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花芽分化是有花植物开花过程中最为重要的阶段，直接影响植物开花的质量和数量[1]。花芽分化是一个高度复杂的生理生化和形态发生过程，受自身调控和外界环境的共同影响[2-3]。目前，在许多物种中已经证实开花促进因子AP1 (APETALA1)、成花素FT (FLOWERING LOCUS T)以及LFY (LEAFY)等[4-5]参与调控花芽分化。SEP (SEPALLATA)是MADS-box转录因子家族中的一员，在花芽萌发时发挥着重要作用，能够调控B和C类功能基因的表达[6]。SEP蛋白可参与花器官的形成与发育，控制萼片、花瓣以及雄蕊的形成[7-8]。AP1可直接或通过LFY间接促进SEP的表达来控制早期的花发育过程[9]。另外，拟南芥Arabidopsis thaliana中的SEP3直接或间接地作用于SVP (SHORT VEGETATIVE PHASE)、SOC1(SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1)和FT等开花因子的下游基因[10]，SEP3过表达能够控制其提前开花[11]，且LiMADS3 (百合Lilium brownii var. viridulum的SEP3同源基因)转基因拟南芥植株也表现出早期开花表型[12]。PpCMB1隶属SEP类基因的SEP1亚组，将其转入拟南芥与正常生长的相比，PpCMB1过表达具有明显促进抽薹早花的表型[13]。但目前关于SEP类基因CMB1调控花分生组织、花器官和雄蕊等形成的研究较少。
紫薇Lagerstroemia indica是少数夏季开花的木本植物，花型奇特，花期可达100 d，极具观赏价值[14]。紫薇是顶生圆锥花序，其生长锥发育的过程中，首先由花序顶部的花原基先发育，继而两侧不断形成新的小花原基，最终形成完整的圆锥花序。关于紫薇花芽分化进程的研究较少，因此本研究拟通过对紫薇LiCMB1基因克隆，分析LiCMB1在花芽分化过程中不同时期以及不同组织中的表达模式，初步探究LiCMB1对紫薇花芽分化的调控作用，为紫薇的花期调控以及新品种选育等提供理论基础。
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供试材料采自浙江农林大学紫薇种质资源苗圃(30°15′02″N, 119°43′37″E)，选择12株生长条件一致，生长健壮，无病虫害的多年生紫薇植株为材料。观察自2021年3月9日开始，5月7日2次抽梢的新芽开始萌发后每5 d采1次，5月25日花芽开始分化后3 d取样1次，直至分化结束。
采样时在当年生枝条上不同方向二次抽梢后的嫩枝中，随机选取靠近顶芽相同位置的花芽20枚，各采集3份，分别用于石蜡切片和RNA提取。此外，在紫薇营养生长阶段(5月12日)，取紫薇的根、嫩茎和嫩叶，在紫薇开花后(7月2日)，取萼片、花瓣、雌蕊、长雄蕊和短雄蕊用于组织和器官特异性分析。
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将鲜样置于体视显微镜下观察并用游标卡尺记录外部的形态大小变化，石蜡切片的制作方法参考SUN等[15]方法并改进。改进方法为：将FAA中固定24 h后的花芽，采用体积分数为50%和70%的无水乙醇分别脱水30 min，转入体积分数为70%的无水乙醇过夜；次日按照从低至高的无水乙醇，二甲苯浓度梯度进行脱水透明处理；经过浸蜡，包埋，切片(LEICA RM2235)，厚度为9 μm，番红-固绿双重染色等步骤后，中性树胶封片后，置于显微镜(Axio Imager 2，日本)下观察并拍照。
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分别提取不同分化时期的花芽和不同组织的样品各0.5 g，按照Plant Total Isolation Kit试剂盒说明书(Vazyme，中国南京)提取 RNA。cDNA反转录参照HiScriptⅢReverse Transcriptase(Vazyme)说明书进行，反转录后的cDNA保存于−20 ℃冰箱备用。
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从转录组数据中筛选到LiCMB1基因蛋白质编码区(CDS)片段，运用 Primer Premier 5.0软件设计特异性引物(F：ATGGGGAGAGGGAAGGTCGA；R：TTAAAGCGTCCAGTCTTGAAGG)，由浙江有康生物科技有限公司合成，以反转录的 cDNA 为模板进行 PCR扩增。PCR 反应体系如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，10 ℃延伸5 min。PCR扩增产物置于质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收，然后连接至pMDTM18-T载体后转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α，涂板后进行蓝白斑筛选，挑菌经PCR鉴定获得阳性克隆，将菌液送至浙江有康生物科技有限公司进行测序。
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采用ORF Finder (
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/ )将核苷酸序列翻译为氨基酸序列，采用美国国家生物技术信息中心(NCBI)中CDD (Conserved Domain Datebase)在线软件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd )分析保守区域。用Jalview软件(http://www.jalview.org/ )对LiCMB1基因的氨基酸序列进行多重序列比对，使用MEGA 6.0软件邻接法(NJ)构建系统发育树。采用ExPasy提供的Prot-Param (https://web.expasy.org/protparam/ )预测编码蛋白的基本理化性质，采用NetPhos (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ )对磷酸化位点进行分析。分别采用SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/ )和Cell-PLoc 2.0 (http://www.csbio.sjtu. edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/ )进行蛋白质二级结构和亚细胞定位预测情况。 -
设计实时荧光定量PCR (RT-qPCR)上下游引物(F-q：TCGCCGCCATCATCTTCTC；R-q：CTCTAGCTCCTTTATGCTCATCTCC)，并以LiEF-1α作为内参基因[16]。实时荧光定量反应体系如下：SYBR PremixEx Taq 5 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 2.2 μL。RT-qPCR反应程序为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃复性30 s，40个循环，每个样品3次生物学重复。根据
$2^{-\Delta \Delta C_t} $ 法[17]分析LiCMB1的相对表达量，采用Excel 2010和SPSS 22进行数据分析，采用SigmaPlot 12.5进行绘图。 -
根据改进后的石蜡切片结果以及体视显微镜的观察记录，紫薇在新生营养芽展叶第57 天 (2021年5月25日)后开始进入花芽分化，第82 天(2021年6月18日)后雌、雄蕊出现，第92天(2021年6月28日)时花芽分化结束，形成完整的花器官。整个花芽分化过程可以划分为未分化期、开始分化期、花序分化期、花萼分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期以及雌蕊分化期等7个时期(图1)。花芽分化时间集中在5月底至6月中下旬。
图 1 紫薇花芽分化的进程图
Figure 1. Process of flower bud differentiation of L. indica
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以紫薇的花芽cDNA为模板， PCR扩增获得完整的ORF序列，长度为756 bp(图2)，共编码251个氨基酸(图3)。通过NCBI在线BLASTX (
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi )分析，发现该序列与石榴Punica granatum (XP_031400101.1)、可可树Theobroma cacao (XP_017970029.1)的CMB1基因同源性最高，将其命名为LiCMB1。
图 2 紫薇LiCMB1的电泳图
Figure 2. Cloning of LiCMB1
图 3 紫薇LiCMB1的氨基酸推导
Figure 3. Amino acid sequence derivation of LiCMB1
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预测紫薇LiCMB1蛋白分子式为C1250H2027N383O387S10，相对分子量为28 933.78，等电点为8.93，亲水性平均系数为−0.757，为亲水性蛋白(图4A)，脂肪系数为79.92。最富氨基酸占比为谷氨酸(Glu)和赖氨酸(Leu)，氨基酸组成成分分析表明：LiCMB1蛋白肽链正电荷残基[精氨酸(Arg)+赖氨酸(Lys)]总数为39，负电荷残基[天冬氨酸(Asp)+谷氨酸(Glu)]为35，推测其为碱性蛋白。NetPhos分析显示：LiCMB1存在27个磷酸化修饰位点，其中丝氨酸磷酸化位点18个，苏氨酸磷酸化位点6个, 酪氨酸磷酸化位点3个(图4B)。亚细胞定位预测结果表明LiCMB1位于细胞核中。采用NCBI-CDD保守结构域分析发现：LiCMB1具有典型的MADS_MEF2_like和K-box结构域。SOPMA在线网站预测蛋白的二级结构显示：该蛋白质含有51.79%的α-螺旋，3.59%的β-折叠，9.56%的延伸和33.06%的无规则卷曲(图4C)。
图 4 紫薇LiCMB1蛋白理化性质和二级结构预测图
Figure 4. Physicochemical properties and secondary prediction diagram of protein of LiCMB1
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采用Jalview软件将其与其他物种的SEP类蛋白进行比对发现：其氨基酸序列基本相似，除了含有MADS-box典型的结构域外，靠近C端处还含有一个典型的SEP motif保守基序(图5)。采用MEGA 6.0将紫薇LiCMB1与其他物种的SEP类蛋白构建系统发育树(图6)：LiCMB1与葡萄Vitis vinifera的VvCMB1以及其他物种的SEP类蛋白亲缘关系相对较远，而与石榴的PgCMB1具有较近的亲缘关系，蛋白质相似度高达78.97%。
图 5 紫薇LiCMB1与其他物种的SEP类蛋白序列比对
Figure 5. Comparative analysis of LiCMB1 protein sequence
图 6 紫薇LiCMB1与其他物种SEP类蛋白系统进化树
Figure 6. Phylogenetic tree of LiCMB1 and SEP like proteins of other species
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采用RT-qPCR技术，对紫薇花芽分化的7个时期、花器官完成期以及9个不同组织和器官中LiCMB1基因的表达情况进行分析(图7)。结果表明：LiCMB1在紫薇花芽分化的过程中呈现先上升后下降，然后趋于稳定的趋势，在花萼分化期时表达量最高，约为未分化时期表达量的6倍；此外，LiCMB1在不同的组织和器官中都有表达，在根中的表达量最低，其次是茎，在雌蕊中的表达量最高，约根中表达的35倍，萼片和花芽的表达量次之。而LiCMB1在长雄蕊和短雄蕊中的表达量没有显著差异，在花瓣中的表达相对于芽、萼片、雌蕊、长雄蕊和短雄蕊而言较弱，但对于根、茎和叶表达量较高。
图 7 紫薇LiCMB1基因的相对表达量
Figure 7. Relative expression of LiCMB1 gene
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植物从营养生长到生殖生长的转变是开花植物发育的关键过程[18]。在这一发育过程中，紫薇花芽分化显著的变化是花序和花的形成。许多MADS-box家族基因，特别是SEP MADS-box转录因子在调控花芽分化过程中发挥着重要作用[11, 19]。本研究发现：紫薇处于未分化期时花芽较小，当开始分化直至雌、雄蕊出现时芽体不断增长膨大。然后根据各部分原基的出现进行时期的划分，将紫薇的花芽分化过程划分为未分化期、开始分化期、花序分化期、花萼分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期以及雌蕊分化期等7个时期，并从紫薇中克隆到756 bp的LiCMB1基因，共编码251个氨基酸，LiCMB1的氨基酸序列除了含有典型的MADS_MEF2_like和K-box结构域，在靠近C端的位置还含有相对保守的 SEP基序。该基序与SEP3蛋白复合物形成有关[20]，推测SEP基序可能与LiCMB1蛋白的功能有重要关系。系统进化树分析显示：LiCMB1与石榴的PgCMB1蛋白亲缘关系最近，蛋白质相似度高达78.97%，这可能因为紫薇和石榴都属于桃金娘目Myrtales。而与葡萄、苹果Malus domestica、拟南芥、烟草Nicotiana tabacum等植物的SEP类蛋白[21]关系相对较远。
SlCMB1
在番茄Solanum lycopersicum植株组织中的表达谱分析表明：SlCMB1可能参与调控花序和萼片的发育[22]。从桃Prunus persica中分离出的PpCMB1，可能通过抑制PpDAM5蛋白的功能促进花发育，且PpCMB1主要在萼片和雌蕊中高表达[13]。本研究RT-qPCR结果表明：LiCMB1整体呈先上升后下降的表达趋势，这说明其在紫薇花芽分化过程的前期可能起到促进分化的作用。特别是在花序分化期至花萼分化期时表达量较高，这表明LiCMB1参与了紫薇花芽分化的过程并在花萼分化期起到重要作用。在形成完整的花器官后，LiCMB1表达量相对较少，可能是其在该时期不发挥作用。此外，通过组织特异性分析发现：LiCMB1在各组织和器官中均有表达，在花瓣、芽、萼片和雌雄蕊等组织中显著提高，且在雌蕊和萼片中的表达量要高于长雄蕊、短雄蕊和花瓣中的表达量。这说明LiCMB1可能在调控花器官发育过程中发挥了作用，并且可能参与了雌蕊和萼片的发育过程。 在经典的花发育ABCDE模型中，SEP亚组属于E类基因, 通常起到调控花瓣、萼片、雄蕊等的发育[23-24]。SEP类基因VvMADS6能够促进葡萄花芽萌发，表达量相对也较高[25]。重瓣百合Lilium brownii‘Belonica’中LiSEP3的表达模式与双子叶植物的有所不同，其主要在花中表达量较高，并且在最内侧的花瓣中表达量最高[26]。番茄的SEP 类基因SlCMB1在花序中显著表达，其转录水平在花萼中也较高[22]，可能正向调控番茄的花发育。PsMADS4基因在牡丹Paeonia suffruticosa花发育过程中起着重要作用，且与牡丹花的衰老具有密切关系[27]。PheMADS15基因在毛竹Phyllostachy edulis花发育的初期表达量最高，主要在花芽中表达，可能参与毛竹成花转变过程[28]。
本研究通过对LiCMB1蛋白的基本性质以及其在花芽分化各个时期、不同组织和器官的表达特征做了初步探索，发现LiCMB1在紫薇花芽分化过程中的花萼分化期起关键作用，并且可能参与调控花器官的发育过程。但LiCMB1是否会与其他基因互作共同促进紫薇的花芽分化以及花发育，具体的调控机制还有待进一步的验证。
Cloning and expression characteristics of LiCMB1 gene in Lagerstroemia indica
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摘要:
目的 克隆紫薇Lagerstroemia indica LiCMB1基因并分析其在紫薇花芽分化的不同时期及不同组织和器官中的表达，探讨LiCMB1基因的表达特性。 方法 利用简单克隆技术从紫薇中克隆得到LiCMB1的基因序列，通过ExPasy等在线工具对其进行蛋白质理化性质分析，使用MEGA 6.0构建系统进化树，结合紫薇花芽分化的表型观察和石蜡切片，采用实时荧光定量PCR分析花芽分化的不同时期及不同组织和器官中LiCMB1基因的表达。 结果 LiCMB1基因属于MADS-box家族SEP类基因，除了具有典型的MADS_MEF2_like和K-box结构域外，靠近C端处还含有一个SEP motif保守基序；LiCMB1在紫薇花芽分化过程中呈现先上升后下降的表达趋势，在各组织和器官中均有表达，表达量从高到低依次为雌蕊、萼片、芽、长雄蕊、短雄蕊、花瓣、叶、茎、根，说明LiCMB1可能对紫薇的花芽分化起到重要作用，且参与调控花器官发育。 结论 LiCMB1基因属于MADS-box家族的SEP基因，在紫薇花芽分化的前期发挥重要作用，尤其是在花萼分化期表达量最高，组织特异性分析表明该基因很可能参与了调控花器官发育。图7参28 Abstract:Objective The LiCMB1 gene of Lagerstroemia indica was cloned, and its expressions in different stages of flower bud differentiation and different tissues and organs were analyzed, so as to explore the expression characteristics of LiCMB1 gene. Method The gene sequence of LiCMB1 was cloned from L. indica by simple cloning technology. Physical and chemical properties of the protein were analyzed by online tools including ExPasy, and phylogenetic tree was constructed by MEGA 6.0 software. Combined with the phenotypic observation and paraffin section of L.indica flower bud differentiation, the expressions of LiCMB1 gene in different stages of flower bud differentiation and different tissues and organs were analyzed by real-time quantitative PCR (RT-qPCR). Result LiCMB1 gene belongs to SEP gene of MADS-box family, except for typical MADS_ MEF2_ like and K-box structure domain, there is also a SEP motif conserved motif near the C-end. The results of RT-qPCR showed that the expression trend of LiCMB1 increased first and then decreased in the process of flower bud differentiation of L. indica. It is expressed in different tissues and organs, and the expression levels of LiCMB1 from high to low were in the order of pistil, sepal, bud, long stamen, short stamen, petal, leaf, stem, root, indicating that LiCMB1 may play an important role in flower bud differentiation and participate in the regulation of flower organ development. Conclusion LiCMB1 gene belongs to the SEP gene of MADS-box family. It plays an important role in the early stage of flower bud differentiation of L. indica, especially in the calyx differentiation period. Tissue specificity analysis indicated that it was likely involved in the regulation of floral organ development. [Ch, 7 fig. 28 ref.] -
叶绿素是光合作用的重要物质基础，叶绿素含量常作为评价植物光合作用能力、突变、环境胁迫和营养状态的一个重要指标[1]。目前，测定叶绿素含量的方法主要有2种：一种是萃取法，另外一种是借助叶绿素仪获得叶绿素指数。采用叶绿素仪、萃取法测定叶片叶绿素的原理不同，前者是通过在红光和红外光2个波段激发光源时的光学吸收率，测量被测物的叶绿素相对含量，是一个无量纲的比值，而后者是单位质量叶片所含叶绿素质量。叶绿素仪因其测定叶绿素具有快速、无损、便捷的优势而被广泛应用；萃取法则需损坏叶片，操作繁杂，工作量大，测定时间长，在野外测定难度较大，因此不适合野外工作。目前，叶绿素仪CCM-200已广泛应用于农林作物的叶绿素指数测定，已有研究发现园林树木[2]、果树[3]，玉米Zea mays[4]，水稻Oryza sativa[5-7]，小麦Triticum aestivum[8]，烤烟Nicotiana tabacum[9]等多种植物的叶绿素指数（chlorophyll content index，CCI值）与叶绿素质量分数存在极显著正相关关系，但文献中提出的叶绿素指数与叶绿素质量分数的线性模型均针对单一植物，模型参数差异大，没有通用于各种不同植物的模型[5-11]。分析叶绿素仪CCM-200测量叶绿素的原理，其测得的叶绿素指数未反映叶片厚度对测算叶绿素质量分数的影响，而已有的文献中建立的叶绿素估算模型也仅用到了叶绿素指数，并未考虑叶厚度的影响[9, 11-12]。因此，本研究通过分析不同树种叶绿素指数、叶片厚度与叶绿素质量分数之间的关系，建立一个适用于不同树种叶绿素质量分数估测的通用模型，以充分发挥叶绿素仪的作用，避免采用繁杂的萃取法，为在野外测量森林中不同树种叶片的叶绿素质量分数提供方便、快速测量方法，同时弥补叶绿素指数未反映叶片厚度对测量叶绿素质量分数的影响。
1. 材料和方法
1.1 试验地自然状况
试验地点位于浙江省临安市浙江农林大学东湖校园植物园，30°15′38.13″~30°15′43.60″N，119°43′11.41″~119°44′0.54″E，地处中亚热带季风气候区南缘，属季风型气候，温暖湿润，光照充足，雨水充沛，四季分明，年均降水量为1 613.9 mm，降水日为158 d，无霜期年平均为237 d。
1.2 试验材料
2013年6月在浙江农林大学东湖校园植物园内选取校园中常见树种，如青冈Cyclobalanopsis glauca，苦槠Castanopsis sclerophylla，樟树Cinnamomum camphora，广玉兰Magnolia grandiflora等常绿阔叶树种和黄山栾树Koelreuteria integrifoliola，白玉兰Magnolia heptapeta，无患子Sapindus mukorossi，鹅掌楸Liriodendron chinensis，日本晚樱Prunus serrulata等落叶阔叶树种的叶片进行采样。各树种采集树叶3片·株-1，尽量选择不同生长状态的叶片，如嫩叶、成熟叶和老叶等，共采集树叶50片。
1.3 研究方法
1.3.1 叶绿素指数的测定
使用OPTI-SCIENCE生产的CCM-200型叶绿素仪进行测定，对样本树叶分别测量10次·叶-1，测量部位均匀分布于叶片，取平均值作为该叶片的叶绿素指数。
1.3.2 叶绿素的测定
叶绿素测定采用溶液萃取法，萃取的溶液为以V（乙醇）:V（丙酮）:V（水）=4.5:4.5:1.0的比例进行配制。用手握式打孔机对样本叶片打孔，得到的圆片剪碎后称取0.1 g放置在25 mL的萃取液中，再放置黑箱24 h后，用分光光度计测量波长649 nm和665 nm的吸光光度值D（λ）。根据测定的吸光光度值D（λ），按以下公式计算单位质量叶片中叶绿素质量分数[12]：C叶绿素a（mg·g-1）＝[13.95D（665）-6.88D（649）]×V/（W×1 000）。C叶绿素b（mg·g-1）＝[24.96D（665）-7.32D（649）]×V/（W×1 000）。C总叶绿素=C叶绿素a+ C叶绿素b。其中：V为叶绿素提取液体积（mL），D（649）为叶绿素提取液在649 nm处的吸光度值，D（665）为叶绿素提取液在665 nm处的吸光度值，W为称取的叶片质量，本次实验为0.10 g。
1.3.3 比叶质量和比叶面积
比叶质量（specific leaf weight, SLW）是指单位面积的叶片质量（干质量或鲜质量）；其倒数称为比叶面积（specific leaf area，SLA）是指单位质量的叶片面积。用手握式打孔机得到圆片20个·叶片-1`，单个圆片的直径为6 mm，用分析天平称其质量，求得每片叶片的比叶质量（g·cm-2）和比叶面积（cm2·g-1）。
1.4 数据处理
将获取的数据输入Excel中，以不同自变量分别建立模型估算叶绿素叶绿素a，叶绿素b和总叶绿素含量，并作线性回归分析。
2. 结果与分析
2.1 不同树种叶片叶绿素质量分数与厚度测定结果
本实验共测得50个样本，其中40个用来建立叶绿素质量分数的线性估计模型，10个用于模型检验。叶绿素指数、比叶质量、比叶面积和叶绿素质量分数的测定结果统计信息见表 1，各项指标的变化幅度都较大。
表 1 40个样本数据统计Table 1. 40 samples statistical data项目 叶绿素
指数比叶质量/
(g.cm-2)比叶面积/
(cm2·g-1)叶绿素a /
(mg·g-1)叶绿素b/
(mg·g-1)总叶绿素/
(mg·g-1)最大值 109 0.038 89.857 2.329 1.388 3.401 最小值 1 0.011 26.022 0.072 0.096 0.168 平均值 22 0.021 52.396 1.028 0.605 1.632 方差 528 4.678E-05 270.126 0.402 0.113 0.927 变异系数 1.057 0.326 0.314 0.617 0.555 0.590 2.2 叶绿素指数与叶绿素质量分数的关系
从表 2可见：叶绿素质量分数与叶绿素指数之间存在正相关关系。叶绿素指数作为自变量建立的线性模型分别预测叶绿素a，叶绿素b和总叶绿素质量分数，模型的决定系数（R2）分别为0.605，0.618和0.612，相关性较低，F检验仅达到显著，不能较好地估测叶绿素质量分数。
表 2 不同自变量建立的叶绿素估测模型Table 2. Estimation chlorophyll content models of different variable自变量 线性方程 R2 Rmse F检验 叶绿素指数 C 叶绿素a=0.029 8x1 0.605 0.757 * C叶绿素b=0.017 0x1 0.618 0.427 * C总叶绿素=0.0470x1 0.612 1.178 * 叶绿素指数和比叶质量 C叶十绿素a=0.018 0x1+22.029 0x2 0.675 0.109 ** C 叶绿素b=0.009 7x1+14.310 0x2 0.707 0.374 ** C 总叶绿素=0.028 0x1+36.348 0x2 0.689 1.055 ** 叶绿素指数和比叶面积 C叶绿素a=0.015 0x1+0.014 0x3 0.869 0.437 ** C叶绿素b=0.009 0x1+0.008 0x3 0.893 0.226 ** C总叶绿素=0.024 0x1+0.022 0x3 0.881 0.652 ** 说明:x1表示叶绿素指数，x2表示比叶质量，x3表示比叶面积，*置信度为0.05时显著，**置信度为0.01时显著。R2和Rmse的计算公式如下: ${R^2}=\frac{{{{\left[ {\sum\limits_{i=1}^n {\left({{x_i} -\bar x} \right)\left({{y_i} -\bar y} \right)} } \right]}^2}}}{{\sum\limits_{i=1}^n {\left({{x_i} -\bar x} \right)} \sum\limits_{i=1}^n {\left({{x_i} -\bar y} \right)} }}, {R_{{\rm{mse}}}}=\sqrt {\frac{{\sum\limits_{i=1}^n {{{\left({{x_i} -{y_i}} \right)}^2}} }}{n}} $。其中xi是实测值，yi是预测值，$ {\bar x}$是实测平均值，${\bar y}$是预测平均值，n表示样本容量，i=1，2, 3, ..., n。 2.3 叶片厚度对叶绿素质量分数估算的影响
当模型加入比叶质量或比叶面积参数后，叶绿素估算精度明显提高，特别是比叶面积与叶绿素指数共同估测叶绿素质量分数时，其相关性和估测精度都是最高的。比叶质量、比叶面积均与叶绿素质量分数反应正相关，说明叶片的厚度与叶绿素质量分数存在正相关关系。即当叶绿素指数一定时，叶片越厚，叶绿素质量分数越高。
2.4 叶绿素质量分数估计模型
根据不同自变量来估测叶绿素质量分数模型，结果如表 2所示。由表 2中可知：决定系数（coefficient of determination，R2）最大的模型是由叶绿素指数与比叶面积建立的叶绿素质量分数估测模型，其均方根误差（root mean standard error, Rmse）也相对较小，说明此模型估测的叶绿素质量分数精度较高。比叶面积参与估测叶绿素a，叶绿素b和总叶绿素质量分数的3个线性模型中，叶绿素b的预测精度最高，即叶绿素指数和比叶面积对叶绿素b的敏感性高于叶绿素a和总叶绿素质量分数。
3. 模型验证
采用预测值和观测值之间的R2和Rmse对模型进行验证。R2用于分析预测值和实测值之间的符合度，Rmse用于评价预测值和实测值之间的精确度。
将剩余的10个样本值用于检验，根据叶绿素指数来估测叶绿素a，叶绿素b和总叶绿素质量分数的线性模型，所得预测值与实测值比较，比较结果见表 3和图 1～3。图 1～3中叶绿素指数法表示的是以叶绿素指数为自变量的线性模型预测的叶绿素与叶绿素实测值比较的结果。同理，比叶质量法表示的是以叶绿素指数和比叶质量为自变量，而比叶面积法表示的是叶绿素指数和比叶面积为自变量。
表 3 10个样本的实测值与模拟值比较Table 3. Comparison between measured and predicted of the 10 samples测定方法 R2 Rmse 叶绿素a 叶绿素b 总叶绿素 叶绿素a 叶绿素b 总叶绿素 叶绿素指数法 0.400 0.394 0.633 0.991 0.501 1.481 比叶质量法 0.570 0.590 0.580 0.865 0.418 1.270 比叶面积法 0.796 0.841 0.834 0.577 0.282 0.770 
图 1 叶绿素a实测值与模拟值Figure 1. Comparison between measured and predicted chlorophyll a content
图 2 叶绿素b实测值与模拟值比较Figure 2. Comparison between measured and predicted chlorophyll b content
图 3 总叶绿素实测值与模拟值比较Figure 3. Comparison between measured and predicted total chlorophyll content从图 1～3中可看出：仅以叶绿素指数为自变量的线性模型估测值结果均偏小；而以叶绿素指数和比叶质量建立的线性模型估测的叶绿素质量分数，结果精确度低于以叶绿素指数和比叶面积建立的线性模型。可见，根据叶绿素指数和比叶面积这2个自变量建立的线性模型能够精确估测叶绿素a，叶绿素b和总叶绿素质量分数。且这3种线性模型对叶绿素b质量分数的估计精度最高，叶绿素a和总叶绿素质量分数次之。
4. 讨论与结论
通过分析9个不同树种叶片的叶绿素指数、比叶质量、比叶面积与叶绿素质量分数的关系，发现当所测对象的叶片厚度差异较大时，叶绿素仪测定值不能正确反映叶绿素质量分数的差异。利用叶绿素仪所测值估计叶绿素质量分数时，叶片厚度因子的参与明显提高了叶绿素质量分数估算精度。在选择反映叶片厚度因子时，比叶面积要优于比叶质量，可能是由于叶比质量数值偏小而造成精度降低。利用叶绿素指数与比叶面积建立的估算模型适用于各种不同厚度的叶片，克服了仅利用叶绿素指数估算叶绿素质量分数的局限性，适应性较好，具有一定的推广价值。
在不同类型模型中，估测叶绿素b精度均较高，叶绿素a次之，总叶绿素质量分数误差最大。这可能与CCM-200设计的叶绿素吸收波段有关。
从模型验证结果来看，预测结果与实测结果依然存在着偏差。分析试验过程及模型建立方法，造成偏差的原因可能有：①模型本身中的误差因素所造成的误差；本次实验中建立的精度最高的模型也仅考虑了叶绿素指数和比叶面积2个影响因素，并未纳入其他的因素如叶片水分、叶片氮素等的影响；②由于只有40个样本容量，而涉及的树种也仅有9种，相对于自然界的不同树种来说，样本数略显单薄，有待增加样本数量以提高模型精度。
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图 4 紫薇LiCMB1蛋白理化性质和二级结构预测图
Figure 4 Physicochemical properties and secondary prediction diagram of protein of LiCMB1
图 6 紫薇LiCMB1与其他物种SEP类蛋白系统进化树
Figure 6 Phylogenetic tree of LiCMB1 and SEP like proteins of other species
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