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真菌是天然产物的重要来源之一,目前已从中挖掘了包括抗菌药物青霉素在内的大量药源分子。随着大规模化学筛选的开展,从普通真菌资源中发现结构新颖与活性显著的次级代谢产物的概率逐渐变低。因此,独特生境来源的真菌资源成为新活性化合物研究的热点[1]。
植物病原真菌是一种潜在的植物内生真菌,一方面需抵御植物自身防御机制,另一方面需应对外界复杂环境及其他竞争者,是一类特殊生境的真菌类群,因而具有产生结构新颖化合物的潜力[2−4]。LIU等[5]从小麦Triticum aestivum病原真菌平脐蠕孢属真菌Bipolaris sp. TJ403-B1中分离得到一系列新骨架的蛇孢假壳素(ophiobolin)类似物(bipolarolides A~G);KUMARIHAMY等[6]从植物病原菌Septoria pistaciarum中分离得到具有抗疟、抑菌活性的化合物;LI等[7]和WANG 等[8]从小麦病原真菌小麦根腐离蠕孢Bipolaris sorokiniana中分离得到具有显著植物促生长活性和植物毒活性的倍半萜类化合物,进一步印证了植物病原真菌的代谢潜力。
人参Panax ginseng红皮病菌Rhexocercosporidium panacis是导致人参红皮病的病原真菌,病害主要发生在人参根部,会形成大小不一、形状不规则的红色病斑,影响人参的产量及品质,造成严重的经济损失[9−10]。目前尚未有关于人参红皮病菌次级代谢产物研究的相关报道。为探明该菌株代谢潜力,本研究选择人参红皮病菌作为研究材料,对其大米发酵产物乙酸乙酯提取部位进行化学成分研究,首次从中分离得到了9种单体化合物,并对其抗氧化活性与植物毒活性进行初步研究。
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人参红皮病菌菌株购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心(菌种保藏编号CGMCC3.17260)。
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核磁共振仪:Bruker AM 600 (布鲁克科技有限公司,德国),制备型色谱柱:YMC ODS-A (250 mm×10 mm,5 μm,岛津实验器材有限公司,日本),高效液相色谱仪Agilent 1200 (安捷伦科技有限公司,美国),半制备液相色谱仪:LC-52 (赛谱锐思科技有限公司,中国),TG16-WS高速离心机 (湘潭湘仪仪器有限公司,中国),KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司,中国),鼓风式干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司,中国),暗箱式紫外分析仪(上海市宝山顾村电光仪器厂,中国)。色谱甲醇(赛默飞世尔科技,美国),石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇、丙酮等其他试剂(北京化学试剂公司,中国),制备薄层层析硅胶(上海彭腾精细化工有限公司,中国),Sephadex LH-20 (法玛西亚公司,瑞典)。
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PDA培养基配方:马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂粉20 g,去离子水1 000 mL;大米固体培养基配方:每60 g大米加入80 mL去离子水置于500 mL锥形瓶中。
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人参红皮病菌菌种接种在PDA培养基上,20 ℃条件下静置培养10 d,再用接种针将其转接种于含大米培养基的500 mL锥形瓶中(121 ℃,30 min 高压灭菌锅灭菌),25 ℃静置培养2周。共发酵80瓶。
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菌株发酵结束后,向锥形瓶中加300 mL乙酸乙酯进行萃取,合并乙酸乙酯相,此操作重复3次,减压浓缩得到乙酸乙酯部位总膏(30 g)。乙酸乙酯粗提物(30 g)经正相硅胶柱粗分划段,以石油醚∶丙酮(体积比为1∶0~0∶1)梯度洗脱,依据薄层色谱法检测合并得到8个组分(Fr.1~Fr.8)。Fr.2 (500 mg)经重结晶得到化合物1 (5 mg)。Fr.3 (2.3 g)经正相硅胶柱层析,以石油醚∶丙酮(体积比为80∶1~3∶1)继续分离得到4个组分(Fr.3.1~Fr.3.4)。Fr.3.2经Sephadex LH-20 (甲醇为洗脱剂)分离得5个组分Fr.3.2.1~Fr.3.2.5,其中Fr.3.2.5经半制备液相色谱(甲醇/水,体积分数为51%甲醇,流速2 mL·min−1)纯化得到化合物4 [3.5 mg,保留时间(tR)为20 min]。Fr.3.3以丙酮为洗脱剂经凝胶柱 (Sephadex LH-20)分离得到7个组分Fr.3.3.1~Fr.3.3.7,其中Fr.3.3.3有结晶析出,通过重结晶及半制备液相(甲醇/水,体积分数为98%甲醇,流速2 mL·min−1)纯化得到化合物2 (2.4 mg,tR=19 min)和化合物3 (9.3 mg,tR=23 min)。Fr.3.3.7经半制备液相(甲醇/水,0~5 min,体积分数为40%甲醇;5~35 min,体积分数为40%~80%甲醇,流速2 mL·min−1)纯化得到化合物6 (2.5 mg,tR=31 min)。Fr.5 (1.3 g)经正相硅胶柱层析,以二氯甲烷∶甲醇(体积比为50∶1~0∶1)梯度洗脱得Fr.5.1~Fr.5.6,其中Fr.5.3经Sephadex LH-20 (二氯甲烷∶甲醇体积比为1∶1)分离得到Fr.5.3.1~Fr.5.3.6。Fr.5.3.5经过Sephadex LH-20 (二氯甲烷∶甲醇体积比为1∶1)分离得Fr.5.3.5.1~ Fr.5.3.5.4,其中Fr.5.3.5.3经半制备液相(甲醇/水,0~5 min,体积分数为50%甲醇;5~35 min,体积分数为50%~64%甲醇,流速2 mL·min−1)纯化得化合物8 (2.4 mg,tR=19 min),Fr.5.3.5.4经半制备液相(甲醇/水,0~5 min,体积分数为20%甲醇;5~30 min,体积分数20%~55%甲醇;30~50 min,体积分数为55%~70%甲醇,流速2 mL·min−1)纯化得化合物9 (2.4 mg,tR=32 min)、化合物5 (2.4 mg,tR=44 min)。Fr.6经Sephadex LH-20 (甲醇为洗脱剂)分离得到4个组分Fr.6.1~Fr.6.4,其中Fr.6.3经半制备液相处理(甲醇/水,0~5 min,体积分数为40%甲醇;5~30 min,体积分数为40%~60%甲醇,流速2 mL·min−1)纯化得到化合物7 (2.0 mg,tR=23 min)。
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采用1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基清除试验评价化合物1~9的抗氧化活性[11]。将待测化合物及阳性对照(维生素E,VE)配置成质量浓度梯度(200、100、80、60、40、20、10、5 mg·L−1),在96孔板中加入60 μL不同质量浓度的样品或VE,然后加入60 μL的0.1 mmol·L−1 DPPH甲醇溶液,振荡均匀,在黑暗中孵育2 h后,用酶标仪测定在517 nm处的吸光度,空白对照为60 μL DPPH加上60 μL甲醇。抑制率={[D(517)blank− D(517)sample]/D(517)blank}×100%。其中:D(517)blank为对照组60 μL甲醇与60 μL DPPH混合溶液吸光度,D(517)sample为60 μL样品与60 μL DPPH混合溶液吸光度。试验重复3次,以半清除率(IC50,DPPH自由基清除率为50%时的样品浓度)为评价指标。
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参考文献[12]方法测定单体化合物4~9对离体人参根部的致病性。具体步骤如下:采集新鲜人参根,先用自来水清洗,去除泥土并摒弃有瑕疵的根,接着用体积分数为75%乙醇对根部进行消毒,再用打孔器在根部中心位置制作3个孔洞后,将其放置在装有滤纸片的培养皿中(滤纸片已提前用无菌水浸润)。化合物用体积分数为75%乙醇配置成质量浓度为1 g·L−1的标准溶液。最后用移液枪分别吸取10 μL待测化合物标准溶液加入到人参3个孔洞中,封口膜密封后,在黑暗条件下,20 ℃孵育。体积分数为75%乙醇处理的人参根作为对照组,3 d后观察结果。
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运用多种分离技术从人参红皮病菌粗提物的乙酸乙酯部位纯化得到9种单体化合物(图1),利用质谱及核磁共振波谱技术并结合文献数据比对,化合物结构鉴定结果如下:化合物1为麦角甾醇(ergosterol)、化合物2为过氧化麦角甾醇(5,8-epidioxy-5α,8α-ergosta-6,9,22E-tien-3β-ol)、化合物3为5,8-表二氧麦角甾醇-6,9(11),22-三烯-3-醇(5,8-epidioxy-5α,8α-ergosta-6,22E-dien-3β-ol)、化合物4为核桃酮(regiolone)、化合物5为4,6,8-三羟基-3,4-二氢-1(2H)-萘酮(4,6,8-trihydroxy-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-one)、化合物6为2,5-二甲基-7-羟基色酮(2,5-dimethyl-7-hydroxychromone)、化合物7为2-甲基-5-羧甲基-7-羟基色酮(2-methyl-5-carboxymenthyl-7-hydroxychromone)、化合物8为(+)-citreoisocoumarin和化合物9为de-O-methyldiaporthin。化学结构式如图1所示。
化合物1:无色晶体,基于1H-NMR图谱分析,高场区氢化学位移(δH)在1.20~2.50间有复杂重叠的烷基氢信号,并存在6个甲基信号,其中2个单峰甲基氢信号(δH=0.63和0.95),4个双峰甲基氢信号(δH=1.04、0.92、0.83、0.81),另在低场区化学位移δH=3.64处有个积分为1的多重峰氢信号,推测此处连接1个羟基;低场区存在2对烯烃质子信号,其中1对δH=5.21和5.19间的耦合常数为15.6,推测为环外侧链反式双键,基于以上特征推测化合物1为麦角甾醇类化合物。1H-NMR (CDCl3, 600 MHz):δH 5.57 (1H, d, J=6.0 Hz, H-7), 5.38 (1H, d, J=6.0 Hz, H-6), 5.21 (1H, dd, J=15.6, 7.2 Hz, H-23), 5.19 (1H, dd, J=15.6, 7.2 Hz, H-22), 3.64 (1H, tt, J=11.4, 4.2 Hz, H-3), 1.04 (3H, d, J=6.6 Hz, H-21), 0.95 (3H, s, H-19), 0.92 (3H, d, J=6.6 Hz, H-28), 0.83 (3H, d, J=6.6 Hz, H-27), 0.81 (3H, d, J=6.6 Hz, H-26), 0.63 (3H, s, H-18)。以上氢谱数据与文献[13]对比后确认此化合物为麦角甾醇。
化合物 2:无色晶体,其1H-NMR图谱发现与麦角甾醇相似。通过与文献[14]比对,确认该化合物为过氧化麦角甾醇。1H-NMR (CDCl3, 600 MHz): δH 6.58 (1H, d, J=8.4 Hz, H-6), 6.27 (1H, d, J=8.4 Hz, H-7), 5.41 (1H, d, J=6.0, 1.8 Hz, H-11), 5.22 (1H, dd, J=15.6, 7.8 Hz, H-23), 5.14 (1H, dd, J=15.6, 8.4 Hz, H-22), 4.00 (1H, m, H-3), 1.08 (3H, s, 19-Me), 0.99 (3H, d, J=6.6 Hz, 21-Me), 0.90 (3H, d, J=6.6 Hz, 28-Me), 0.82 (3H, d, J=6.6 Hz, 26-Me), 0.81 (3H, d, J=6.6 Hz, 27-Me), 0.72 (3H, s, 18-Me)。
化合物3:无色晶体,其1H-NMR谱图与过氧化麦角甾醇高度相似,主要区别在化学位移δH=5.41处的氢信号消失,推测双键被还原。通过与文献[14]比对,确认此化合物为5,8-表二氧麦角甾醇-6,9(11),22-三烯-3-醇。1H-NMR(CDCl3, 600 MHz): δH 6.50 (1H, d, J=8.4 Hz, H-6), 6.24 (1H, d, J=8.4 Hz, H-7), 5.22 (1H, dd, J=15.6, 7.8 Hz, H-23), 5.14 (1H, dd, J=15.6, 8.4 Hz, H-22), 3.96 (1H, m, H-3), 0.99 (3H, d, J=6.6 Hz, 21-Me), 0.90 (3H, d, J= 6.6 Hz, 28-Me), 0.88 (3H, s, 19-Me), 0.83 (3H, d, J=6.6 Hz, 26-Me), 0.81 (3H, d, J=6.6 Hz, 27-Me), 0.81 (3H, s, 18-Me)。
化合物4:黄色粉末,低分辨质谱数据质荷比(m/z)为179.07,[M+H]+。1H-NMR谱图(图2)显示在低场区有3个氢质子信号,δH=7.50 (1H,t,J=7.8 Hz),7.02 (1H,dd,J=7.8,1.2 Hz),6.93(1H,dd,J=7.8,1.2 Hz),推测化合物含苯环结构;低场区化学位移δH=12.89处的尖单峰结合13C-NMR谱图(图3)中碳化学位移(δC) = 204.4,推测为与羰基形成分子内氢键的活泼氢信号;化学位移δH=4.92的1个双峰氢信号暗示此处可能连接1个羟基。另外,高场区有2对相互耦合的亚甲基信号(δH=3.00,2.65和δH=2.35,2.20),基于以上数据推测化合物4为芳香类化合物。1H-NMR (CDCl3, 600 MHz): δH 12.89 (1H, 8-OH, s), 7.50 (1H, t, J=7.8 Hz, H-6), 7.02 (1H, dd, J=7.8, 1.2 Hz, H-5), 6.93 (1H, dd, J=7.8, 1.2 Hz, H-7), 4.92 (1H, dd, J=7.8, 3.6 Hz, H-4), 3.00 (1H, ddd, J=18.0, 8.4, 4.8 Hz, H-2a), 2.65 (1H, ddd, J=18.0, 8.4, 4.8 Hz, H-2b), 2.35 (1H, m, H-3a), 2.20 (1H, m, H-3b)。13C-NMR (CDCl3, 150 MHz):δC 204.4 (C-1), 34.7 (C-2), 31.4 (C-3), 67.9 (C-4), 146.0 (C-4a), 117.9 (C-5), 137.1 (C-6), 117.5 (C-7), 162.9 (C-8), 115.4 (C-8a)。以上核磁数据与文献[15]中的核桃酮基本一致。
化合物5:黄色粉末,低分辨质谱数据m/z =195.09,[M+H]+。化合物5的1H-NMR谱图与化合物4高度相似,主要区别在化学位移δH=6.00~8.00范围内少1个芳香氢信号,且剩下2个芳香氢δH=6.64和6.22之间耦合常数为1.8,判断这2个氢在苯环上处于间位。对比化合物4,化合物5的芳香氢化学位移向高场移动,结合碳谱数据分析,发现化合物5比化合物4多了1个δC在166.5处的碳信号,推测为双键连氧的碳信号,即苯环上新增的取代基为羟基。1H-NMR(Acetone-d6, 600 MHz):δH 12.89 (1H, s, 8-OH), 6.64 (1H, d, J=1.8 Hz, H-5), 6.22 (1H, d, J=1.8 Hz, H-7), 4.78 (1H, dd, J=9.0, 4.2 Hz, H-4) , 2.75 (1H, m, J=17.4, 6.0, 4.8 Hz, H-2a), 2.61 (1H, m, H-2b ), 2.26 (1H, m, H-3a), 2.03 (1H, m, H-3b)。13C NMR(Acetone-d6, 150 MHz):δC 203.1 (C-1), 166.5 (C-6), 166.1 (C-8), 151.5 (C-4a), 109.9 (C-8a), 106.9 (C-5), 102.1 (C-7), 68.0 (C-4), 35.6 (C-2), 32.7 (C-3)。以上核磁共振数据与文献[16]中的4,6,8-三羟基-3,4-二氢-1(2H)-萘酮基本一致。
化合物6:黄色粉末,低分辨质谱数据m/z =191.10,[M+H]+。1H-NMR谱图显示在低场区δH=6.68和6.67处有2个互相耦合的氢信号,结合耦合常数2.4可知为苯环上处于间位的氢,表明化合物6存在被4个取代基取代的苯环结构;化学位移δH=5.92推测为单峰烯烃质子信号,结合13C-NMR谱图中δC=179.3、164.5和117.5等3处的碳化学位移推测化合物含α,β-不饱和酮结构;高场区存在2个单峰甲基氢信号(δH=2.70和2.28),根据化学位移值推测这2个甲基分别连接在苯环和双键上。基于以上数据推测化合物6为色酮类化合物。1H-NMR(Acetone-d6, 600 MHz): δH 9.37 (7-OH, s), 6.68 (1H, d, J=2.4 Hz, H-8), 6.67 (1H, d, J=2.4 Hz, H-6), 5.92 (1H, s, H-3), 2.70 (3H, s, 5-CH3), 2.28 (3H, s, 2-CH3)。13C-NMR(Acetone-d6, 150 MHz):δC 179.3 (C-4), 164.5 (C-2), 161.5 (C-7), 158.4 (C-9), 142.4 (C-5), 117.5 (C-3), 115.0 (C-10), 111.8 (C-6), 101.5 (C-8), 22.8 (5-CH3), 19.7 (2-CH3)。以上核磁共振数据与文献[17]中的2,5-二甲基-7-羟基色酮基本一致。
化合物7:黄色粉末,低分辨质谱数据m/z =235.09,[M+H]+。化合物7的1H-NMR谱图与化合物6的相似,主要区别在于苯环上取代的甲基信号(δH=2.70)消失,多了1个单峰亚甲基信号(δH=4.10),结合13C-NMR谱图新出现的信号δC=175.9,推测此处由甲基取代变为羧甲基取代。1H-NMR (CD3OD, 600 MHz):δH 6.75 (1H, d, J=2.4 Hz, H-8), 6.69 (d, J=2.4 Hz, 1H, H-6), 6.01 (1H, s, H-3), 4.10 (2H, s, 5-CH2), 2.34 (3H, s, 2-CH3)。13C-NMR(CD3OD, 150 MHz): δC 167.5 (C-2), 119.3 (C-3), 181.5 (C-4), 115.2 (C-4a), 139.6 (C-5), 175.9 (-COOH), 111.7 (C-6), 163.7 (C-7), 102.8 (C-8), 160.7 (C-8a), 21.1 (2-CH3), 42.3 (5-CH2)。以上核磁共振数据与文献[18]中的2-甲基-5-羧甲基-7-羟基色酮基本一致。
化合物8:无色晶体,低分辨质谱数据m/z =279.13,[M+H]+。基于1H-NMR谱图分析,低场区(δH=6.41和6.37)处有2个互相耦合的氢信号,耦合常数为2.4,推测为苯环上间位取代的氢。化学位移(δH=11.14)处存在1个积分为1的氢信号,推测为形成分子内氢键的活泼氢信号, 13C-NMR谱图(δC=167.1)处的碳信号可能为酯羰基信号,结合烯烃单峰质子信号(δH=6.41)推测化合物8为异香豆素类结构。1H-NMR(Acetone-d6, 600 MHz): δH 11.14 (1H, s, 8-OH), 6.43 (1H, s, H-4), 6.41 (1H, d, J=2.4 Hz, H-5), 6.37 (1H, d, J=2.4 Hz, H-7), 4.47 (1H, tt, J=7.8, 4.8 Hz, H-2′), 2.70 (1 H, m, H-3′a, overlapped), 2.70 (1H, m, H-1′a, overlapped), 2.68 (1H, m, H-3′b), 2.60 (1H, dd, J=14.4, 8.4 Hz, H-1′b), 2.15 (3H, s, 5′-CH3), 13C-NMR:(Acetone-d6,150 MHz):δC 167.1 (C-1), 155.7 (C-3), 106.8 (C-4), 103.6 (C-5), 167.1 (C-6, overlapped), 102.5 (C-7), 164.5 (C-8), 99.6 (C-9), 140.8 (C-10), 41.9 (C-1′), 66.1 (C-2′), 50.7 (C-3′), 207.5 (C-4′), 30.6 (C-5′)。以上核磁共振数据与文献[19]中的(+)-citreoisocoumarin基本一致。
化合物9:无色晶体,低分辨质谱数据m/z =237.11,[M+H]+。 化合物9的1H-NMR谱图与化合物8高度相似,表明为同类型化合物,主要区别在化合物9的1H-NMR谱图中少了1个单峰甲基信号(δH=2.15),多了1个双峰甲基信号,结合碳谱数据对比发现化合物9比化合物8少了2个碳信号,其中包括1个羰基碳信号(δC=207.5),推测化合物9比化合物8少了侧链上的乙酰基。1H-NMR(Acetone-d6, 600 MHz): δH 11.16 (1H, s, 8-OH), 6.43(1H, s, H-4), 6.41(d, J=1.8 Hz, 1H, H-5), 6.37(1H, d, J=1.8 Hz, H-7), 4.17(1H, m, H-2′), 2.61(1H, dd, J=14.4, 4.8 Hz, H-1′a), 2.56(1H, dd, J=14.4, 7.8 Hz, H-1′ b), 1.23(3H, d, J=6.0 Hz, 3′-CH3)。13C-NMR(Acetone-d6, 150 MHz): δC 167.1 (C-1), 156.5 (C-3), 106.4 (C-4), 103.4 (C-5), 166.5 (C-6), 102.3 (C-7), 164.5 (C-8), 99.8 (C-9), 140.9 (C-10), 43.9 (C-1′), 65.5 (C-2′), 23.7 (C-3′)。以上核磁共振数据与文献[20]中的de-O-methyldiaporthin基本一致。
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抗氧化实验结果表明:与对照组VE相比,化合物1~9的DPPH自由基清除效果不显著,无抗氧化活性(表1)。人参根部植物毒活性实验结果发现:化合物4~9处理的人参根部与对照组(体积分数为75%乙醇)对比无明显差异(图4),表面均无病斑出现,表明化合物4~9对人参根部无植物毒活性。
表 1 化合物1~9的抗氧化活性
Table 1. Antioxidant activity of compounds 1−9
化合物 IC50/(mg·L−1) 化合物 IC50/(mg·L−1) 1 ≥100 6 ≥100 2 ≥100 7 ≥100 3 ≥100 8 ≥100 4 ≥100 9 ≥100 5 ≥100 VE 9.072 -
本研究对人参红皮病菌次级代谢产物进行了初步研究。通过多种色谱分离技术首次从人参红皮病菌的大米发酵物中分离得到9种化合物,并通过质谱分析、核磁共振波谱分析等技术对化合物结构进行了鉴定。其中化合物1~3为麦角甾醇类化合物,4~9为聚酮类化合物。文献报道[21]:5,8-表二氧麦角甾醇-6,9(11),22-三烯-3-醇对脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞RAW264.7产生一氧化氮(NO)具有中等抑制作用,表明该化合物具有一定抗炎活性。核桃酮和4,6,8-三羟基-3,4-二氢-1(2H)-萘酮都属于萘酮类化合物,其中核桃酮对莴苣Latuca sativa、萝卜Raphanus sativus、黄瓜Cucumis sativus、洋葱Allium cepa和小麦种子萌发和幼苗生长的植物毒性研究结果表明:在低浓度时会刺激生长,高浓度时具有抑制作用[22];而4,6,8-三羟基-3,4-二氢-1(2H)-萘酮从多种真菌的次级代谢产物中分离得到过[23−26],该化合物具有一定的抗真菌和抗细菌活性,对白色念珠菌Candida albicans和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis有中等抑制作用[27]。2009年周永平等[16]首次报道了萘酮类化合物核桃酮和4,6,8-三羟基-3,4-二氢-1(2H)-萘酮具有杀线虫活性。2,5-二甲基-7-羟基色酮与2-甲基-5-羧甲基-7-羟基色酮属于色酮类化合物,结构中的色酮环常作为关键药效基团应用于药物设计[27]。2,5-二甲基-7-羟基色酮还具有抑制生物膜形成的能力,对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌有强抑制作用(抑制率达70%~80%),对大肠埃希菌Escherichia coli和铜绿假单孢菌Pseudomonas aeruginosa等革兰氏阴性菌有中等抑制作用(抑制率为40%~60%) [28]。(+)-citreoisocoumarin具有抗菌活性,能抑制金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和大肠埃希菌的生长;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)评价结果表明:(+)-citreoisocoumarin对2株癌细胞系(MDA-MB-231,HCT 116)具有中等抑制作用[29]。本研究也评价了所分离化合物的抗氧化活性和植物毒活性,结果显示:化合物1~9未表现出抗氧化活性,所测化合物4~9对离体人参根部没有植物毒活性。
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本研究虽然未从人参红皮病菌发酵物中获得对人参根部有植物毒活性的化合物,但从中分离得到的化合物具有多种生物活性,表明该菌株仍具有发现活性化合物的潜力。未来,可以通过大规模发酵或改变发酵条件,进行深入的化学成分分析、分离与结构鉴定,以挖掘得到更多活性化合物,丰富该菌的次级代谢产物种类,也为人参红皮病菌病害致病因子研究提供研究基础。
Chemical components of Rhexocercosporidium panacis from Panax ginseng
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摘要:
目的 对人参Panax ginseng红皮病菌Rhexocercosporidium panacis次级代谢产物进行研究,以期发现活性化合物,并为后期人参红皮病致病机理的研究提供化学物质基础。 方法 通过大米固体发酵方式获得人参红皮病菌粗提物,对粗提物采用硅胶柱层析、反向硅胶柱层析(ODS)、凝胶柱层析(Sephadex LH-20)、半制备液相等多种方法进行分离纯化获得单体化合物,再基于质谱、核磁共振谱方法,并结合文献数据比对鉴定单体化合物结构。最后采用1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基清除法评价9种单体化合物的抗氧化活性,并对其中的6种化合物进行初步的植物毒活性评价。 结果 从人参红皮病菌粗提物乙酸乙酯部位分离得到9种化合物,其中3种甾醇类:化学物1为麦角甾醇(ergosterol)、化合物2为过氧化麦角甾醇(5,8-epidioxy-5α,8α-ergosta-6,9,22E-tien-3β-ol)、化合物3为5,8-表二氧麦角甾醇-6,9(11),22-三烯-3-醇(5,8-epidioxy-5α,8α-ergosta-6,22E-dien-3β-ol);6种聚酮类:化合物4为核桃酮(regiolone)、化合物5为4,6,8-三羟基-3,4-二氢-1(2H)-萘酮(4,6,8-trihydroxy-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-one)、化合物6为2,5-二甲基-7-羟基色酮(2,5-dimethyl-7-hydroxychromone)、化合物7为2-甲基-5-羧甲基-7-羟基色酮(2-methyl-5-carboxymenthyl-7-hydroxychromone)、化合物8为(+)-citreoisocoumarin、化合物9为de-O-methyldiaporthin。活性试验结果表明:化合物1~9无抗氧化活性,化合物4~9对人参根部未表现出致病性。 结论 化合物1~9为首次从人参红皮病菌中分离得到,丰富了该菌种的次级代谢产物数据库。其中化合物4~9表现出多种生物活性,但在植物毒活性评价中未能使离体人参根部致病。图4表1参29 Abstract:Objective The aim is to study the secondary metabolites of Rhexocercosporidium panacis, so as to discover new active compounds and to provide a chemical basis for later research on the pathogenesis of R. panacis. Method The crude extracts of R. panacis were obtained through solid fermentation of rice, and purified by silica gel column chromatography, reversed silica gel column chromatography (ODS), Sephadex LH-20, and semi-preparative liquid chromatography to gain monomeric compounds. The structure of monomeric compounds was identified based on mass spectrometry, nuclear magnetic resonance spectroscopy, and literature data comparison. The antioxidant activities of 9 compounds were tested by DPPH radical scavenging method and the preliminary phytotoxic activity of compounds 4−9 was evaluated. Result 9 compounds were isolated from R. panacis, including three sterols: ergosterol (1), 5,8-epidioxy-5α,8α-ergosta-6,9,22E-tien-3β-ol (2), and 5,8-epidioxy-5α,8α-ergosta-6,22E-dien-3β-ol (3), and six polyketides: regiolone (4), 4,6,8-trihydroxy-3,4-dihydronaphthalene-1(2H)-one (5), 2,5-dimethyl-7-hydroxychromone(6), 2-methyl-5-carboxymenthyl-7-hydroxychromone (7), (+)-citreoisocoumarin (8), and de-O-methyldiaporthin (9). Compounds 1−9 exhibited no antioxidant activity and 4−9 did not display phytotoxic effects on ginseng roots. Conclusion Compounds 1−9 are isolated for the first time from R. panacis, enriching the database of secondary metabolites of this strain. Among them, compounds 4−9 exhibit various biological activities, but do not cause lesions in the isolated ginseng roots in the evaluation of phytotoxic activity. [Ch, 4 fig. 1 tab. 29 ref.] -
Key words:
- Panax ginseng /
- Rhexocercosporidium panacis /
- sterol /
- polyketides /
- biological activities
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小贯小绿叶蝉 Empoasca onukii在中国茶园广泛分布,是对茶树Camellia sinensis危害最大的害虫之一[1]。小贯小绿叶蝉对茶树嫩茎、嫩叶的刺吸会导致茶叶焦枯,抑制茶树正常生长,严重影响茶叶的产量和品质[2−3]。游猎性蜘蛛(游猎蛛)作为一种捕食性天敌,捕食量大、行动活跃、捕食范围广,对防治害虫、调节生态系统平衡都有重要作用[4−6]。利用天敌与害虫之间的捕食关系对茶园害虫进行生物防治的方法已有诸多报道[7−16],这些研究大都直接讨论天敌与害虫之间的关联,对于不同种天敌之间的竞争作用却极少研究。但单一地增加茶园害虫的优势种天敌等势必会导致整个茶园生态系统的不稳定[17−18]。FAUST等[19]将2个物种之间的作用关系分为中性、竞争、偏害、寄生、捕食、偏利和互利共生等几种类型。天敌和害虫之间的关系分为捕食和寄生2种类型,天敌之间为了争夺资源多数是竞争关系[20]。除了天敌与害虫之间的捕食和被捕食关系外,各天敌之间的竞争关系也需要得到重视。因此,从生物多样性等多维度对茶园整个生态环境进行调控更有利于长期高效防治茶园害虫,以达到绿色环保的平衡调节作用[21]。
在昆虫种群数量生态学的研究中,对害虫及天敌数据的统计分析通常为抽样分析,采用的分级方式为连续等分分级,这会使得不同精度级宽下的结果具有主观性和偶然性。张书平等[22]将Fuzzy分级法与灰色关联度法相结合研究茶园与假眼小绿叶蝉 Empoasca vitis数量上关系密切的天敌种类,是一种较好的种间关系研究方法。多数学者对林木种间竞争的研究较多[23],未见对茶园各天敌种间竞争关系的报道,将数据按不同方式分级后再研究种间竞争关系的研究更少。为此,本研究运用灰色关联度法,并将Fuzzy分级法与竞争系数法相结合,研究‘农抗早’‘Nongkangzao’和‘平阳特早’‘Pingyangtezao’茶园游猎蛛取食小贯小绿叶蝉的种间竞争关系,并通过竞争强度指数验证所得结论,为茶园合理保护和利用种间竞争关系强的天敌,有效防治小贯小绿叶蝉提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 调查地点和时间
在安徽农业大学科技示范园(31°56′N,117°12′E)中共调查了2种茶园,分别为‘农抗早’和‘平阳特早’茶园,面积均为0.2 hm2。调查时间为2021年3月25日至11月19日,隔15 d调查1次,共14次。茶园互不相连,按常规措施管理。在春茶采摘结束和秋末进行茶树修剪,并且在秋末进行茶园耕翻,加强秋冬季管理,及时除草、修剪茶树和采摘茶叶,诱杀和人工捕杀害虫,不施用化学农药。
1.2 调查方法
采用平行跳跃法在茶园随机选取3行,每行茶树相隔1 m,在每行间隔1 m处设置1个2 m×1 m的样方,每行取10个样方,每个茶园取30个样方。用目测调查的方式在每个样方随机选取10片叶,调查一些不易振落的害虫及天敌的种类和数量,再用盘拍法对样方中所有枝条进行盘拍(盘拍所用搪瓷盘口长为40 cm,宽30 cm,搪瓷盘上喷洒稀释1 000倍的洗衣粉水溶液)。调查记载盘中害虫及天敌物种数和个体数,不能准确鉴定的物种样本编号保存,装瓶带回室内由专家鉴定。
1.3 分析方法
1.3.1 灰色关联度法
将害虫数量(Yi)及其主要天敌数量(Xj)分别看作1个本征系统,害虫数量作为该系统的参照序列,天敌作为比较序列,并把不同样方的害虫及其主要天敌的数量作为该序列在第k个样方的效果白化值,进行双序列关系分析。数据经均值化后得:
$$ Y_i=\left\{Y_i(1),\; Y_i(2),\; \cdots ,\; Y_i(n)\right\},\; i=1; $$ (1) $$ X_j=\left\{X_j(1),\; X_j(2),\; \cdots,\; X_j(n)\right\}, \;j=1,\;2,\; \cdots,\; M。 $$ (2) 式(1)和式(2)中:n表示样方数,M表示天敌种类数。Yi与Xj在第k个样方上的关联系数rij为:
$$ {r}_{ij}=\frac{{\mathrm{min}}_{i}{\mathrm{min}}_{j}\left|{Y}_{i}\left(k\right)-{X}_{j}\left(k\right)\right|+\rho {\mathrm{max}}_{i}{\mathrm{max}}_{j}\left|{Y}_{i}\left(k\right)-{X}_{j}\left(k\right)\right|}{\left|{Y}_{i}\left(k\right)-{X}_{j}\left(k\right)\right|+\rho {\mathrm{max}}_{i}{\mathrm{max}}_{j}\left|{Y}_{i}\left(k\right)-{X}_{j}\left(k\right)\right|} 。 $$ (3) 式(3)中:ρ 为分辨系数,取值区间为[0, 1],一般取 ρ = 0.5,为扩大各物种之间关联度的差异,本研究取 ρ = 0.8。$|Y_{i}\left(k\right)-{X}_{j}\left(k\right) |$ 为序列Yi与Xj在第k点上差的绝对值;$ \mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}\left|{Y}_{i}\left(k\right)-{X}_{j}\left(k\right)\right| $为1级最小差,$ {\mathrm{min}}_{i}{\mathrm{min}}_{j}\left|{Y}_{i}\left(k\right)-{X}_{j}\left(k\right)\right| $ 为2级最小差。$ \mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}\left|{Y}_{i}\left(k\right)-{X}_{j}\left(k\right)\right| $与$ {\mathrm{max}}_{i}{\mathrm{max}}_{j}\left|{Y}_{i}\left(k\right)-{X}_{j}\left(k\right)\right| $ 分别为1级和2级最大差。利用该公式可求出第j种天敌(Xj)与害虫(Yi)数量间的关联度为$R({Y}_{i},{X}_{j})=1/n\displaystyle \sum _{k=1}^{M}{r}_{ij}\left(k\right)$,其大小反映害虫与天敌相互联系的紧密程度。天敌与害虫数量间关联度越大,表明天敌与害虫数量关系越密切[24]。本研究由数据处理系统软件(DPS系统)进行灰色关联度数据的运算。
1.3.2 模糊分级法
在论域[A1, A2, A3$, \;\cdots , $ An$, \;\cdots , $ Am]上按所求解问题的性质和要求规定的一个隶属函数μi,叫作Fuzzy分级隶属函数。将通常连续等分分级的频数作为原始数据,设原始数据为[a1, a2, a3$,\; \cdots , $ an$, \;\cdots , $ am],称${\hat{{a}}}_{{i}}=\displaystyle \sum _{{n}={i}-5}^{{i}+5}{{\mu }}_{{i}}{{a}}_{{n}}$为第i个Fuzzy等级的Fuzzy频数。它在论域上的分布曲线叫Fuzzy频数曲线[25−26]。本研究规定Fuzzy分级隶属函数μi为:
$$ {\mu }_{i}=\left\{\begin{array}{l}1.0\;n=i\\ 0.8\;n=i+1,\;i-1\\ 0.6\;n=i+2,\;i-2\\ 0.4\;n=i+3,\;i-3\\ 0.2\;n=i+5,\;i-5\\ 0.1\;n=i+5,\;i-5\\ 0\;n > i+5,\;n < i-5\end{array}\right. 。 $$ (4) 式(4)中:n为原始数据项数,i为Fuzzy频数项数。则Fuzzy频数为$ {\hat{a}}_{i}=\displaystyle \sum _{n=i-5}^{i+5}{\mu }_{i}{a}_{n}={a}_{i}+ 0.8\left({a}_{i+1}+{a}_{i-1}\right)+0.6\left({a}_{i+2}+{a}_{i-2}\right)+0.4\left({a}_{i+3}+{a}_{i-3}\right)+0.2\left({a}_{i+4}+{a}_{i-4}\right)+0.1\left({a}_{i+5}+{a}_{i-5}\right) $。为了解茶园游猎蛛的自然种群动态,减少在对游猎蛛进行竞争关系分析时由种群数据导致的误差,本研究根据游猎蛛种群数量变化幅度,对游猎蛛的种群数据按照30个样方中5只游猎蛛的级宽进行等分分级统计(级宽不宜太宽也不宜太窄),算出各级出现的频数,再以30个样方中5只游猎蛛为级宽的频数作为原始数据即[a1, a2, a3$,\; \cdots , $ an$, \;\cdots , $ am]进行Fuzzy分级统计。由Excel 2019计算Fuzzy频数。
1.3.3 竞争系数法
一般用Levins的生态重叠公式计算竞争系数[27]:
$$ {\alpha }_{ij}=\sum _{k=1}^{n}\left({P}_{ik}{P}_{jk}\right)/\sum _{k=1}^{n}{P}_{ik}^{2} 。 $$ (5) 式(5)中:$ {P}_{ik} $ 和$ {P}_{jk} $分别为种i和种j在第k个样方中的相对优势度,n为样地数。
使用重叠的方法计算竞争系数的公式[28]:
$$ {\alpha }_{ij}=\sum _{k=1}^{n}\left({P}_{ik}{P}_{jk}\right)/\sqrt{\sum _{k=1}^{n}{P}_{ik}^{2}\sum _{k=1}^{n}{P}_{jk}^{2}} 。 $$ (6) 式(6)中:αij为种j对种i的竞争系数,Pik和Pjk分别是第i个物种和第j个物种使用的第k个资源的比例。αij = αji,PIANKA[28]评价该式是对称的,并称其为重叠值。MAY[29−30]将该式与其他表达式进行比较,沿用了PIANKA的表达式,并将其作为按函数比例进行计算的竞争系数。本研究中所求得的竞争系数均按上述(6)式计算。
1.3.4 竞争强度法
本研究将关联度与竞争系数相结合,引入竞争强度指数的概念。不同天敌与同一害虫之间关联度的比值称为相对密切度,该相对密切度与2种天敌之间竞争系数的乘积即为竞争强度指数,种i对种j的竞争强度指数(C)为:
$$ C={\alpha }_{ij}\left(\frac{{R}_{iy}}{{R}_{jy}}\right) 。 $$ (7) 式(7)引入了害虫与天敌关系因素,Riy、Rjy分别为天敌Xi、Xj与害虫Y数量上的关联度,αij为种j对种i的竞争系数。本研究中竞争系数和竞争强度指数均由 Excel 2019 对Fuzzy频数计算所得,再使用DPS数据处理系统软件用多重比较方法中的 Duncan 新复极差法进行竞争系数和竞争强度指数平均值和显著水平的分析[31]。
2. 结果与分析
2.1 游猎蛛与小贯小绿叶蝉数量关系的灰色关联度
选取调查日期中2个茶园游猎蛛数量最多的7种蜘蛛作为主要天敌,分别为鞍型花蟹蛛Xysticus ephippiatus、三突花蟹蛛Ebrechtella tricuspidata、粽管巢蛛Clubiona japonicola、斑管巢蛛C. reichlini、斜纹猫蛛Oxyopes sertatus、黑色跳蛛Plexippus paykulli和条纹蝇虎P. setipes。它们的数量动态见表1。
表 1 2个茶园小贯小绿叶蝉与游猎蛛数量动态Table 1 Population dynamics of E. onukii and wandering spiders in two tea plantations茶树品种 日期
(月-日)害虫数量/头 游猎蛛数量/头 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 ‘农抗早’ 03-25 3 10 16 3 2 32 7 7 04-16 11 2 7 1 0 7 0 19 05-07 42 2 6 0 0 2 2 0 05-23 30 1 5 0 0 5 12 1 06-04 222 7 1 5 0 1 5 0 06-20 175 20 5 5 5 0 5 0 07-08 594 14 65 51 88 6 38 0 08-10 209 27 23 15 60 20 26 24 08-22 429 23 19 29 59 33 25 6 09-06 92 19 9 19 23 57 18 6 09-17 30 17 17 13 10 31 13 19 10-13 1 8 1 2 0 45 4 5 11-01 52 4 2 9 9 39 4 19 11-19 47 1 1 3 6 15 3 5 合计 1 937 310 250 155 177 253 155 262 ‘平阳特早’ 03-25 9 2 3 0 0 13 17 4 04-16 11 0 5 0 0 1 6 2 05-07 31 1 6 0 0 0 6 0 05-23 57 3 4 1 0 0 5 0 06-04 251 1 5 0 3 0 11 0 06-20 139 15 8 18 2 0 10 1 07-08 674 26 46 24 34 22 7 0 08-10 318 17 3 17 42 33 13 0 08-22 534 8 18 21 48 31 10 29 09-06 160 29 12 14 18 39 16 10 09-17 20 13 12 12 19 37 12 9 10-13 4 7 2 0 0 20 11 2 11-01 23 5 2 8 3 2 2 3 11-19 108 1 2 3 5 26 2 4 合计 2 339 245 230 128 128 170 118 174 说明:X1~X7分别指鞍型花蟹蛛、三突花蟹蛛、粽管巢蛛、斑管巢蛛、斜纹猫蛛、黑色跳蛛和条纹蝇虎数量(头)。 用灰色关联度法求得小贯小绿叶蝉与游猎蛛数量之间的灰色关联度(表2)。由表2可知:与小贯小绿叶蝉在数量上关联度最大的前3位天敌,‘农抗早’茶园为斑管巢蛛、粽管巢蛛和黑色跳蛛;‘平阳特早’茶园为斑管巢蛛、粽管巢蛛和三突花蟹蛛。2个茶园均有斑管巢蛛和粽管巢蛛。
表 2 2个茶园小贯小绿叶蝉与游猎蛛间的灰色关联度Table 2 Grey correlation between E. onukii and wandering spiders in two tea plantations游猎蛛 ‘农抗早’ ‘平阳特早’ 游猎蛛 ‘农抗早’ ‘平阳特早’ 灰色关联度 排位 灰色关联度 排位 灰色关联度 排位 灰色关联度 排位 鞍型花蟹蛛 0.833 8 5 0.826 1 4 斜纹猫蛛 0.754 8 6 0.794 7 6 三突花蟹蛛 0.856 9 4 0.856 2 3 黑色跳蛛 0.857 0 3 0.802 6 5 粽管巢蛛 0.890 2 2 0.857 1 2 条纹蝇虎 0.744 2 7 0.763 4 7 斑管巢蛛 0.896 7 1 0.860 3 1 2.2 游猎蛛种群数量的Fuzzy分级统计
由图1和图2可看出:2个茶园Fuzzy分级频数集中性明显大于等分分级频数。图1A中在第4、7和12个级宽处出现3个明显的峰值,而图1B中 7条曲线均由高到低一致趋于平缓。图2A中从第11个级宽处多数曲线已贴近横轴,而图2B中的曲线从第15个级宽开始才趋于横轴。通过Fuzzy分级法得到的新数据明显增加了原始数据的有效区间,并且Fuzzy频数由原始数据通过Fuzzy隶属函数求得,每个原始数据都与几个等级发生联系,而等分分级里每个原始数据只与1个等级发生联系,因此Fuzzy频数无明显的分级界限。对2种频数进行t检验,‘农抗早’茶园中鞍型花蟹蛛、三突花蟹蛛、粽管巢蛛、斑管巢蛛、斜纹猫蛛、黑色跳蛛和条纹蝇虎这7种蜘蛛的t值依次为2.333、2.379、2.281、2.646、3.937、3.059、1.975,‘平阳特早’茶园这7种蜘蛛的$ t $值依次为 2.176、2.048、2.153、2.477、3.151、2.090、1.591。自由度为34时,t0.01=2.728,t0.05=2.032,t0.10=1.091,除条纹蝇虎外,2个茶园各游猎蛛2种频数间的差异都显著,并且斜纹猫蛛的2种频数间差异极显著。Fuzzy频数的直接图示是曲线,可保持原始数据的精度,故用此法分级的数据进行后续竞争关系的分析,其结果更接近实际。
2.3 游猎蛛间竞争系数及其差异
以Fuzzy频数作为原始数据,计算2个茶园各游猎蛛之间的竞争系数并将结果列于表3。对各游猎蛛及其竞争对手之间的竞争系数进行方差分析,再用新复极差法分析天敌之间竞争系数的差异性(表4)。所得结果中,当竞争对手分别为鞍型花蟹蛛、三突花蟹蛛、粽管巢蛛和条纹蝇虎时,游猎蛛间差异显著,此时不同竞争对手下竞争力最强的游猎蛛不同,故暂时无法得出茶园竞争力最强的蜘蛛类别,但除斑管巢蛛和黑色跳蛛外,无论竞争对手为哪种游猎蛛,所有游猎蛛都与斜纹猫蛛差异显著,且斜纹猫蛛的均值都最小。因此,可得出结论:除斑管巢蛛和黑色跳蛛外,5种游猎蛛里斜纹猫蛛竞争力最弱。
表 3 2个茶园各游猎蛛之间的竞争系数Table 3 Competition coefficients among wandering spiders in two tea plantations茶树品种 竞争对手 游猎蛛间竞争系数 鞍型花蟹蛛 三突花蟹蛛 粽管巢蛛 斑管巢蛛 斜纹猫蛛 黑色跳蛛 条纹蝇虎 ‘农抗早’ 鞍型花蟹蛛 1.000 0 0.991 5 0.983 7 0.939 8 0.906 3 0.959 2 0.991 0 三突花蟹蛛 0.991 5 1.000 0 0.995 2 0.973 3 0.893 8 0.928 2 0.995 3 粽管巢蛛 0.983 7 0.995 2 1.000 0 0.980 3 0.901 5 0.916 7 0.993 6 斑管巢蛛 0.939 8 0.973 3 0.980 3 1.000 0 0.872 9 0.856 8 0.961 4 斜纹猫蛛 0.906 3 0.893 8 0.901 5 0.872 9 1.000 0 0.959 8 0.871 7 黑色跳蛛 0.959 2 0.928 2 0.916 7 0.856 8 0.959 8 1.000 0 0.915 9 条纹蝇虎 0.991 0 0.995 3 0.993 6 0.961 4 0.871 7 0.915 9 1.000 0 ‘平阳特早’ 鞍型花蟹蛛 1.000 0 0.989 3 0.998 5 0.976 5 0.913 7 0.993 5 0.975 1 三突花蟹蛛 0.989 3 1.000 0 0.984 2 0.977 4 0.869 7 0.984 4 0.992 5 粽管巢蛛 0.998 5 0.984 2 1.000 0 0.967 4 0.909 3 0.996 3 0.967 4 斑管巢蛛 0.976 5 0.977 4 0.967 4 1.000 0 0.939 7 0.954 0 0.957 1 斜纹猫蛛 0.913 7 0.869 7 0.909 3 0.939 7 1.000 0 0.880 6 0.826 5 黑色跳蛛 0.993 5 0.984 4 0.996 3 0.954 0 0.880 6 1.000 0 0.967 7 条纹蝇虎 0.975 1 0.992 5 0.967 4 0.957 1 0.826 5 0.967 7 1.000 0 表 4 2个茶园各游猎蛛之间竞争系数新复极差法分析结果Table 4 Results of the new multiple range test analysis of competition coefficients among various wandering spiders in two tea plantations竞争对手 F 物种 2个茶园竞争
系数均值5%显著
水平1%极显著
水平竞争对手 F 物种 2个茶园竞争
系数均值5%显著
水平1%极显著
水平鞍型花蟹蛛 7.530 粽管巢蛛 0.991 1 a A 斜纹猫蛛 1.203 黑色跳蛛 0.920 2 a A 三突花蟹蛛 0.990 4 a A 鞍型花蟹蛛 0.910 0 a A 条纹蝇虎 0.983 0 a A 斑管巢蛛 0.906 3 a A 黑色跳蛛 0.976 4 a A 粽管巢蛛 0.905 4 a A 斑管巢蛛 0.958 2 a AB 三突花蟹蛛 0.881 7 a A 斜纹猫蛛 0.910 0 b B 条纹蝇虎 0.849 1 a A 三突花蟹蛛 11.356 条纹蝇虎 0.993 9 a A 黑色跳蛛 0.562 鞍型花蟹蛛 0.976 4 a A 鞍型花蟹蛛 0.990 4 a A 粽管巢蛛 0.956 5 a A 粽管巢蛛 0.989 7 a A 三突花蟹蛛 0.956 3 a A 斑管巢蛛 0.975 4 a A 条纹蝇虎 0.941 8 a A 黑色跳蛛 0.956 3 a A 斜纹猫蛛 0.920 2 a A 斜纹猫蛛 0.881 7 b B 斑管巢蛛 0.905 4 a A 粽管巢蛛 3.305 鞍型花蟹蛛 0.991 1 a A 条纹蝇虎 12.037 三突花蟹蛛 0.993 9 a A 三突花蟹蛛 0.989 7 a A 鞍型花蟹蛛 0.983 0 a A 条纹蝇虎 0.980 5 a A 粽管巢蛛 0.980 5 a A 斑管巢蛛 0.973 9 a A 斑管巢蛛 0.959 2 a A 黑色跳蛛 0.956 5 ab A 黑色跳蛛 0.941 8 a A 斜纹猫蛛 0.905 4 b A 斜纹猫蛛 0.849 1 b B 斑管巢蛛 1.610 三突花蟹蛛 0.975 3 a A 粽管巢蛛 0.973 9 a A 条纹蝇虎 0.959 2 a A 鞍型花蟹蛛 0.958 2 a A 斜纹猫蛛 0.906 3 a A 黑色跳蛛 0.905 4 a A 说明:计算不同竞争对手下各游猎蛛在2个茶园竞争系数的平均值,5%水平上均数最大的标记为a,1%水平上均数最大的标记为A。向下比较,与之差异性不显著的标记相同字母,差异性显著的标记不同字母。 2.4 游猎蛛与小贯小绿叶蝉数量关系的竞争强度及其差异
结合关联度和竞争系数将所求的竞争强度指数列于表5。对竞争强度指数进行方差分析,用新复极差法进行比较(表6)。由表6可知:无论竞争对手为哪种游猎蛛,粽管巢蛛都与其他蜘蛛差异显著,其次为斑管巢蛛,且游猎蛛中斜纹猫蛛与两者差异极显著。因此,可得出结论:粽管巢蛛竞争力最强,斑管巢蛛次之,斜纹猫蛛竞争力最弱。
表 5 2个茶园各游猎蛛之间的竞争强度指数Table 5 Competition intensity indices among wandering spiders in two tea plantations茶树品种 竞争对手 游猎蛛间竞争强度指数 鞍型花蟹蛛 三突花蟹蛛 粽管巢蛛 斑管巢蛛 斜纹猫蛛 黑色跳蛛 条纹蝇虎 ‘农抗早’ 鞍型花蟹蛛 1.000 0 1.019 0 1.050 3 1.010 7 0.820 4 0.985 9 0.884 5 三突花蟹蛛 0.964 7 1.000 0 1.033 8 1.018 5 0.787 3 0.928 3 0.864 3 粽管巢蛛 0.921 4 0.958 0 1.000 0 0.987 5 0.764 4 0.882 5 0.830 6 斑管巢蛛 0.873 9 0.930 1 0.973 2 1.000 0 0.734 8 0.818 9 0.797 8 斜纹猫蛛 1.001 2 1.014 7 1.063 2 1.037 0 1.000 0 1.089 8 0.859 4 黑色跳蛛 0.933 2 0.928 1 0.952 2 0.896 5 0.845 3 1.000 0 0.795 3 条纹蝇虎 1.110 4 1.146 1 1.188 6 1.158 5 0.884 2 1.054 8 1.000 0 ‘平阳特早’ 鞍型花蟹蛛 1.000 0 1.025 4 1.036 1 1.017 0 0.879 0 0.965 3 0.9012 三突花蟹蛛 0.954 4 1.000 0 0.985 2 0.982 0 0.807 2 0.922 7 0.884 9 粽管巢蛛 0.962 3 0.983 2 1.000 0 0.971 0 0.843 1 0.932 9 0.861 7 斑管巢蛛 0.937 6 0.972 8 0.963 8 1.000 0 0.868 1 0.890 0 0.849 3 斜纹猫蛛 0.949 7 0.937 0 0.980 7 1.017 2 1.000 0 0.889 3 0.794 0 黑色跳蛛 1.022 6 1.050 2 1.064 0 1.022 6 0.872 0 1.000 0 0.920 5 条纹蝇虎 1.055 1 1.113 1 1.086 1 1.078 5 0.860 4 1.017 3 1.000 0 表 6 2个茶园各游猎蛛之间的竞争强度指数新复极差法分析结果Table 6 Results of the new multiple range test analysis of competitive intensity indices among various wandering spiders in two tea plantations竞争对手 F 物种 2个茶园竞争
强度指数均值5%显著
水平1%极显著
水平竞争对手 F 物种 2个茶园竞争
强度指数均值5%显著
水平1%极显著
水平鞍型花蟹蛛 32.992 粽管巢蛛 1.043 2 a A 斜纹猫蛛 2.142 斑管巢蛛 1.027 1 a A 三突花蟹蛛 1.022 2 ab A 粽管巢蛛 1.022 0 a A 斑管巢蛛 1.013 8 ab A 黑色跳蛛 0.989 5 ab A 黑色跳蛛 0.975 6 b A 三突花蟹蛛 0.975 8 ab A 条纹蝇虎 0.892 9 c B 鞍型花蟹蛛 0.975 4 ab A 斜纹猫蛛 0.849 7 c B 条纹蝇虎 0.826 7 b A 三突花蟹蛛 33.492 粽管巢蛛 1.009 5 a A 黑色跳蛛 1.575 粽管巢蛛 1.008 1 a A 斑管巢蛛 1.000 2 a AB 三突花蟹蛛 0.989 1 a A 鞍型花蟹蛛 0.960 9 ab AB 鞍型花蟹蛛 0.977 9 a A 黑色跳蛛 0.925 5 b BC 斑管巢蛛 0.959 6 a A 条纹蝇虎 0.874 6 c C 斜纹猫蛛 0.858 6 a A 斜纹猫蛛 0.797 3 d D 条纹蝇虎 0.857 9 a B 粽管巢蛛 9.706 斑管巢蛛 0.979 3 a A 条纹蝇虎 10.533 粽管巢蛛 1.137 3 a A 三突花蟹蛛 0.970 6 a AB 三突花蟹蛛 1.129 6 a A 鞍型花蟹蛛 0.941 9 a AB 斑管巢蛛 1.118 5 a A 黑色跳蛛 0.907 7 ab ABC 鞍型花蟹蛛 1.082 7 a A 条纹蝇虎 0.846 2 bc BC 黑色跳蛛 1.036 1 a A 斜纹猫蛛 0.803 8 c C 斜纹猫蛛 0.872 3 b B 斑管巢蛛 3.588 粽管巢蛛 0.968 5 a A 三突花蟹蛛 0.951 4 ab A 鞍型花蟹蛛 0.905 8 abc A 黑色跳蛛 0.854 4 abc A 条纹蝇虎 0.823 6 bc A 斜纹猫蛛 0.801 5 c A 说明:计算不同竞争对手下各游猎蛛在2个茶园竞争强度指数的平均值,5%水平上均数最大的标记为a,1%水平上均数最大的标记为A。向下比较,与之差异性不显著的标记相同字母,差异性显著的标记不同字母。 3. 结论与讨论
本研究首先通过灰色关联度分析初步得出2个茶园与小贯小绿叶蝉数量相关性最大的游猎蛛均为斑管巢蛛和粽管巢蛛,再对7种游猎蛛的种群数量进行Fuzzy分级统计,将得出的Fuzzy频数作为原始数据进行竞争系数分析,结果显示:除斑管巢蛛和黑色跳蛛外,5种游猎蛛中斜纹猫蛛竞争力最弱。为验证结果准确性,综合灰色关联度和竞争系数结果引入了竞争强度指数概念,得出7种游猎蛛中斜纹猫蛛竞争力最弱,并且在任何竞争对手下粽管巢蛛都与其他蜘蛛差异显著,其次为斑管巢蛛,即在取食茶园小贯小绿叶蝉时粽管巢蛛和斑管巢蛛竞争力最强,斜纹猫蛛竞争力最弱。
在进行Fuzzy分级统计时,并未对小贯小绿叶蝉数量进行分级,因为在进行竞争关系分析时,只需要7种游猎蛛的数量数据,故无需对小贯小绿叶蝉数量做同样的处理。在进行灰色关联度分析时,小贯小绿叶蝉和7种游猎蛛数量均未进行处理,原因是小贯小绿叶蝉数量与7种游猎蛛数量数据大小相差较大,选择过大的级宽会导致游猎蛛数量均处于第1级宽内,选择较小级宽会出现较多级层且在靠后多个级层里只有小贯小绿叶蝉数据,而游猎蛛数据均为0。对7种游猎蛛的种群数量进行Fuzzy分级,然后进行竞争关系的统计计算,使它们的数据集中性更加突出,弥补了抽样时造成的误差,是一种简洁有效的计算方法。
2个茶园竞争力最强和最弱的蜘蛛相同。本研究的2个茶园均按常规措施管理,不使用化学农药,且于冬季除草修剪,修剪会影响天敌的虫口基数,而‘农抗早’和‘平阳特早’抗逆性和抗寒性强[32],因此在相近的受害程度后,‘农抗早’和‘平阳特早’恢复时间均较短,恢复效果均较好,害虫所处环境变化的速度一致性可能是研究结果相同的原因之一。此外,茶园竞争力最强的是斑管巢蛛,这可能与斑管巢蛛的生活习性有关。斑管巢蛛定居且游猎于树冠上被害卷叶或枯叶等阴暗干燥处,白天基本不出行,黄昏时刻,蜘蛛开始活动,主动巡游猎取食,沿着枝、叶逐一搜索前进,几乎无遗漏之处。合理保护和利用斑管巢蛛这类竞争力强的蜘蛛可达到有效防治小贯小绿叶蝉的目的。
对茶园游猎蛛之间竞争作用的研究可以更好地理解游猎蛛之间的竞争如何影响害虫的数量和变化趋势以及如何影响生物防治的有效性[33]。至今利用害虫与天敌的种间关系对茶园害虫进行生物防治更多地还是停留在增加优势种天敌数量的方向上,分析天敌之间的竞争作用有利于选出最高效的天敌组合,在不破坏茶园原有生态环境的基础上高效防治害虫。
本研究中的7种游猎蛛都是广食性天敌,但为了研究方便,把它们作为只取食小贯小绿叶蝉一种食饵的单食性天敌,若进行深入研究就需要考虑多种猎物(害虫)共存时天敌对食物的嗜食性,在此基础上应用竞争关系分析方法就能更加真实地反映天敌之间的关系。另外,本研究是分析天敌两两之间的竞争关系,实际上,在食饵不足时,7种天敌之间也存在竞争关系,这种情况有待进一步研究。
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表 1 化合物1~9的抗氧化活性
Table 1. Antioxidant activity of compounds 1−9
化合物 IC50/(mg·L−1) 化合物 IC50/(mg·L−1) 1 ≥100 6 ≥100 2 ≥100 7 ≥100 3 ≥100 8 ≥100 4 ≥100 9 ≥100 5 ≥100 VE 9.072 -
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