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真菌是天然产物的重要来源之一,目前已从中挖掘了包括抗菌药物青霉素在内的大量药源分子。随着大规模化学筛选的开展,从普通真菌资源中发现结构新颖与活性显著的次级代谢产物的概率逐渐变低。因此,独特生境来源的真菌资源成为新活性化合物研究的热点[1]。
植物病原真菌是一种潜在的植物内生真菌,一方面需抵御植物自身防御机制,另一方面需应对外界复杂环境及其他竞争者,是一类特殊生境的真菌类群,因而具有产生结构新颖化合物的潜力[2−4]。LIU等[5]从小麦Triticum aestivum病原真菌平脐蠕孢属真菌Bipolaris sp. TJ403-B1中分离得到一系列新骨架的蛇孢假壳素(ophiobolin)类似物(bipolarolides A~G);KUMARIHAMY等[6]从植物病原菌Septoria pistaciarum中分离得到具有抗疟、抑菌活性的化合物;LI等[7]和WANG 等[8]从小麦病原真菌小麦根腐离蠕孢Bipolaris sorokiniana中分离得到具有显著植物促生长活性和植物毒活性的倍半萜类化合物,进一步印证了植物病原真菌的代谢潜力。
人参Panax ginseng红皮病菌Rhexocercosporidium panacis是导致人参红皮病的病原真菌,病害主要发生在人参根部,会形成大小不一、形状不规则的红色病斑,影响人参的产量及品质,造成严重的经济损失[9−10]。目前尚未有关于人参红皮病菌次级代谢产物研究的相关报道。为探明该菌株代谢潜力,本研究选择人参红皮病菌作为研究材料,对其大米发酵产物乙酸乙酯提取部位进行化学成分研究,首次从中分离得到了9种单体化合物,并对其抗氧化活性与植物毒活性进行初步研究。
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人参红皮病菌菌株购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心(菌种保藏编号CGMCC3.17260)。
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核磁共振仪:Bruker AM 600 (布鲁克科技有限公司,德国),制备型色谱柱:YMC ODS-A (250 mm×10 mm,5 μm,岛津实验器材有限公司,日本),高效液相色谱仪Agilent 1200 (安捷伦科技有限公司,美国),半制备液相色谱仪:LC-52 (赛谱锐思科技有限公司,中国),TG16-WS高速离心机 (湘潭湘仪仪器有限公司,中国),KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司,中国),鼓风式干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司,中国),暗箱式紫外分析仪(上海市宝山顾村电光仪器厂,中国)。色谱甲醇(赛默飞世尔科技,美国),石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇、丙酮等其他试剂(北京化学试剂公司,中国),制备薄层层析硅胶(上海彭腾精细化工有限公司,中国),Sephadex LH-20 (法玛西亚公司,瑞典)。
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PDA培养基配方:马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂粉20 g,去离子水1 000 mL;大米固体培养基配方:每60 g大米加入80 mL去离子水置于500 mL锥形瓶中。
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人参红皮病菌菌种接种在PDA培养基上,20 ℃条件下静置培养10 d,再用接种针将其转接种于含大米培养基的500 mL锥形瓶中(121 ℃,30 min 高压灭菌锅灭菌),25 ℃静置培养2周。共发酵80瓶。
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菌株发酵结束后,向锥形瓶中加300 mL乙酸乙酯进行萃取,合并乙酸乙酯相,此操作重复3次,减压浓缩得到乙酸乙酯部位总膏(30 g)。乙酸乙酯粗提物(30 g)经正相硅胶柱粗分划段,以石油醚∶丙酮(体积比为1∶0~0∶1)梯度洗脱,依据薄层色谱法检测合并得到8个组分(Fr.1~Fr.8)。Fr.2 (500 mg)经重结晶得到化合物1 (5 mg)。Fr.3 (2.3 g)经正相硅胶柱层析,以石油醚∶丙酮(体积比为80∶1~3∶1)继续分离得到4个组分(Fr.3.1~Fr.3.4)。Fr.3.2经Sephadex LH-20 (甲醇为洗脱剂)分离得5个组分Fr.3.2.1~Fr.3.2.5,其中Fr.3.2.5经半制备液相色谱(甲醇/水,体积分数为51%甲醇,流速2 mL·min−1)纯化得到化合物4 [3.5 mg,保留时间(tR)为20 min]。Fr.3.3以丙酮为洗脱剂经凝胶柱 (Sephadex LH-20)分离得到7个组分Fr.3.3.1~Fr.3.3.7,其中Fr.3.3.3有结晶析出,通过重结晶及半制备液相(甲醇/水,体积分数为98%甲醇,流速2 mL·min−1)纯化得到化合物2 (2.4 mg,tR=19 min)和化合物3 (9.3 mg,tR=23 min)。Fr.3.3.7经半制备液相(甲醇/水,0~5 min,体积分数为40%甲醇;5~35 min,体积分数为40%~80%甲醇,流速2 mL·min−1)纯化得到化合物6 (2.5 mg,tR=31 min)。Fr.5 (1.3 g)经正相硅胶柱层析,以二氯甲烷∶甲醇(体积比为50∶1~0∶1)梯度洗脱得Fr.5.1~Fr.5.6,其中Fr.5.3经Sephadex LH-20 (二氯甲烷∶甲醇体积比为1∶1)分离得到Fr.5.3.1~Fr.5.3.6。Fr.5.3.5经过Sephadex LH-20 (二氯甲烷∶甲醇体积比为1∶1)分离得Fr.5.3.5.1~ Fr.5.3.5.4,其中Fr.5.3.5.3经半制备液相(甲醇/水,0~5 min,体积分数为50%甲醇;5~35 min,体积分数为50%~64%甲醇,流速2 mL·min−1)纯化得化合物8 (2.4 mg,tR=19 min),Fr.5.3.5.4经半制备液相(甲醇/水,0~5 min,体积分数为20%甲醇;5~30 min,体积分数20%~55%甲醇;30~50 min,体积分数为55%~70%甲醇,流速2 mL·min−1)纯化得化合物9 (2.4 mg,tR=32 min)、化合物5 (2.4 mg,tR=44 min)。Fr.6经Sephadex LH-20 (甲醇为洗脱剂)分离得到4个组分Fr.6.1~Fr.6.4,其中Fr.6.3经半制备液相处理(甲醇/水,0~5 min,体积分数为40%甲醇;5~30 min,体积分数为40%~60%甲醇,流速2 mL·min−1)纯化得到化合物7 (2.0 mg,tR=23 min)。
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采用1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基清除试验评价化合物1~9的抗氧化活性[11]。将待测化合物及阳性对照(维生素E,VE)配置成质量浓度梯度(200、100、80、60、40、20、10、5 mg·L−1),在96孔板中加入60 μL不同质量浓度的样品或VE,然后加入60 μL的0.1 mmol·L−1 DPPH甲醇溶液,振荡均匀,在黑暗中孵育2 h后,用酶标仪测定在517 nm处的吸光度,空白对照为60 μL DPPH加上60 μL甲醇。抑制率={[D(517)blank− D(517)sample]/D(517)blank}×100%。其中:D(517)blank为对照组60 μL甲醇与60 μL DPPH混合溶液吸光度,D(517)sample为60 μL样品与60 μL DPPH混合溶液吸光度。试验重复3次,以半清除率(IC50,DPPH自由基清除率为50%时的样品浓度)为评价指标。
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参考文献[12]方法测定单体化合物4~9对离体人参根部的致病性。具体步骤如下:采集新鲜人参根,先用自来水清洗,去除泥土并摒弃有瑕疵的根,接着用体积分数为75%乙醇对根部进行消毒,再用打孔器在根部中心位置制作3个孔洞后,将其放置在装有滤纸片的培养皿中(滤纸片已提前用无菌水浸润)。化合物用体积分数为75%乙醇配置成质量浓度为1 g·L−1的标准溶液。最后用移液枪分别吸取10 μL待测化合物标准溶液加入到人参3个孔洞中,封口膜密封后,在黑暗条件下,20 ℃孵育。体积分数为75%乙醇处理的人参根作为对照组,3 d后观察结果。
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运用多种分离技术从人参红皮病菌粗提物的乙酸乙酯部位纯化得到9种单体化合物(图1),利用质谱及核磁共振波谱技术并结合文献数据比对,化合物结构鉴定结果如下:化合物1为麦角甾醇(ergosterol)、化合物2为过氧化麦角甾醇(5,8-epidioxy-5α,8α-ergosta-6,9,22E-tien-3β-ol)、化合物3为5,8-表二氧麦角甾醇-6,9(11),22-三烯-3-醇(5,8-epidioxy-5α,8α-ergosta-6,22E-dien-3β-ol)、化合物4为核桃酮(regiolone)、化合物5为4,6,8-三羟基-3,4-二氢-1(2H)-萘酮(4,6,8-trihydroxy-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-one)、化合物6为2,5-二甲基-7-羟基色酮(2,5-dimethyl-7-hydroxychromone)、化合物7为2-甲基-5-羧甲基-7-羟基色酮(2-methyl-5-carboxymenthyl-7-hydroxychromone)、化合物8为(+)-citreoisocoumarin和化合物9为de-O-methyldiaporthin。化学结构式如图1所示。
化合物1:无色晶体,基于1H-NMR图谱分析,高场区氢化学位移(δH)在1.20~2.50间有复杂重叠的烷基氢信号,并存在6个甲基信号,其中2个单峰甲基氢信号(δH=0.63和0.95),4个双峰甲基氢信号(δH=1.04、0.92、0.83、0.81),另在低场区化学位移δH=3.64处有个积分为1的多重峰氢信号,推测此处连接1个羟基;低场区存在2对烯烃质子信号,其中1对δH=5.21和5.19间的耦合常数为15.6,推测为环外侧链反式双键,基于以上特征推测化合物1为麦角甾醇类化合物。1H-NMR (CDCl3, 600 MHz):δH 5.57 (1H, d, J=6.0 Hz, H-7), 5.38 (1H, d, J=6.0 Hz, H-6), 5.21 (1H, dd, J=15.6, 7.2 Hz, H-23), 5.19 (1H, dd, J=15.6, 7.2 Hz, H-22), 3.64 (1H, tt, J=11.4, 4.2 Hz, H-3), 1.04 (3H, d, J=6.6 Hz, H-21), 0.95 (3H, s, H-19), 0.92 (3H, d, J=6.6 Hz, H-28), 0.83 (3H, d, J=6.6 Hz, H-27), 0.81 (3H, d, J=6.6 Hz, H-26), 0.63 (3H, s, H-18)。以上氢谱数据与文献[13]对比后确认此化合物为麦角甾醇。
化合物 2:无色晶体,其1H-NMR图谱发现与麦角甾醇相似。通过与文献[14]比对,确认该化合物为过氧化麦角甾醇。1H-NMR (CDCl3, 600 MHz): δH 6.58 (1H, d, J=8.4 Hz, H-6), 6.27 (1H, d, J=8.4 Hz, H-7), 5.41 (1H, d, J=6.0, 1.8 Hz, H-11), 5.22 (1H, dd, J=15.6, 7.8 Hz, H-23), 5.14 (1H, dd, J=15.6, 8.4 Hz, H-22), 4.00 (1H, m, H-3), 1.08 (3H, s, 19-Me), 0.99 (3H, d, J=6.6 Hz, 21-Me), 0.90 (3H, d, J=6.6 Hz, 28-Me), 0.82 (3H, d, J=6.6 Hz, 26-Me), 0.81 (3H, d, J=6.6 Hz, 27-Me), 0.72 (3H, s, 18-Me)。
化合物3:无色晶体,其1H-NMR谱图与过氧化麦角甾醇高度相似,主要区别在化学位移δH=5.41处的氢信号消失,推测双键被还原。通过与文献[14]比对,确认此化合物为5,8-表二氧麦角甾醇-6,9(11),22-三烯-3-醇。1H-NMR(CDCl3, 600 MHz): δH 6.50 (1H, d, J=8.4 Hz, H-6), 6.24 (1H, d, J=8.4 Hz, H-7), 5.22 (1H, dd, J=15.6, 7.8 Hz, H-23), 5.14 (1H, dd, J=15.6, 8.4 Hz, H-22), 3.96 (1H, m, H-3), 0.99 (3H, d, J=6.6 Hz, 21-Me), 0.90 (3H, d, J= 6.6 Hz, 28-Me), 0.88 (3H, s, 19-Me), 0.83 (3H, d, J=6.6 Hz, 26-Me), 0.81 (3H, d, J=6.6 Hz, 27-Me), 0.81 (3H, s, 18-Me)。
化合物4:黄色粉末,低分辨质谱数据质荷比(m/z)为179.07,[M+H]+。1H-NMR谱图(图2)显示在低场区有3个氢质子信号,δH=7.50 (1H,t,J=7.8 Hz),7.02 (1H,dd,J=7.8,1.2 Hz),6.93(1H,dd,J=7.8,1.2 Hz),推测化合物含苯环结构;低场区化学位移δH=12.89处的尖单峰结合13C-NMR谱图(图3)中碳化学位移(δC) = 204.4,推测为与羰基形成分子内氢键的活泼氢信号;化学位移δH=4.92的1个双峰氢信号暗示此处可能连接1个羟基。另外,高场区有2对相互耦合的亚甲基信号(δH=3.00,2.65和δH=2.35,2.20),基于以上数据推测化合物4为芳香类化合物。1H-NMR (CDCl3, 600 MHz): δH 12.89 (1H, 8-OH, s), 7.50 (1H, t, J=7.8 Hz, H-6), 7.02 (1H, dd, J=7.8, 1.2 Hz, H-5), 6.93 (1H, dd, J=7.8, 1.2 Hz, H-7), 4.92 (1H, dd, J=7.8, 3.6 Hz, H-4), 3.00 (1H, ddd, J=18.0, 8.4, 4.8 Hz, H-2a), 2.65 (1H, ddd, J=18.0, 8.4, 4.8 Hz, H-2b), 2.35 (1H, m, H-3a), 2.20 (1H, m, H-3b)。13C-NMR (CDCl3, 150 MHz):δC 204.4 (C-1), 34.7 (C-2), 31.4 (C-3), 67.9 (C-4), 146.0 (C-4a), 117.9 (C-5), 137.1 (C-6), 117.5 (C-7), 162.9 (C-8), 115.4 (C-8a)。以上核磁数据与文献[15]中的核桃酮基本一致。
化合物5:黄色粉末,低分辨质谱数据m/z =195.09,[M+H]+。化合物5的1H-NMR谱图与化合物4高度相似,主要区别在化学位移δH=6.00~8.00范围内少1个芳香氢信号,且剩下2个芳香氢δH=6.64和6.22之间耦合常数为1.8,判断这2个氢在苯环上处于间位。对比化合物4,化合物5的芳香氢化学位移向高场移动,结合碳谱数据分析,发现化合物5比化合物4多了1个δC在166.5处的碳信号,推测为双键连氧的碳信号,即苯环上新增的取代基为羟基。1H-NMR(Acetone-d6, 600 MHz):δH 12.89 (1H, s, 8-OH), 6.64 (1H, d, J=1.8 Hz, H-5), 6.22 (1H, d, J=1.8 Hz, H-7), 4.78 (1H, dd, J=9.0, 4.2 Hz, H-4) , 2.75 (1H, m, J=17.4, 6.0, 4.8 Hz, H-2a), 2.61 (1H, m, H-2b ), 2.26 (1H, m, H-3a), 2.03 (1H, m, H-3b)。13C NMR(Acetone-d6, 150 MHz):δC 203.1 (C-1), 166.5 (C-6), 166.1 (C-8), 151.5 (C-4a), 109.9 (C-8a), 106.9 (C-5), 102.1 (C-7), 68.0 (C-4), 35.6 (C-2), 32.7 (C-3)。以上核磁共振数据与文献[16]中的4,6,8-三羟基-3,4-二氢-1(2H)-萘酮基本一致。
化合物6:黄色粉末,低分辨质谱数据m/z =191.10,[M+H]+。1H-NMR谱图显示在低场区δH=6.68和6.67处有2个互相耦合的氢信号,结合耦合常数2.4可知为苯环上处于间位的氢,表明化合物6存在被4个取代基取代的苯环结构;化学位移δH=5.92推测为单峰烯烃质子信号,结合13C-NMR谱图中δC=179.3、164.5和117.5等3处的碳化学位移推测化合物含α,β-不饱和酮结构;高场区存在2个单峰甲基氢信号(δH=2.70和2.28),根据化学位移值推测这2个甲基分别连接在苯环和双键上。基于以上数据推测化合物6为色酮类化合物。1H-NMR(Acetone-d6, 600 MHz): δH 9.37 (7-OH, s), 6.68 (1H, d, J=2.4 Hz, H-8), 6.67 (1H, d, J=2.4 Hz, H-6), 5.92 (1H, s, H-3), 2.70 (3H, s, 5-CH3), 2.28 (3H, s, 2-CH3)。13C-NMR(Acetone-d6, 150 MHz):δC 179.3 (C-4), 164.5 (C-2), 161.5 (C-7), 158.4 (C-9), 142.4 (C-5), 117.5 (C-3), 115.0 (C-10), 111.8 (C-6), 101.5 (C-8), 22.8 (5-CH3), 19.7 (2-CH3)。以上核磁共振数据与文献[17]中的2,5-二甲基-7-羟基色酮基本一致。
化合物7:黄色粉末,低分辨质谱数据m/z =235.09,[M+H]+。化合物7的1H-NMR谱图与化合物6的相似,主要区别在于苯环上取代的甲基信号(δH=2.70)消失,多了1个单峰亚甲基信号(δH=4.10),结合13C-NMR谱图新出现的信号δC=175.9,推测此处由甲基取代变为羧甲基取代。1H-NMR (CD3OD, 600 MHz):δH 6.75 (1H, d, J=2.4 Hz, H-8), 6.69 (d, J=2.4 Hz, 1H, H-6), 6.01 (1H, s, H-3), 4.10 (2H, s, 5-CH2), 2.34 (3H, s, 2-CH3)。13C-NMR(CD3OD, 150 MHz): δC 167.5 (C-2), 119.3 (C-3), 181.5 (C-4), 115.2 (C-4a), 139.6 (C-5), 175.9 (-COOH), 111.7 (C-6), 163.7 (C-7), 102.8 (C-8), 160.7 (C-8a), 21.1 (2-CH3), 42.3 (5-CH2)。以上核磁共振数据与文献[18]中的2-甲基-5-羧甲基-7-羟基色酮基本一致。
化合物8:无色晶体,低分辨质谱数据m/z =279.13,[M+H]+。基于1H-NMR谱图分析,低场区(δH=6.41和6.37)处有2个互相耦合的氢信号,耦合常数为2.4,推测为苯环上间位取代的氢。化学位移(δH=11.14)处存在1个积分为1的氢信号,推测为形成分子内氢键的活泼氢信号, 13C-NMR谱图(δC=167.1)处的碳信号可能为酯羰基信号,结合烯烃单峰质子信号(δH=6.41)推测化合物8为异香豆素类结构。1H-NMR(Acetone-d6, 600 MHz): δH 11.14 (1H, s, 8-OH), 6.43 (1H, s, H-4), 6.41 (1H, d, J=2.4 Hz, H-5), 6.37 (1H, d, J=2.4 Hz, H-7), 4.47 (1H, tt, J=7.8, 4.8 Hz, H-2′), 2.70 (1 H, m, H-3′a, overlapped), 2.70 (1H, m, H-1′a, overlapped), 2.68 (1H, m, H-3′b), 2.60 (1H, dd, J=14.4, 8.4 Hz, H-1′b), 2.15 (3H, s, 5′-CH3), 13C-NMR:(Acetone-d6,150 MHz):δC 167.1 (C-1), 155.7 (C-3), 106.8 (C-4), 103.6 (C-5), 167.1 (C-6, overlapped), 102.5 (C-7), 164.5 (C-8), 99.6 (C-9), 140.8 (C-10), 41.9 (C-1′), 66.1 (C-2′), 50.7 (C-3′), 207.5 (C-4′), 30.6 (C-5′)。以上核磁共振数据与文献[19]中的(+)-citreoisocoumarin基本一致。
化合物9:无色晶体,低分辨质谱数据m/z =237.11,[M+H]+。 化合物9的1H-NMR谱图与化合物8高度相似,表明为同类型化合物,主要区别在化合物9的1H-NMR谱图中少了1个单峰甲基信号(δH=2.15),多了1个双峰甲基信号,结合碳谱数据对比发现化合物9比化合物8少了2个碳信号,其中包括1个羰基碳信号(δC=207.5),推测化合物9比化合物8少了侧链上的乙酰基。1H-NMR(Acetone-d6, 600 MHz): δH 11.16 (1H, s, 8-OH), 6.43(1H, s, H-4), 6.41(d, J=1.8 Hz, 1H, H-5), 6.37(1H, d, J=1.8 Hz, H-7), 4.17(1H, m, H-2′), 2.61(1H, dd, J=14.4, 4.8 Hz, H-1′a), 2.56(1H, dd, J=14.4, 7.8 Hz, H-1′ b), 1.23(3H, d, J=6.0 Hz, 3′-CH3)。13C-NMR(Acetone-d6, 150 MHz): δC 167.1 (C-1), 156.5 (C-3), 106.4 (C-4), 103.4 (C-5), 166.5 (C-6), 102.3 (C-7), 164.5 (C-8), 99.8 (C-9), 140.9 (C-10), 43.9 (C-1′), 65.5 (C-2′), 23.7 (C-3′)。以上核磁共振数据与文献[20]中的de-O-methyldiaporthin基本一致。
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抗氧化实验结果表明:与对照组VE相比,化合物1~9的DPPH自由基清除效果不显著,无抗氧化活性(表1)。人参根部植物毒活性实验结果发现:化合物4~9处理的人参根部与对照组(体积分数为75%乙醇)对比无明显差异(图4),表面均无病斑出现,表明化合物4~9对人参根部无植物毒活性。
表 1 化合物1~9的抗氧化活性
Table 1. Antioxidant activity of compounds 1−9
化合物 IC50/(mg·L−1) 化合物 IC50/(mg·L−1) 1 ≥100 6 ≥100 2 ≥100 7 ≥100 3 ≥100 8 ≥100 4 ≥100 9 ≥100 5 ≥100 VE 9.072 -
本研究对人参红皮病菌次级代谢产物进行了初步研究。通过多种色谱分离技术首次从人参红皮病菌的大米发酵物中分离得到9种化合物,并通过质谱分析、核磁共振波谱分析等技术对化合物结构进行了鉴定。其中化合物1~3为麦角甾醇类化合物,4~9为聚酮类化合物。文献报道[21]:5,8-表二氧麦角甾醇-6,9(11),22-三烯-3-醇对脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞RAW264.7产生一氧化氮(NO)具有中等抑制作用,表明该化合物具有一定抗炎活性。核桃酮和4,6,8-三羟基-3,4-二氢-1(2H)-萘酮都属于萘酮类化合物,其中核桃酮对莴苣Latuca sativa、萝卜Raphanus sativus、黄瓜Cucumis sativus、洋葱Allium cepa和小麦种子萌发和幼苗生长的植物毒性研究结果表明:在低浓度时会刺激生长,高浓度时具有抑制作用[22];而4,6,8-三羟基-3,4-二氢-1(2H)-萘酮从多种真菌的次级代谢产物中分离得到过[23−26],该化合物具有一定的抗真菌和抗细菌活性,对白色念珠菌Candida albicans和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis有中等抑制作用[27]。2009年周永平等[16]首次报道了萘酮类化合物核桃酮和4,6,8-三羟基-3,4-二氢-1(2H)-萘酮具有杀线虫活性。2,5-二甲基-7-羟基色酮与2-甲基-5-羧甲基-7-羟基色酮属于色酮类化合物,结构中的色酮环常作为关键药效基团应用于药物设计[27]。2,5-二甲基-7-羟基色酮还具有抑制生物膜形成的能力,对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌有强抑制作用(抑制率达70%~80%),对大肠埃希菌Escherichia coli和铜绿假单孢菌Pseudomonas aeruginosa等革兰氏阴性菌有中等抑制作用(抑制率为40%~60%) [28]。(+)-citreoisocoumarin具有抗菌活性,能抑制金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和大肠埃希菌的生长;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)评价结果表明:(+)-citreoisocoumarin对2株癌细胞系(MDA-MB-231,HCT 116)具有中等抑制作用[29]。本研究也评价了所分离化合物的抗氧化活性和植物毒活性,结果显示:化合物1~9未表现出抗氧化活性,所测化合物4~9对离体人参根部没有植物毒活性。
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本研究虽然未从人参红皮病菌发酵物中获得对人参根部有植物毒活性的化合物,但从中分离得到的化合物具有多种生物活性,表明该菌株仍具有发现活性化合物的潜力。未来,可以通过大规模发酵或改变发酵条件,进行深入的化学成分分析、分离与结构鉴定,以挖掘得到更多活性化合物,丰富该菌的次级代谢产物种类,也为人参红皮病菌病害致病因子研究提供研究基础。
Chemical components of Rhexocercosporidium panacis from Panax ginseng
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摘要:
目的 对人参Panax ginseng红皮病菌Rhexocercosporidium panacis次级代谢产物进行研究,以期发现活性化合物,并为后期人参红皮病致病机理的研究提供化学物质基础。 方法 通过大米固体发酵方式获得人参红皮病菌粗提物,对粗提物采用硅胶柱层析、反向硅胶柱层析(ODS)、凝胶柱层析(Sephadex LH-20)、半制备液相等多种方法进行分离纯化获得单体化合物,再基于质谱、核磁共振谱方法,并结合文献数据比对鉴定单体化合物结构。最后采用1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基清除法评价9种单体化合物的抗氧化活性,并对其中的6种化合物进行初步的植物毒活性评价。 结果 从人参红皮病菌粗提物乙酸乙酯部位分离得到9种化合物,其中3种甾醇类:化学物1为麦角甾醇(ergosterol)、化合物2为过氧化麦角甾醇(5,8-epidioxy-5α,8α-ergosta-6,9,22E-tien-3β-ol)、化合物3为5,8-表二氧麦角甾醇-6,9(11),22-三烯-3-醇(5,8-epidioxy-5α,8α-ergosta-6,22E-dien-3β-ol);6种聚酮类:化合物4为核桃酮(regiolone)、化合物5为4,6,8-三羟基-3,4-二氢-1(2H)-萘酮(4,6,8-trihydroxy-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-one)、化合物6为2,5-二甲基-7-羟基色酮(2,5-dimethyl-7-hydroxychromone)、化合物7为2-甲基-5-羧甲基-7-羟基色酮(2-methyl-5-carboxymenthyl-7-hydroxychromone)、化合物8为(+)-citreoisocoumarin、化合物9为de-O-methyldiaporthin。活性试验结果表明:化合物1~9无抗氧化活性,化合物4~9对人参根部未表现出致病性。 结论 化合物1~9为首次从人参红皮病菌中分离得到,丰富了该菌种的次级代谢产物数据库。其中化合物4~9表现出多种生物活性,但在植物毒活性评价中未能使离体人参根部致病。图4表1参29 Abstract:Objective The aim is to study the secondary metabolites of Rhexocercosporidium panacis, so as to discover new active compounds and to provide a chemical basis for later research on the pathogenesis of R. panacis. Method The crude extracts of R. panacis were obtained through solid fermentation of rice, and purified by silica gel column chromatography, reversed silica gel column chromatography (ODS), Sephadex LH-20, and semi-preparative liquid chromatography to gain monomeric compounds. The structure of monomeric compounds was identified based on mass spectrometry, nuclear magnetic resonance spectroscopy, and literature data comparison. The antioxidant activities of 9 compounds were tested by DPPH radical scavenging method and the preliminary phytotoxic activity of compounds 4−9 was evaluated. Result 9 compounds were isolated from R. panacis, including three sterols: ergosterol (1), 5,8-epidioxy-5α,8α-ergosta-6,9,22E-tien-3β-ol (2), and 5,8-epidioxy-5α,8α-ergosta-6,22E-dien-3β-ol (3), and six polyketides: regiolone (4), 4,6,8-trihydroxy-3,4-dihydronaphthalene-1(2H)-one (5), 2,5-dimethyl-7-hydroxychromone(6), 2-methyl-5-carboxymenthyl-7-hydroxychromone (7), (+)-citreoisocoumarin (8), and de-O-methyldiaporthin (9). Compounds 1−9 exhibited no antioxidant activity and 4−9 did not display phytotoxic effects on ginseng roots. Conclusion Compounds 1−9 are isolated for the first time from R. panacis, enriching the database of secondary metabolites of this strain. Among them, compounds 4−9 exhibit various biological activities, but do not cause lesions in the isolated ginseng roots in the evaluation of phytotoxic activity. [Ch, 4 fig. 1 tab. 29 ref.] -
Key words:
- Panax ginseng /
- Rhexocercosporidium panacis /
- sterol /
- polyketides /
- biological activities
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杜鹃群落是以杜鹃属Rhododendron植物为优势种的植被类型,主要分布于中国西南地区海拔较高的山地[1]。全世界杜鹃属植物约960种,中国约650种,是杜鹃属分布中心,也是杜鹃花生物多样性最高的国家,除新疆地区之外,全国其他省(市、自治区)均有分布,其中以西南地区分布最为广泛。贵州省是杜鹃原生种分布区数量最多的省份之一,是杜鹃花中国中心分布区向外扩张的过渡地带,有着丰富的原生种和大量可能的新种和变种[2]。有关学者先后对杜鹃植物开展了种子萌发特性、形态解剖、抗旱评价、引种驯化、繁殖利用、群落特征以及多样性保护及保育研究[3-5]。但对于杜鹃群落生物多样性的研究较少,尤其采用群落数量分类学方法对杜鹃群落生物多样性研究鲜有报道。采用群落数量分类方法结合群丛特性进行分析,能够定量解析群丛特性、组成特点,更加准确地反映杜鹃与其他植物种类间的关系。在对退化杜鹃群落进行恢复中,以群丛为单位进行恢复,提高了其可操作性。本研究选择贵阳市乌当区万亩杜鹃群落作为研究对象,采用典型样地调查、群落数量分类及多样性分析等方法展开研究,旨在筛选出万亩杜鹃群落生物多样性最高的群丛,为杜鹃群落生物多样性保护提供技术指导,奠定理论基础。
1. 材料与方法
1.1 研究区域概况
本研究选择贵阳市乌当区典型杜鹃群落为研究对象。乌当区位于贵阳市东北部,属贵阳城市规划的9个组团之一,地处26°55′~26°33′N,106°30′~107°03′E。乌当区属亚热带季风湿润气候,具有明显的高原性气候的特点,冬无严寒,夏无酷暑,光、热、水同季,垂直气候差异明显,年平均降水量1 179.8~1 271.0 mm。年平均气温14.6 ℃。森林覆盖率达49.36%。由于地形、地貌类型多样,形成多种小气候,宜于农业生产,大部分地区可满足农作物1 a 2熟,蔬菜1 a 3~4熟的需要。主要灾害性天气有干旱、倒春寒、冰雹、秋季连阴雨、秋风、凝冻[6]。区境内河流均属于长江流域乌江水系,河床狭窄,比降大,流速较快。全区土壤为黄壤区,黄棕壤、石灰土、紫色土和冲积土[7]。植被属于黔中山原湿润性灰岩常绿栎林、常绿落叶混交林及马尾松Pinus massoniana林区,主要树种有青栲Cyclobalanopsis glauca,丝栗栲Castanopsis fargesii,细叶青冈栎Cyclobalanopsis gracilis,柞木 Quercus mongolica等,落叶树种有枫香Liquidambar formosana,光皮桦 Betula luminifera等。次生植被有大面积天然牧草和灌丛草坡[8-9]。
1.2 研究方法与材料
采用典型样地调查法,对贵阳市乌当区杜鹃群落进行调查。在贵阳市乌当区杜鹃群落分布区域随机布设调查样点15处,分别在每个调查样点区域内随机设置10 m × 10 m典型群落调查样方3个,共计调查样方45个,统计每个调查样方内的植物种类、生活型、密度、高度、盖度、频度等群落特征指标,用于群落数量分类与多样性等指标的计算。
1.3 统计分析
贵阳乌当杜鹃群落调查数据统计分析与整理,均采用SPSS 18.0软件和Microsoft Office Excel 2007软件完成。
1.3.1 群落数量分类
结合《中国植被》和实际生态学意义,采用TWINSPAN分类法,对贵阳乌当杜鹃群落进行群落数量分类。
1.3.2 重要值
采用重要值(Ⅵ,对贵阳乌当杜鹃群落进行分析,计算公式[10-11]:
$I{V_{Ii}} = \left( {\frac{{{D_i}}}{{\sum {{D_i}} }} + \frac{{{F_i}}}{{{{\sum F }_i}}} + \frac{{{C_i}}}{{\sum {{C_i}} }}} \right) \div 3 \times 100\% $
其中: VIi表示第i种物种的重要值;Di表示第i种物种的密度;Fi表示第i种物种的频度;Ci表示第i种物种的盖度(乔木层中Ci表示第i中物种的显著度)。
1.3.3 α多样性测度
采用Margalef指数、Simpson指数和Shannon-Wiener指数对贵阳乌当杜鹃群落物种多样性进行分析,计算公式为[10-13]:
$\begin{array}{l} {\rm{M}}\arg {\rm{alef}}指数R = \frac{{S - 1}}{{\ln N}};\\ {\rm{Simpson}}指数D = \sum\limits_{i = 1}^s {{{({p_i})}^2}} ;\\ {\rm{Simpson}} - {\rm{Wiener}}指数H = - \sum\limits_{i = 1}^s {({p_i}ln{p_i})} \end{array}。$
其中:S表示植被群落中物种数目,N表示群丛中全部物种个体总数,Pi为第i种的相对重要值。
1.3.4 均匀性测度
采用Pielou均匀性指数对贵阳乌当杜鹃群落进行分析,计算公式为[11]:
${\rm{Pielou}}均匀性指数E = \frac{H}{{\ln S}}。$
其中:H 表示Shannon-Wiener多样性指数,S表示植被群落中物种数目。
2. 结果与分析
2.1 万亩杜鹃群落分类
采用TWINSPAN分类法,对贵阳乌当杜鹃群落15个调查样点进行等级分类,经过4次划分,得到为4组。结合《中国植被》和实际生态意义,采用第4级的分类结果,将贵阳乌当杜鹃群落划分为4组(图 1),结合分类将4个组命名为4个植物群丛。群丛Ⅰ:锈叶杜鹃Rhododendron siderophyllum+白栎Quercus fabrei群丛,包括样点2和样点6。群丛Ⅱ:锈叶杜鹃+白栎+麻栎Quercus acutissima群丛,包括样点1,样点4,样点9,样点3,样点5和样点7。群丛Ⅲ:锈叶杜鹃+麻栎群丛,包括样点10,样点12,样点13和样点15号。群丛Ⅳ:锈叶杜鹃+麻栎+藤黄Garcinia hanburyi群丛,包括样点8,样点11和样点14。
表 1 贵阳乌当杜鹃群丛重要值特征Table 1. Important values trait of the Rhododendron communities in Wudang,Guiyang科名 种名 生活型 重要值 群丛I 群丛Ⅱ 群丛Ⅲ 群丛Ⅳ 杜鹃花科Ericaceae 镑叶杜鹃Rhododendron siderophyllum S 48.72 29.80 36.23 48.74 杜鹃花科Ericaceae 小果南烛Lyonia ovalifolia S 6.02 5.51 5.26 — 杜鹃花科Ericaceae 映山红Rhododendron S 7.32 8.12 8.27 4.66 壳斗科Dagaceae 麻栋Quercus acutissima T 8.91 28.55 11.34 10.28 壳斗科Dagaceae 栲 Castanopsis fargesii T — 3.55 5.80 0.80 壳斗科Dagaceae 白栋Quercus fabrei S 13.66 11.45 1.90 7.90 禾本科Gramineae 五节芒 Miscanthus floridulus P — 0.17 — — 禾本科Gramineae 茅叶荩草 Arthraxon lanceolatus P — — 0.64 — 禾 本 科 Gramineae 芒 Miscanthus sinensis P — — 0.88 1.04 蕨科 Pteridiaceae 蕨 Pteridium aquilinum P — 1.32 2.13 — 蕨科 Pteridiaceae 密毛蕨 Pteridium reyolutum P — — 0.76 5.07 桑科 Moraceae 小构树 Broussonetia CasinoCi S — — 0.40 — 桑科 Moraceae 專草 Humulus scandens P — — 0.67 — 藤黄科 Guttiferae 藤黄 Farcinia hanburyi T — — — 8.82 藤黄科 Guttiferae 金丝桃 Hypericum monogynum S — 1.11 — — 百合科Liliaceae 拔葜 Smilax china CS 0.67 8.34 — — 车前科 Plantaginaceae 车 前 草 Plantago asiatica P — — 0.37 — 豆科 Leguminosae 三叶崖豆藤 Millettia unijuga CS — 1.39 — — 金缕梅科 Hamamelidaceae 枫香 Liquidambar formosana T — — — 2.23 菊科 Compositae 艾蒿 Artemisia vulgaris P — — 0.46 — 茜草科Rubiaceae 鸡矢藤 Paederia scandens CS — — 1.19 — 蔷薇科Rosaceae 插田泡Rubus coreanus S — — 1.52 2.88 忍冬科 Caprifoliaceae 珍珠荚莲 liburnum/oetidum S 3.88 — 7.40 — 莎草科 Cyperaceae 莎 草 Cyperus rotundus P — 0.34 — — 山茶科Theaceae 怜木 Juryajaponica S 3.33 — 5.96 4.36 杉科 Taxodiaceae 杉木 Cunninghamia lanceolata T 7.50 — — — 石松科 Lycopodiaceae 石松 Lycopodium clavatum P — — 2.71 — 石竹科 Caryophyllaceae 银柴胡 Fypsophilaoldhamiana P — — 0.37 — 五加科 Araliaceae 檧木 Aralia chinensis S — — 5.75 2.53 虎耳草科 Saxifragaceae 滇鼠刺 Ktea ilicifolia S — 0.36 — — 苋科 Amaranthaceae 牛漆 Achyranthes bidentata P — — — 0.69 说明:共计植物31种,其中群丛Ⅰ9种,群丛Ⅱ13种,群丛Ⅲ21种,群丛Ⅳ13种。“—”表示该样地中未发现该种植物;“T”表示乔木植物(tree);“P”表示多年生植物(perennial plant);“S”表示灌木(shrubbery);“CS”表示攀援灌木(climbing shrub)。 2.2 乌当杜鹃群落数量特征
群丛Ⅲ中,杜鹃花科Ericaceae,壳斗科Fagaceae分别共出现3种植物,分别占群丛出现种的14.29%;禾本科Gramineae,蕨科Pteridiaceae,桑科Moraceae分别出现2种植物,分别占群丛出现种的9.52%,其他科共出现9种植物,占群丛出现种的42.86%。群丛Ⅳ中,壳斗科出现3种植物,占群丛出现种的23.08%,杜鹃花科出现2种植物,占群丛出现种的15.38%;其他科共出现7种植物,占群丛出现种的53.85%。
对贵阳乌当杜鹃群落植物生活型分析发现,乔木植物5种,占群落出现种的16.13%;灌木植物14种(其中攀援灌木植物3种,占群落出现种的9.68%),占群落出现种的45.16%;草本植物12种(均为多年生草本植物)占群落出现种的38.71%。对贵阳乌当杜鹃群落4种群丛植物组成生活型分析发现,群丛Ⅰ中共出现9种植物,其中乔木2种,占群丛出现植物种的22.22%;灌木植物7种(其中攀援植物1种,占群丛出现种的11.11%),占群丛出现种的77.78%;群丛中未出现草本植物种类。群丛Ⅱ中共出现13类植物,其中乔木2种,占群丛出现植物种的15.38%;灌木植物8种(其中攀援植物2种,占群丛出现种的15.38%),占群丛出现种的61.54%;草本植物3种,占群丛出现种的23.08%。群丛Ⅲ中共出现21种植物,其中乔木2种,占群丛出现植物种的9.52%;灌木植物10种(其中攀援植物1种,占群丛出现种的4.76%),占群丛出现种的47.62%;草本植物9种,占群丛出现种的42.86%。群丛Ⅳ中共出现13种植物,其中乔木4种,占群丛出现植物种的30.77%;灌木植物6种,占群丛出现种的46.15%;草本植物3种,占群丛出现种的23.08%。
对贵阳乌当杜鹃群丛植物重要值分析发现,群丛Ⅰ中,锈叶杜鹃重要值最高,为48.72%,白栎次之,为13.66%;群丛Ⅱ中,锈叶杜鹃重要值最高,为29.80%,麻栎次之,为28.55%,白栎重要值为11.45%;群丛Ⅲ中,锈叶杜鹃重要值最高,为36.23%,麻栎次之,为11.34%;群丛Ⅳ中,锈叶杜鹃重要值最高,为48.74%,麻栎次之,为10.28%。
综上所述,乌当杜鹃群落是以锈叶杜鹃为主,白栎、麻栎为辅的群落类型。
2.3 杜鹃群落α多样性分析
贵阳乌当杜鹃群落Margalef丰富度指数分析如表 2所示。Margalef丰富度指数从高到低的变化趋势为群丛Ⅲ(4.714),群丛Ⅱ(3.306),群丛Ⅳ(3.081),群丛Ⅰ(2.111)。
表 2 贵阳乌当杜鹃群落α多样性与均匀性指数特征Table 2. Index trait of α diversity and evenness of Rhododendron communities in Wudang,Guiyang群丛 R D H E Ⅰ 2.111 0.719 1.665 0.758 Ⅱ 3.306 0.798 1.873 0.730 Ⅲ 4.714 0.828 2.270 0.745 Ⅳ 3.081 0.729 1.830 0.714 贵阳乌当杜鹃群落Simpson多样性指数、Shannon-Wiener多样性指数分析如表 2所示。Simpson多样性指数从高到低的变化趋势为群丛Ⅲ(0.828),群丛Ⅱ(0.798),群丛Ⅳ(0.729),群丛Ⅰ(0.719);Shannon-Wiener多样性指数从高到低的变化趋势为群丛Ⅲ(2.270),群丛Ⅱ(1.873),群丛Ⅳ(1.830),群丛Ⅰ(1.665)。
贵阳乌当杜鹃群落Pielou均匀性指数分析如表 2所示。Pielou均匀性指数从高到低的变化趋势为群丛Ⅰ(0.758),群丛Ⅲ(0.745),群丛Ⅱ(0.730),群丛Ⅳ(0.714)。
综上所述,贵阳乌当杜鹃群落Margalef丰富度指数、Simpson多样性指数、Shannon-Wiener多样性指数均呈现出群丛Ⅲ>群丛Ⅱ>群丛Ⅳ>群丛Ⅰ的趋势,而Pielou均匀性指数则呈现出群丛Ⅰ>群丛Ⅲ>群丛Ⅱ>群丛Ⅳ。
3. 结论与讨论
3.1 结论
贵阳乌当杜鹃群落可分为4种植物群丛,依次为群丛Ⅰ:锈叶杜鹃+白栎群丛;群丛Ⅱ:锈叶杜鹃+白栎+麻栎群丛;群丛Ⅲ:锈叶杜鹃+麻栎群丛;群丛Ⅳ:锈叶杜鹃+麻栎+藤黄群丛。杜鹃群落主要以杜鹃科、壳斗科、禾本科植物为主;在贵阳乌当杜鹃群落中锈叶杜鹃种群占绝对优势,麻栎、白栎种群次之,因此,杜鹃群落主要是以锈叶杜鹃为主,麻栎、白栎为辅的植物群落结构类型。贵阳乌当杜鹃群丛Margalef丰富度指数、Simpson多样性指数、Shannon-Wiener多样性指数均呈现出群丛Ⅲ>群丛Ⅱ>群丛Ⅳ>群丛Ⅰ的趋势,而Pielou均匀性指数则呈现出群丛Ⅰ>群丛Ⅲ>群丛Ⅱ>群丛Ⅳ。贵阳乌当杜鹃群落多样性保护应当遵从群丛Ⅲ的植物结构类型进行保护,对群丛Ⅰ,群丛Ⅱ和群丛Ⅳ进行适当修复,使其结构接近群丛Ⅲ的结构类型。
3.2 讨论
本研究针对贵阳乌当万亩杜鹃林群落进行多样性研究,按植物群落的自然演替规律,该群落处于灌木或灌丛群落阶段,正向乔灌群落阶段演替,并非顶级群落及地带性植被类型,因此,处于不稳定阶段。目前,贵阳市乌当区想要打造万亩杜鹃林,作为贵阳城郊以观赏杜鹃花的休闲旅游区,但随着群落演替的进行,杜鹃群落的变化会直接影响旅游观光效果,因此,进一步研究贵阳乌当万亩杜鹃林最佳群落结构、物种组成、物种多样性、人工正向干扰或结构调整,对旅游观光效果及群落的相对稳定性有重要意义。正如黔西的百里杜鹃,目前观光效果很好,在长期人为正向干扰下,其群落结构具相对稳定性,但从物种多样性及演替规律来看,目前的结构是否为最佳,有待于进一步研究。
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表 1 化合物1~9的抗氧化活性
Table 1. Antioxidant activity of compounds 1−9
化合物 IC50/(mg·L−1) 化合物 IC50/(mg·L−1) 1 ≥100 6 ≥100 2 ≥100 7 ≥100 3 ≥100 8 ≥100 4 ≥100 9 ≥100 5 ≥100 VE 9.072 -
[1] ZHANG Xiaoyan, TAN Xiangmei, LI Yuanyuan, et al. Hispidulones A and B, two new phenalenone analogs from desert plant endophytic fungus Chaetosphaeronema hispidulum [J]. The Journal of Antibiotics, 2020, 73(1): 56 − 59. [2] EVIDENTE A, ANDOLFI A, CIMMINO A, et al. Ophiobolin E and 8-epi-ophiobolin J produced by Drechslera gigantea, a potential mycoherbicide of weedy grasses [J]. Phytochemistry, 2006, 67(20): 2281 − 2287. [3] MOLITOR D, LIERMANN J C, BERKELMANN-LÖHNERTZ B, et al. Phenguignardic acid and guignardic acid, phytotoxic secondary metabolites from Guignardia bidwellii [J]. Journal of Natural Products, 2012, 75(7): 1265 − 1269. [4] KOBORI H, SEKIYA A, SUZUKI T, et al. Bioactive sesquiterpene aryl esters from the culture broth of Armillaria sp. [J]. Journal of Natural Products, 2015, 78(1): 163 − 167. [5] LIU Mengting, SUN Weiguang, SHEN Ling, et al. Bipolarolides A−G: ophiobolin-derived Sesterterpenes with three new carbon skeletons from Bipolaris sp. TJ403-B1 [J]. 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