topics (B) in the research field of wheat bio-breeding在以遗传定位为代表的主题网络集群(绿色区域)中，研究较多的主题是QTL、GWAS、遗传多样性(genetic diversity)、基因标记(gene marker)、表型分析(phenotyping)、模型预测(model prediction)等。其中GWAS、基因标记、基因组测序和QTL之间联系紧密，而表型分析、模型预测和遗传选择(genetic selection)之间联系紧密，表明现代小麦遗传育种涉及了表型、基因组、基因定位和育种模型的联合分析以及重要基因的遗传定位。在以基因组和育种研究为代表的主题网络集群(紫色区域)中，包括小麦基因组(wheat genomes)、染色体易位(chromosome translocation)、硬粒小麦、地方品种(landraces)、突变体(mutants)、淀粉(starch)、开花(flowering)、株高(height)等研究主题。在以生物逆境为代表的主题集群(红色区域)中，包括锈病抗性(rust resistance)、赤霉病(fusarium head blight, FHB)、病原菌(pathogens)、叶片光合作用(leaf photosynthesis)等研究主题，其中锈病抗性相关研究发表文章最多。在以非生物逆境为代表的主题集群(蓝色区域)中，研究较多的主题是盐胁迫(salt stress)、高温胁迫(heat stress)、干旱胁迫(drought stress)、氮效率(nitrogen efficiency)、根系生长(root growth)等。在以产量形成为代表的主题网络集群(橙色区域)中，主要包括产量、产量稳定性(yield stability)、灌浆(grain filling)、基因型与环境互作(genotype-environment interaction)等研究主题。对每个主题的年度发文量进行分析，发现锈病抗性相关的研究近年来发文量持续增多，在2022年达到了207篇，是小麦生物育种的热点研究主题，其次是QTL、面粉品质(flour quality)、干旱胁迫(drought stress)、病原菌、脱落酸、GWAS等相关主题(图4B)。2022年GWAS相关文章发表124篇，与2013年相比增长了接近10倍，是论文数量增长最快的主题，该结果与关键词共现和演化分析结果一致。
3. 讨论
本研究利用文献计量学和机器学习的方法对小麦生物育种的现状、前沿热点和发展趋势进行分析总结。过去10 a是小麦生物育种迅速发展时期。然而，对于国内外小麦生育物育种研究论文的文献计量学分析还停留在2018年以前[7−9]，无法反映小麦生物育种研究的现状和趋势。本研究从Web of Science (WoS)核心合集数据库中检索2013—2024年发表的小麦生物育种相关文献，共计16 151篇。结果显示：2013年以来，全球小麦生物育种研究的科研产出大幅增加，全球123个国家参与小麦生物育种研究，全球小麦生物育种研究正处于快速发展阶段，是近年来的热门研究领域。中国是发表小麦生物育种相关论文最多的国家，还拥有最多的一流大学和研究院所，对小麦研究的重视程度高。
对2018年前发表的小麦研究相关文献分析显示：小麦遗传育种关键词主要集中在产量、品质、品种、遗传多样性、数量性状位点和分子标记等传统育种和分子育种相关词汇[7−9]。本研究的关键词共现分析表明：产量、数量性状位点、全基因组关联分析、干旱、基因表达、单核苷酸多态性等关键词出现的频率最高。随着测序技术的发展，数量性状位点和全基因组关联分析相关研究迅速增多。目前在小麦中已鉴定超过27 500个数量性状位点，其中大部分的数量性状位点是近10 a间鉴定的[15]。近年来还出现了高通量表型分析、无人机、机器学习、深度学习、基因组编辑、规律间隔成簇短回文重复序列等现代生物技术相关的关键词。多篇文章整合表型组、基因组、代谢组、机器学习和基因编辑等技术对小麦重要性状进行遗传解析[16−20]。该结果说明，现代生物育种和信息技术已经开始应用到小麦育种[21−22]。也需要注意的是，这些新兴关键词出现的频率还不高，说明小麦生物育种研究未来需要进一步加强现代生物技术的应用。另外，LDA主题词汇分析表明：锈病、数量性状位点、面粉品质、干旱、全基因组关联分析等相关研究的发文量增长较快。这些主题成为近年来的热点研究领域，可能是由于小麦基因组序列的发布和小麦遗传转化技术的突破。比较而言，分子标记、育种选择等主题增长缓慢或停滞。叶锈病是研究最多的主题，有超过80个叶锈病抗性基因应用于小麦抗病育种[23]。随着全球气候变化加剧，干旱和盐胁迫越来越受到重视，多基因聚合和转基因技术被用来改良综合抗性，实现多性状协同的目标[24−25]。这些结果说明小麦生物育种研究更加关注抗性与产量的协同提升。
4. 结论
在过去10 a间，小麦基因组测序的完成和现代生物技术的应用极大地推动了小麦生物育种的发展。然而还存在几点不足：高影响力和高水平基础研究占比小；关于基因编辑技术开发、基因组选择算法、转基因技术的基本机制的研究很少；对代谢物营养品质、抗病和抗逆机理研究不足；关键基因在育种中的应用研究很少。未来还需要充分利用包括组学、自动表型、人工智能、基因编辑、基因组育种等现代生物技术，发掘和利用重要基因，开展多基因聚合育种，大幅提高小麦产量的同时，改良综合抗性和适应性，实现多性状协同提升。
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图 1 沙棘(M1~M6)根瘤样品分类操作单元(OTU)花瓣图
Figure 1 Petal image of operational taxonomic unit (OTU) of H. rhamnoides root nodule sample (M1－M6)
图 3 6组根瘤样品的非加权组平均法(UPGMA)聚类树与物种分布柱状图
Figure 3 UPGMA clustering tree and the species distribution histogram of the six groups of nodule samples are combined drawing
表 1 各组样品的α多样性指数
Table 1. Alpha diversity index for each group of samples
样品 Shannon
指数Simpson
指数Ace
指数Chao1
指数覆盖
率/%M1 2.53 0.47 568.45 598.57 99.95 M2 4.73 0.79 595.09 600.60 99.95 M3 4.28 0.75 600.58 607.45 99.95 M4 2.52 0.44 542.32 543.52 99.94 M5 6.58 0.95 605.66 610.71 99.94 M6 4.82 0.77 602.63 611.97 99.94 平均 4.24 0.70 585.79 595.47 99.95 
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表 2 沙棘微生物区系门水平的相对分布
Table 2. Relative abundance of microbiota taxa at the level of phylum
分类 6组样品在门水平的相对丰度/% M1 M2 M3 M4 M5 M6 放线菌门 73.55 47.56 51.24 76.09 27.73 57.68 变形菌门 22.38 41.91 41.63 21.01 60.35 29.82 拟杆菌门 0.89 1.42 1.30 0.40 2.18 4.42 杆菌门 0.31 5.66 3.89 0.73 1.42 1.72 厚壁菌门 2.18 2.74 1.30 1.21 2.18 4.42 酸杆菌门 0.15 0.26 0.42 0.18 1.16 0.53 其他 0.54 0.45 0.22 0.38 0.75 0.60
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表 3 沙棘微生物区系属水平的相对分布
Table 3. Relative abundance of microbiota taxa at the level of genus
分类 6组样品在属水平的相对丰度/% M1 M2 M3 M4 M5 M6 弗兰克氏菌属 72.62 44.45 49.50 74.81 20.12 47.41 根瘤菌属 1.17 1.97 2.89 2.04 3.13 4.13 类固醇杆菌属 0.73 0.83 1.05 2.20 7.19 2.87 糖单孢菌属 0.28 5.61 3.85 0.71 1.41 1.68 肠杆菌属 6.93 2.19 1.05 0.08 0.22 0.40 泛菌属 0.63 5.19 4.69 0.01 0.05 0.11 欧文氏菌属 0.60 4.66 3.77 0.10 0.18 0.23 假黄色单胞菌属 0.85 1.98 1.67 0.75 3.56 0.68 鞘脂单胞菌属 0.39 1.06 2.10 1.55 2.10 1.64 假单胞菌属 0.51 1.27 5.60 0.03 0.21 0.09 其他 15.29 30.79 23.83 17.72 61.83 40.76
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