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沙棘Hippophae rhamnoides又名醋柳，是胡颓子科Elaeagnaceae沙棘属Hippophae的落叶性灌木[1]。作为药食同源植物的沙棘不仅在食疗、医药、农林牧渔等领域具有较大的经济价值，在水土保持、恢复生物链及防风固沙中也具有极大的生态价值[2-5]。生长过程中沙棘根部会遭受土壤中放线菌、细菌的侵染形成根瘤。部分菌种会在根瘤中高度富集发挥固氮、促生长、抵御逆境胁迫、防止有害病菌侵染等功能[6-8]。传统的微生物研究方法主要以培养基进行分离纯培养，再进而探究其培养特征、显微结构、生理特性等[9]。而自然界中90%以上的微生物为不可培养微生物，且现有培养基与培养技术不适应未知菌群的生长，或部分菌群生长缓慢、丰度较小等情况都会对菌群的多样性评估产生影响[10]。以二代高通量测序为基础的16S rDNA技术通过对编码原核核糖体小亚基rRNA的DNA序列进行测序，不仅克服了传统方法难以获得不可培养菌株的弊端，还能对样品中的物种相对丰度进行排序，并分析各群组样品中发挥重要作用的优势物种，解析样品中微生物之间的相互作用。该技术对研究沙棘根瘤内生菌微生物多样性与环境关系以及微生物资源的开发利用有重要的理论和现实意义[11-16]。
本研究通过16S rRNA测序技术对沙棘根瘤内生菌进行物种注释、分类学分析、α多样性分析、β多样性分析、组间差异显著性分析，比较高通量测序和纯培养方法的差异与优劣，为发掘具有应用价值的根瘤内生菌资源提供科学依据。
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采样地为内蒙古自治区巴彦淖尔市磴口县中国林业科学研究院沙漠林业实验中心试验林场(40°29′34″N，106°74′06″E)。该研究区海拔为1 054 m，年平均气温为7.4 ℃。2020年7月，选取人为干扰因素较少的沙漠边缘地带采集沙棘根瘤样品。在每个样地10 m×10 m的区域内用网格法定9个点，运用梅花形采样法在边角及中心共5个点分别采集根瘤样品并进行混合，共设计6组重复样，分别命名为M1、M2、M3、M4、M5、M6。
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依据文献[17-18]的方法进行修改，使其更加适宜沙棘根瘤内生菌的分离。详细步骤如下：选取新鲜饱满的根瘤，冲洗掉土粒泥沙，将根瘤团用解剖刀分割成带有单柄的瘤瓣，用纱布包裹，先用体积分数为95%的酒精溶液浸泡30 s，再用体积分数为10%的次氯酸钠溶液表面灭菌5 min，取出后用无菌水冲洗数次。在灭菌滤纸上，用无菌解剖刀先切取根瘤头部，再将其均分成2~3份薄片，置于固体培养基中28 ℃恒温暗处静置培养。根据相关研究，本研究选取BAP[19]、S[20]、JA[19]、高氏一号培养基[19]进行分离培养。
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提取纯培养的沙棘根瘤内生菌DNA后，对16S rDNA全长进行PCR扩增。序列引物采用YU等[21]设计的细菌通用引物(引物序列27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)，PCR总反应体系为50 μL，包括10×缓冲液(KOD buffer) 5 μL、2 mmol·L−1三磷酸脱氧核糖核苷酸混合液(dNTPs) 5 μL、基因组DNA (genomic DNA) 1 μL、上游引物(forward primer) (10 μm) 1 μL、下游引物(reverse primer) (10 μm) 1 μL、DNA聚合酶(KOD DNA polymerase) 1 μL、超纯水(ddH2O) 36 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳，确定有特异扩增后，进行PCR产物回收和测序注释，并参考文献[22-25]进行比对校验。
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提取沙棘根瘤总DNA后，根据16S rDNA保守区设计引物(引物序列335F：5′-CADACTCCTACGGGAGGC-3′，769R：5′-ATCCTGTTTGMTMCCCVCRC-3′)，在引物末端加上测序接头，便于建库时添加能区分样本的碱基序列的条码/索引(barcode/index)。再进行PCR扩增并对其产物进行紫外分光光度计定量及混样、过柱纯化和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序[26]。高通量测序得到的原始图像数据文件，经碱基识别分析转化为原始测序序列，结果以FASTQ (简称为fq)文件格式存储[27]。
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首先使用 Trimmomatic v.0.33软件[28]，对测序得到的原始测序序列进行过滤；其次使用cutadapt 1.9.1软件进行引物序列的识别与去除，得到不包含引物序列的高质量测序序列；然后使用FLASH v1.2.7软件[29]，按照最小重叠(overlap)长度为10 bp、重叠区允许的最大错配比率为0.2的要求，对每个样品高质量的一小段短的基因测序片段(reads)进行拼接，得到的拼接序列即原始序列质控后的高质量测序序列(clean reads)；最后使用UCHIME v4.2软件[30]，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据。使用Usearch软件对reads在97.0%的相似度水平下进行聚类，获得分类操作单元(OTU)[31]，以测序所有序列数的0.005%作为阈值过滤OTU[32]。以SILVA (
http://www.arb-silva.de/ )为参考数据库使用朴素贝叶斯分类器对特征序列进行分类学注释，可得到每个特征对应的物种分类信息，进而在各水平(门、纲、目、科、属、种)统计样品群落组成，利用QIIME软件生成不同分类水平上的物种丰度表，再利用R语言工具绘制样品分类学水平下的群落结构图[33]。使用QIIME软件对样品α多样性进行评估和t检验(显著性水平为0.01)。利用Mothur v1.30软件和R语言工具包绘制稀释曲线。基于独立OTU，采用加权分析方法和Bray-Curtis算法，使用QIIME软件进行非加权组平均法(UPGMA)分析，比较各组样品间的物种差异。 -
使用Usearch软件对clean reads在97.0%的相似度水平下进行聚类，共计获得651个OTU。各样品OTU个数分布较为均匀，样品M1~M6分别为551、583、579、518、593、589个。如图1所示：6组样品中共有的OTU数为417个。M3、M5、M6中分别有4、2、9个特有的OTU，为样品特有OTU，非单个样品特有或所有样品间共有的OTU在图1未做展示。从整体来看，不同地点的各样品间的OTU差异性远小于共性，说明采样方法设计合理。
图 1 沙棘(M1~M6)根瘤样品分类操作单元(OTU)花瓣图
Figure 1. Petal image of operational taxonomic unit (OTU) of H. rhamnoides root nodule sample (M1－M6)
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对6组样品测序共获得 810 039对reads，双端reads质控、拼接后共产生617 188条clean reads。其中质量≥20的碱基占总碱基数的比例(Q20)为98.7%，质量≥30的碱基占总碱基数的比例(Q30)为95.4%，表明测序质量较好。从图2可见：各样品稀释性曲线趋向平缓，表明在持续抽样下新物种出现的速率逐渐趋于平缓，此环境中物种数量不会随测序数量的增加而显著增多[34]，说明取样合理，能较好体现6组样品中根瘤内生菌的多样性，可以进行数据分析。M5的Shannon和Simpson指数最大(表1)，说明物种多样性最高。同理，M4的物种多样性最低。物种丰度方面M5与M6差别不大，均有较高水平。M4根瘤样品的物种丰度最低。样点的Shannon指数平均为4.24，Simpson指数平均为0.70，Ace指数平均为585.79，Chao1指数平均为595.47，样本文库平均覆盖率为99.95%。说明采样地的沙棘根瘤内生菌的物种丰富且多样性较大，各物种分配相对均匀，其微生物物种信息得到了充分体现。
图 2 各样品稀释性曲线
Figure 2. Dilution curve of each sample
表 1 各组样品的α多样性指数
Table 1. Alpha diversity index for each group of samples
样品 Shannon
指数Simpson
指数Ace
指数Chao1
指数覆盖
率/%M1 2.53 0.47 568.45 598.57 99.95 M2 4.73 0.79 595.09 600.60 99.95 M3 4.28 0.75 600.58 607.45 99.95 M4 2.52 0.44 542.32 543.52 99.94 M5 6.58 0.95 605.66 610.71 99.94 M6 4.82 0.77 602.63 611.97 99.94 平均 4.24 0.70 585.79 595.47 99.95 -
通过传统分离方法从BAP、JA、S、高氏一号培养基中得到纯培养菌株96株。所有菌株均可传代培养，但菌株之间培养周期差异较大，培养周期在1~30 d呈离散型分布。对各菌株进行分子鉴定，共有4门8纲8目13科19属。在门的分类水平分别为变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、厚壁菌门Firmicutes和柔膜菌门Tenericutes。在属的分类水平上，96株菌分属于支原体属Mycoptasma 1株、慢生根瘤菌属Bradyrhizobim 6株、土壤杆菌属Agrobacterium 7株、肠杆菌属Enterobacter 6株、小坂菌属Kosakonia 8株、柠檬酸杆菌属Citrobacter 1株、约克氏菌属Yokenella 1株、欧文氏菌属Erwinia 1株、克罗诺杆菌属Cronobacter 2株、泛菌属Pantoea 1株、莫拉菌属Moraxella 1株、贪噬菌属Variovorax 1株、草螺菌属Herbaspirillum 1株、假单胞菌属Pseudomonas 5株、链霉菌属Streptomyces 14株、小单孢菌属Micromonospora 1株、短杆菌属Brevibacterium 6株、葡萄球菌属Straphylococcus 1株和芽孢杆菌属Bacillus 32株。其中，优势门为变形菌门和厚壁菌门，优势属为芽孢杆菌属和链霉菌属。
高通量测序分析发现：6组样品共有14门34纲89目148科314属。将相对丰度大于0.1%的门与相对丰度前10的属进行汇总(图3、表2、表3)发现：在门的分类水平上，6组样品中相对丰度较高的主要为放线菌门和变形菌门，两者相对丰度之和为87.5%~97.1%。其次为拟杆菌门Bacteroidetes、杆菌门Patescibacteria、厚壁菌门、酸杆菌门Acidobacteria。在属的分类水平上，弗兰克氏菌属Frankia占绝对优势，相对丰度为20.12%~74.81%，平均相对丰度为51.49%。其次为根瘤菌属Rhizobium、类固醇杆菌属Steroidobacter、糖单孢菌属Saccharimonadales、肠杆菌属、泛菌属、欧文氏菌属、假黄色单胞菌属Pseudoxanthomonas、鞘脂单胞菌属Sphingomonas、假单胞菌属、固氮弓菌属Azoarcus、伯克氏菌属Burkholderia、芽单胞菌属Blastomonas、聚集杆菌属Congregibacter、拉恩氏菌属Rahnella、鞘氨醇菌属Chitinophaga、独岛杆菌属Dokdonella、普雷沃氏菌属Prevotella、链霉菌属、Microtrichales属。
表 2 沙棘微生物区系门水平的相对分布
Table 2. Relative abundance of microbiota taxa at the level of phylum
分类 6组样品在门水平的相对丰度/% M1 M2 M3 M4 M5 M6 放线菌门 73.55 47.56 51.24 76.09 27.73 57.68 变形菌门 22.38 41.91 41.63 21.01 60.35 29.82 拟杆菌门 0.89 1.42 1.30 0.40 2.18 4.42 杆菌门 0.31 5.66 3.89 0.73 1.42 1.72 厚壁菌门 2.18 2.74 1.30 1.21 2.18 4.42 酸杆菌门 0.15 0.26 0.42 0.18 1.16 0.53 其他 0.54 0.45 0.22 0.38 0.75 0.60 表 3 沙棘微生物区系属水平的相对分布
Table 3. Relative abundance of microbiota taxa at the level of genus
分类 6组样品在属水平的相对丰度/% M1 M2 M3 M4 M5 M6 弗兰克氏菌属 72.62 44.45 49.50 74.81 20.12 47.41 根瘤菌属 1.17 1.97 2.89 2.04 3.13 4.13 类固醇杆菌属 0.73 0.83 1.05 2.20 7.19 2.87 糖单孢菌属 0.28 5.61 3.85 0.71 1.41 1.68 肠杆菌属 6.93 2.19 1.05 0.08 0.22 0.40 泛菌属 0.63 5.19 4.69 0.01 0.05 0.11 欧文氏菌属 0.60 4.66 3.77 0.10 0.18 0.23 假黄色单胞菌属 0.85 1.98 1.67 0.75 3.56 0.68 鞘脂单胞菌属 0.39 1.06 2.10 1.55 2.10 1.64 假单胞菌属 0.51 1.27 5.60 0.03 0.21 0.09 其他 15.29 30.79 23.83 17.72 61.83 40.76 
图 3 6组根瘤样品的非加权组平均法(UPGMA)聚类树与物种分布柱状图
Figure 3. UPGMA clustering tree and the species distribution histogram of the six groups of nodule samples are combined drawing
在门、纲、目、科、属的各分类单元中，高通量测序的检测灵敏度(高通量测序/纯培养)依次是纯培养方法的3.50、4.25、11.20、11.38和16.53倍。在门水平上，纯培养菌株中占比较高的厚壁菌门在高通量测序中占比并不高。在属水平上，纯培养菌株中占比较高的芽孢杆菌属和链霉菌属皆在高通量测序中占比很低。该对比结果差异性较大，说明高通量测序在微生物多样性分析中占据优势地位，要优于纯培养方法。同时也说明，沙棘根瘤内共生细菌群落结构更为复杂，群落更为稳定。
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在运用传统方法分离纯培养微生物时，共分离纯培养菌株96株，分属于4门8纲8目13科19属，未获得弗兰克氏菌属的菌株，可能是培养基中弗兰克氏菌属的菌株生长缓慢，易被其他菌群取代，因此仍需探索新的培养基与培养方法以遏制根瘤中其他菌株的繁殖。在微生物多样性分析中，由于环境中的微生物复杂多样，各环境之间组成差异较大，通常采用非加权方法进行分析。该方法简单易操作，主要考虑物种的有无，但未考虑物种的丰度，所以采用非加权的方法难以区别各样品间的差异。
高通量测序分析共检测到14门34纲89目148科314属。在门、纲、目、科、属的各分类单元中，高通量测序的检测灵敏度(高通量测序/纯培养)依次是纯培养方法的3.50、4.25、11.20、11.38和16.53倍。与纯培养获得的菌株相比，高通量测序分析结果更加完整地揭示了沙棘根瘤内生菌的微生物多样性。高通量测序表明：在门的分类水平上，样品中相对丰度较高的主要为放线菌门和变形菌门，两者相对丰度之和为87.5%~97.1%。在属的分类水平上，弗兰克氏菌属占绝对优势，相对丰度为20.12%~74.81%，平均相对丰度为51.49%。
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张爱梅等[35]和刘志强等[36]分别对甘肃榆中、辽宁通辽、内蒙古赤峰等地沙棘根瘤内生菌微生物多样性做过类似研究，其高通量测序所得的微生物多样性高于本研究结果，说明沙棘根瘤内生菌微生物多样性受地理位置、土壤成分、气候条件、宿主种类及生长环境等多种因素的影响。本研究的沙棘取样于内蒙古乌兰察布沙漠边缘地带，采样地荒漠化土壤与干旱少雨气候对内生菌多样性有特别影响。
属于非豆科Leguminosae植物的沙棘根瘤共生固氮体系是以弗兰克氏菌属为主导的[37]微生物—微生物—植物互作体系。高通量测序分析显示：弗兰克氏菌属所占比例较高，然而本次传统方法分离却未得到纯培养菌株，这可能是由于培养基中缺乏某种信号物质或与其他菌属竞争存在劣势导致的，建议添加制霉菌素、萘啶酮酸和放线菌酮抑制其他菌群的繁殖[18]。非豆科植物结瘤固氮过程，单一属的菌株难以完成此任务。有研究[38]表明：纯培养分离的贪噬菌属是复杂微生物组中维持根生长的核心菌属，并且具有产生和降解生长素的能力，是细菌—细菌—植物通讯网络的关键角色。小单孢菌是植物益生菌，在促进植物生长的同时还可以分泌细胞壁降解酶促进细胞壁的降解，进而便于弗兰克氏菌的侵染[39-40]，但是小单孢菌的快速繁殖也对弗兰克氏菌的生长起到抑制作用。沙棘作为胡颓子科植物，根部结瘤侵染方式为细胞间侵入。研究[41]表明：草螺旋菌属Spirillum、慢生根瘤菌属、肠杆菌属的相关细菌与弗兰克氏菌存在负相关性(即抑制关系)，以上3个菌属均在豆科、禾本科Poaceae植物中发挥固氮相关的重要作用，但在胡颓子科中此类细菌与弗兰克氏菌属相互作用的机制尚未明确。
Construction of endophytic strain bank of seabuckthorn nodule and an analysis of microbial diversity
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摘要:
目的 沙棘Hippophae rhamnoides根瘤中拥有丰富的微生物资源，探究根瘤内生菌微生物多样性，比较高通量测序与纯培养方法的优劣。 方法 运用16S rRNA高通量测序技术探究沙棘根瘤内生菌相对丰度和多样性差异，并对根瘤内生菌进行分离纯培养，以完成内生菌株库初步构建。 结果 ①传统分离方法得到纯培养菌株96株，共4门8纲8目13科19属。在门分类水平上，相对丰度较高的主要为变形菌门Proteobacteria和厚壁菌门Firmicutes。②高通量测序分析6组样品(M1~M6)中共有14门34纲89目148科314属。在门分类水平上，相对丰度较高的主要为放线菌门Actinobacteria和变形菌门，两者相对丰度之和为87.50%~97.10%。在属的分类水平上，弗兰克氏菌属Frankia占绝对优势，相对丰度为20.12%~74.81%，平均相对丰度为51.49%。③高通量测序与纯培养方法的结果有明显差异，在科和属的分类单元上差异较大。 结论 2种方法都体现沙棘根瘤内生菌的多样性，但纯培养方法仅能够分离到部分内生菌，难以评估物种组成及相对丰度。高通量测序分析能够更为全面地反映多样性信息，且为优化纯培养条件而分离特定物种奠定基础。图3表3参41 -
关键词:
- 根瘤内生菌 /
- 微生物多样性 /
- 16S rDNA高通量测序 /
- 菌株库构建 /
- 沙棘
Abstract:Objective This study is aimed to conduct an investigation of the microbial diversity endophytic bacteria in rhizobia of Hippophae rhamnoides which play an important role in nitrogen fixation and plant growth and research the construction of rhizobia endophytes. Method With the employment of 16S rRNA high-throughput sequencing technology, an exploration was conducted of the relative abundance and diversity of endophytes in Ulange wood rhizobia of Mongolian H. rhamnoides in Dengkou County before the endophytes were isolated and purely cultured to complete the construction of endophytic strains library. Result (1) A total of 96 pure culture strains were obtained by traditional isolation, with 4 phyla, 8 classes, 8 orders, 13 families, and 19 genera and Proteobacteria and Firmicutes are of relatively higher relative abundances in terms of phyla classification. (2) With an analysis of 6 groups of samples (M1−M6) consisting of 14 phyla, 34 classes, 89 orders, 148 families, and 314 genera by high-throughput sequencing, Actinomycota and Proteobacteria have higher relative abundance, and the sum of the relative abundance of the two is between 87.50%−97.10% in terms of phylum classification. As for the taxonomic level of the genus, the genus Frankia occupies an absolute advantage with the relative abundance being between 20.12% and 74.81%, and the average relative abundance being 51.49%. With M5 having the largest Shannon and Simpson indexes and M4 having the lowest species diversity, both M5 and M6 have higher levels of species abundance whereas M4 species has the lowest abundance. (3) The results of high-throughput sequencing and pure culture methods are significantly different, especially in the taxa of families and genera. Conclusion Both methods reflected the diversity of endophytes in sea buckthorn rhizobia, but the pure culture method could only isolate some endophytes, and it was difficult to evaluate the species composition and relative abundance. Also, high-throughput sequencing analysis could reflect the diversity better and lay the foundation for optimizing pure culture conditions for the isolation of specific species. [Ch, 3 fig. 3 tab. 41 ref.] -
森林是陆地生态系统的主体，在全球碳循环中起着十分重要的作用。森林蓄积量作为衡量森林数量的重要的指标之一，能够直观反映森林资源数量和质量，获取森林蓄积量是推算森林生物量和碳储量的必要环节[1-3]。《“十四五”林业草原保护发展规划纲要》明确指出：将增加中国森林蓄积量作为主要目标之一，并将森林蓄积量与森林覆盖率作为两大约束性指标。因此，实现森林资源动态检测、准确获取森林蓄积量等参数信息，已成为当前森林资源调查的迫切需求。激光雷达(light detection and ranging, LiDAR)作为一种新兴的主动式遥感技术，能够从不同空间尺度对生态系统进行高效精准的监测[4]。机载LiDAR发射的激光脉冲能穿透森林冠层并获取树冠上部枝叶的空间信息，通过林分内的空隙，测量冠层结构信息和林下地形信息[5]。而传统方法通过样木、样地等抽样调查进行林分森林参数的推算，调查周期长、成本高且调查范围有限[6-7]。激光雷达在获取森林空间结构因子和地形因子等信息方面具有精度高、范围广等优势。
近年来，基于机载激光雷达的林分蓄积量反演已有许多研究成果，集中在构建参数方法和非参数方法的蓄积量反演模型。PAWE等[8]基于机载LiDAR数据对波兰东南部林区建立多元线性回归蓄积量反演模型，其中均方根误差(root mean square error, RMSE)为15.2%；CHIRICI等[9]以Landsat 5TM、卫星LiDAR数据等预测变量联合气温、降水和地形等辅助变量进行意大利中部地区蓄积量的大尺度反演，其中随机森林回归模型最优，决定系数(R2)为0.69、RMSE为37.2%；陈松等[10]基于Sentinel-2与机载LiDAR数据采用不同回归方法对广西高峰林场界牌、东升分场进行蓄积量反演，构建MLR-Logistic联立模型精度优于随机森林等机器学习方法，R2为0.60、相对均方根误差(relative root mean-squared error, RRMSE)为29.29%；曾伟生等[11]基于机载LiDAR数据，采用线性和非线性参数回归方法对东北林区进行蓄积量反演，其中非线性回归模型R2为0.71~0.82，略优于线性回归。已有多位研究者基于机载LiDAR数据进行林分蓄积量反演模型研究，但对于建模方法中参数回归和非参数回归模型的比较国内研究较少。本研究以广西国有高峰林场桉Eucalyptus树人工林为研究对象，基于机载激光雷达数据及地面调查数据，采用逐步回归、偏最小二乘回归等参数回归和随机森林、支持向量回归等非参数回归进行蓄积量反演模型研建，并通过模型评价指标对以上4种方法进行模型评估，进而选择出拟合优度、泛化能力最优模型。
1. 数据获取与预处理
1.1 研究区概况
研究区位于广西壮族自治区南宁市兴宁区的国有高峰林场，22°51′~23°02′N，108°06′~108°31′E，该区地处亚热带地区，年平均气温约21 ℃，年平均降水量为1 200~1 500 mm，相对湿度为79%，属丘陵地貌，海拔为100~460 m，坡度为6°~35°，具有较厚的赤红壤，适宜亚热带和热带树种生长，森林覆盖率达87%，主要树种为杉木Cunninghamia lanceolata、巨尾桉Eucalyptus grandis × E. urophylla、马尾松Pinus massoniana等。
1.2 样地数据
调查时间为2018年1—2月，研究区内共设置71块桉树样地(图1)，其中激光雷达覆盖范围内共57块样地。样地大小为20 m×20 m、25 m×25 m和25 m×50 m。采用实时动态差分技术(real-time Kinematic，RTK)进行样地定位，记录样地中心点及样地角点。采用每木检尺的方法，使用胸径尺、激光测高仪和皮尺逐一测量样地内树木的胸径、树高等数据。统计样地调查数据得到样地算数平均树高、算数平均胸径、样地面积(表1)。通过广西地区桉树二元材积表对单木材积量进行计算[12]，进而计算得到样地尺度的公顷蓄积量值(V样地)：V样地=V公顷S样地/10 000。其中：V公顷为通过二元材积公式计算得的每公顷蓄积量，S样地为桉树样地面积。
表 1 样地参数统计Table 1 Parameter statistics of sample plots项目 平均树高/m 平均胸径/cm 单位蓄积量/(m3·hm−2) 最大值 30.40 21.10 320.66 最小值 7.48 5.24 17.79 平均值 15.19 12.06 90.47 标准差 4.22 3.55 65.58 1.3 LiDAR数据及预处理
于2018年1月采集机载LiDAR数据，使用有人机并搭载LMS-Q680i激光雷达扫描仪，实际飞行高度为1 000 m，最大扫描角度为30°，波长为1 550 nm，激光脉冲长度为3 ns，采样间隔为1 ns，最大扫描频率为400 KHz，垂直分辨率为0.15 m，点云密度为10 pt·m−2。
使用LiDAR 360软件对机载激光雷达点云进行点云拼接、去噪、地面点分类、基于地面点归一化等预处理，结果如图2所示。根据样地角点以中心点坐标对点云进行裁剪，提取出基于样地尺度特征变量共48个，包括37个点云高度参数、10个密度参数、郁闭度等点云特征变量，具体参数见表2。
表 2 提取点云特征变量Table 2 Extracting point cloud feature variables变量类型 变量名 特征描述 高度变量 Hmax 归一化后所有点的Z值的
最大值Hmin 归一化后所有点的Z值的
最小值Hmedian_z 高度平均偏差 Hstddev 高度标准差 Hkurtosis 高度峰度 Hsqrt_m 高度二次幂均值 Hcurt_m 高度三次幂均值 HP1, HP5$, \cdots, $ HP99 归一化点云高度分布的百
分位数，共15个HA1, HA2$, \cdots, $ HA99 归一化点云累计高度的百
分位数，共15个密度变量 D1, D2$, \cdots, $ D9 将点云从低到高分成10个
相同高度的切片，该层
回波数点在所有返回点
的所占比例，共9个郁闭度 CC 首次回波中，植被点数与
所有点的比值1.4 建模数据准备
使用MATLAB激光雷达覆盖范围内57个样本进行随机抽样，按照3∶1的比例选取42个作为训练样本，15个作为验证样本。以样地实测公顷蓄积量为因变量，筛选后点云特征为自变量，采用逐步回归、偏最小二乘回归、随机森林回归、支持向量回归模型进行拟合 。
2. 研究方法
2.1 变量筛选
2.1.1 基于逐步筛选法优选变量
对于逐步回归，采用逐步筛选法对所有特征变量进行变量筛选；再对筛选出特征变量进行多重共线性检验，计算各变量间容忍度或特征变量间方差膨胀因子(FVI) 2个统计量[13]，对于容忍度≤0.2或FVI≥5的变量进行进一步讨论，确定最优特征变量子集。FVI=1/(1−R2)。其中：R为特征变量间相关系数。
2.1.2 基于随机森林优选变量
对于偏最小二乘回归、支持向量机回归、随机森林回归等方法，使用随机森林中重要性排序对特征变量进行优选。其主要原理为随机森林算法在构建各决策树时，对某一特征变量进行取舍，若此时均方误差(mean square error, MSE)有较大变化，则该特征变量重要性高，最终得到所有特征变量重要性排序。
2.2 蓄积量模型建立方法
2.2.1 逐步回归
逐步回归(stepwise regression, SR)可用于筛选并剔除引起多重共线性的变量，逐步回归建立模型一般形式为：Y=β0+β1X1+β2X2
$+\cdots + $ βiXi+ε。逐步筛选法结合了向前选择变量法和向后选择变量法的优点，对i个自变量X分别与因变量Y建立一元回归模型，计算各变量所对应F值，其中，β0为常数，βi为回归系数，ε为误差项。在建立逐步回归模型时，选择当前未加入模型的预测变量中F的最大值所对应的$ {X}_{i} $ 加入模型，再对已选入预测变量逐个进行t检验，若存在已选入预测变量不再显著，则将其剔除。重复以上步骤，直到既没有显著的解释变量选入回归方程，也没有不显著的解释变量从回归方程中剔除为止，将保留下来的最优子集作为建立模型的特征变量，并将候选变量对应系数保留。2.2.2 偏最小二乘回归
偏最小二乘回归(partial least squares regression, PLSR)结合了主成分分析、典型相关分析的优点，实现了数据降维、信息综合[14]。首先对训练样本进行数据标准化处理，调用plsregress函数提取主成分与自变量和因变量组合。分别计算自变量和因变量提取出成分的贡献率进而计算得到累计贡献率，当度量因子Q2h≥0.097 5停止主成分的提取[15]。统计主成分对个数并建立各自变量与因变量的线性表达式，最后根据所建立的各主成分对模型，整理得到PLSR模型。
2.2.3 支持向量机回归
支持向量机算法(support vector machine, SVM)利用内积核函数代替高维空间的非线性映射, 不涉及大数定律和概率测度等有关问题, 且SVM的决策函数仅有少数支持向量决定，该算法在解决小样本多维度回归和分类问题时泛化能力强，具备较好的“鲁棒性”。VAPNIK[16]在SVM分类的基础上引入了不敏感损失函数，得到了支持向量机回归算法(support vector regression, SVR)。
使用Libsvm工具箱实现SVR算法，采用网格搜索法(grid search)对常用的4种核函数进行参数寻优[17]，即线性、多项式、RBF (径向基核函数)、sigmoid (多层感知机核函数)。同时进行十折交叉验证，保证回归模型中惩罚系数(C)与gamma值(g)达到最优。
2.2.4 随机森林回归
随机森林回归(RFR)算法采用自助采样法(bootstrap sampling)，在以决策树构建Bagging集成的基础上，对样本和特征变量进行随机选择[18]。调用TreeBagger函数进行RFR算法建模，通过对决策树数量(ntree)和最小叶子点数进行参数寻优，直到袋外(out-of-bag，OOB)误差的MSE达到最小，保证模型预测性能达到最优，将寻优结果作为RFR模型的建模参数，用于模型构建。
2.3 模型评估方法
本研究使用决定系数(R2)、均方根误差(RMSE)和平均绝对误差(MAE)对林分蓄积量估测模型进行定量的精度验证和评价。其计算公式为：
$$\quad\;\;\, {R}^{2}=1-\frac{\displaystyle\sum\limits_{i = 1}^{{n}} {({y}_{i}-{\hat{y}}_{i})}^{2}}{\displaystyle\sum\limits _{i=1}^{n}{({y}_{i}-{\bar{y}}_{i})}^{2}} \text{；} $$ $$ {E}_{\mathrm{R}\mathrm{M}\mathrm{S}}=\sqrt{\frac{\displaystyle\sum \limits_{i=1}^{n}{({y}_{i}-{\hat{y}}_{i})}^{2}}{n}} \text{；} $$ $$ {E}_{\mathrm{M}\mathrm{A}}=\frac{1}{n}\displaystyle\sum\limits _{i=1}^{n}\left|({y}_{i}-{\hat{y}}_{i})\right| 。 $$ 其中：
$ {y}_{i} $ 、$ {\bar{y}}_{i} $ 、$ {\hat{y}}_{i} $ 分别为实测蓄积量值、实测蓄积量均值、模型预测蓄积量值；ERMS为均方根误差；EMA为平均绝对误差；n为验证样本数量。进行评估模型时，R2越趋近于1，代表拟合程度越高；ERMS越小，代表真实值与模型预测值之间离散程度越小；EMA越小，代表真实值与模型预测值之间的误差越小。3. 结果与分析
3.1 变量筛选结果
3.1.1 逐步筛选法
在采用逐步筛选法进行偏F检验时，取偏F检验拒绝域的临界值为F进＞F出，F进为选入变量时的临界值、F出为删除变量时的临界值。本研究设定F进为0.10，F出为0.11，筛选特征变量结果为D9、HP95、Hmax、Hkurtosis。
对筛选出的变量进行双变量相关性分析，根据相关系数(R)计算各变量间方差膨胀因子(FVI)。计算结果如表3，Hmax与HP95之间FVI为250.25，FVI大于5，认为两者之间存在共线性。因此分别以D9、Hmax、Hkurtosis和D9、HP95、Hkurtos为建模因子。
表 3 各特征变量间的方差膨胀因子Table 3 FVI calculation of each variable变量 D9 Hmax HP95 Hkurtosis D9 2.46 2.69 1.00 Hmax 2.46 250.25 1.01 HP95 2.69 250.25 1.01 Hkurtosis 1.00 1.01 1.01 3.1.2 基于随机森林筛选变量
对所有的48个特征变量进行重要性排序，调用随机森林中OOBPermutedVarDeltaError参数，得到所有特征变量的重要性。选择重要性大于0.2的变量作为建模因子，筛选结果如图3，包括8个高度变量、2个密度变量，其中Hcurt重要性最高，达0.52；D6重要性相对最低，为0.22。
3.2 模型建立与评价
3.2.1 逐步回归法
根据特征变量优选结果，分别建立以D9、Hmax、Hkurtosis和D9、HP95、Hkurtos为建模因子的多元线性模型:
$$ Y_{\rm{1}} = 470.232D_{\rm{9}} + 4.897H_{\rm{P95}} + 1.453H_{\rm{kurtosis}} - 56.903 \text{；} $$ $$ Y_{\rm{2}} = 482.214D_{\rm{9}} + 4.855H_{\text{max}} + 1.461H_{\rm{kurtosis}} - 65.01 。 $$ 使用SPSS 26对Y1、Y2模型进行初步评估，计算2种模型的相关系数(R)、R2以及标准估算误差(SE)，结果如表4。结果表明Y2中R2、SE均优于Y1，因此选定Y2作为逐步回归模型。
表 4 逐步回归模型初步评估Table 4 Preliminary evaluation of stepwise regression model模型 R R2 调整后R2 SE Y1 0.950 0.902 0.894 18.460 Y2 0.953 0.908 0.900 17.904 3.2.2 偏最小二乘回归
利用PLSR提取的主成分F1、F2与因变量Y关系分别为F1=5.840Y+b和F2=0.271Y+b，b为常数，得到最小二乘回归模型为：
$$ \begin{split} Y=\;&-42.571{-1.344H}_{{\rm{A}}25}-0.513{H}_{{\rm{A}}30}+1.450{H}_{{\rm{curt}}}+\\ \;&1.134{H}_{{\rm{mean}}}+0.705{H}_{{\rm{P}}20}+1.088{H}_{{\rm{P}}25}+{1.337H}_{{\rm{P}}30}+\\ \;&{1.523H}_{{\rm{P}}40}+24.647{D}_{6}+{445.634D}_{9} 。 \end{split} $$ 3.2.3 支持向量机回归
调用meshgrid函数对C、gamma进行参数寻优并采用十折交叉验证，调用svmtrain函数，分别构建4种不同核函数的SVR模型并进行模型训练，训练结果如表5。得到拟合结果最优模型为RBF-SVR，其C为8，gamma为0.125。RBF-SVR模型R2为0.85，RMSE为29.24 m3·hm−2，MAE为94.98 m3·hm−2，选定该模型作为本研究的SVR模型。
表 5 SVR不同核函数拟合结果Table 5 Fitting results of different kernel functions of SVR核函数 R2 RMSE/(m3·hm−2) MAE/(m3·hm−2) 线性 训练样本 0.89 18.62 14.49 验证样本 0.83 30.43 24.73 多项式 训练样本 0.74 34.34 23.06 验证样本 0.78 52.33 33.54 RBF 训练样本 0.95 13.09 11.65 验证样本 0.85 29.24 23.96 sigmoid 训练样本 0.80 24.91 17.79 验证样本 0.77 35.91 25.71 3.2.4 随机森林回归
本研究采用穷举法对决策树数量和最小叶子点数进行参数寻优。分别设置决策树数量和最小叶子点数最小值为50和2，每次递增10和1，对寻优过程循环，通过观察OOB误差的MSE变化，直到寻找到本模型最优参数，寻优结果如图4。最终确定决策树数量为90，叶子节点数量为2，将寻优结果作为建模参数，输入训练样本，完成RFR模型构建。
3.2.5 模型评价
使用验证样本对各模型的预测性能进行评估，结果如表6、图5。可以看出不同的回归模型均表现出较好的拟合结果，其中拟合结果最优模型为RFR模型，模型评价结果R2为0.95，RMSE为12.64 m3·hm−2，MAE为8.00 m3·hm−2，RBF-SVR模型其次，R2为0.94，RMSE为13.09 m3·hm−2，MAE为11.65 m3·hm−2。将验证样本带入模型，检验模型的预测能力，结果显示各模型预测能力与模型的拟合效果一致。通过传统方法的划分训练样本与验证样本，存在一定的偶然性与不确定性，为了进一步确保各模型的稳定性与泛化能力，采用留一法交叉验证(leave-one-out cross validation，LOOCV)对本研究中各模型进行再次评估[19]，如图6所示：RBF-SVR模型表现最优，R2为0.88，RMSE为21.35 m3·hm−2，MAE为16.62 m3·hm−2，与其他模型相比，R2高出0.03~0.07，RMSE减少2.58~5.17 m3·hm−2，MAE减少0.79~3.32 m3·hm−2。
表 6 蓄积量反演模型评估Table 6 Evaluation of growing stock volume inversion model模型 样本 R2 RMSE/(m3·hm−2) MAE/(m3·hm−2) SR 训练样本 0.91 17.03 13.27 验证样本 0.82 33.33 24.03 PLSR 训练样本 0.90 17.63 13.49 验证样本 0.80 34.53 27.76 RBF-SVR 训练样本 0.94 13.09 11.65 验证样本 0.85 29.24 23.96 RFR 训练样本 0.95 12.64 8.00 验证样本 0.88 28.11 19.48 
图 5 各模型训练结果与验证结果散点图Figure 5 Scatter diagram of training results and verification results of each model4. 讨论
本研究采用SR、PLSR等参数回归方法与RFR、SVR等非参数回归方法进行广西高峰林场桉树人工林的蓄积量反演模型研建，通过对点云特征变量筛选、建模因子优选、参数寻优等方法保证各模型达到最优性能，在此基础上采用留一法对各模型进行交叉验证，保证了模型的稳定性与泛化能力，并将该结果作为本研究各模型性能评估的最终结果。研究结果如下：①核函数为RBF的SVR在4种模型中预测精度最高(ΔR2为0.03~0.07、ΔRMSE为2.58~5.17 m3·hm−2、ΔMAE为0.79~3.32 m3·hm−2)，采用SVR模型在解决林业激光雷达领域的回归预测问题已有广泛应用，肖越[20]结合Landsat 8、高分2号(GF-2)共2种光学遥感数据与极化SAR数据进行旺业甸林场尺度的蓄积量反演，采用SVR模型拟合精度最高(R2为0.48，RMSE为57.27 m3·hm−2)，与MLR、RFR等方法相比，ΔR2为0.10~0.11、ΔRMSE为5.30~6.00 m3·hm−2。赵勋等[21]基于机载激光雷达进行广西高峰林场林分平均树高估测中，通过随机森林特征变量筛选，采用SVR相比较RFR方法，R2增加0.01、RMSE减少0.06 m。以上研究结果与本研究一致，进一步表明解决基于LiDAR点云特征变量的林分蓄积量反演问题时，结合随机森林筛选特征变量与支持向量机回归可作为有效建模方法。
②本研究采用2种方法对特征变量进行筛选，逐步回归法保证入选的特征变量显著且各变量之间不存在共线关系，随机森林则通过计算各特征变量对建模时的贡献度排序进而筛选变量。肖越[20]利用逐步回归法从遥感特征变量中筛选出建模因子用于蓄积量回归模型构建；周蓉等[22]在基于Landsat 8 遥感影像反演地上生物量的研究中，采用随机森林重要性排序方法从遥感因子中筛选出特征变量用于构建模型。这2种方法均广泛应用于构建模型前的变量筛选，合理地选择模型筛选方法，更有利于回归模型构建。
③本研究旨在选取最优桉树蓄积量反演模型，参数方法SR中逐步筛选法已对变量进行筛选，故SR模型不再采用随机森林进行特征变量筛选。在本研究模型评估中，SR模型评估结果均优于PLSR模型，袁钰娜等[23]对东北林区4种不同针叶林蓄积量反演所建立的回归模型中，PLSR模型的拟合结果和预测精度均优于SR (ΔR2为0.05~0.15，ΔRMSE为2.6%~4.2%)，与本研究结果不一致，但由于2种回归方法并未使用同一变量筛选方法，因此，不能直接认为在解决预测回归问题时前者更加可靠，对于以上2种回归方法的模型性能与预测能力需进一步讨论。
④本研究在林场尺度通过较少样本进行桉树林分蓄积量反演，非参数方法总体预测精度较高且RBF-SVR模型略优于RFR模型。SVR核心思想为将低维空间中的向量用非线性函数映射到一个高维特征空间，进而寻求线性回归超平面并解决低维空间中的非线性问题[24]，支持向量机回归解决多维度小样本回归预测问题相较随机森林回归更有优势。在反演尺度较大且训练样本较多的林分蓄积量反演问题时，采用支持向量机回归方法训练效率将明显下降，此时选择随机森林回归将更适用。
⑤本研究采用逐步筛选法筛选出的4个特征变量中，点云密度变量被选择1次；在采用随机森林筛选的10个变量中，点云密度变量被选择2次，且密度变量D9在重要性排序中位于第3位。点云密度变量作为本研究中重要解释变量之一，该类型变量能够描述林分中树木的水平结构信息，与树高(垂直结构变量)等参数结合可解释林分空间结构信息。孙忠秋等[25]加入林分郁闭度作为水平结构的解释变量，与仅用点云高度参数相比较，RMSE下降0.27 m3·hm−2、MAE下降0.08 m3·hm−2，该变量对模型预测性能有一定提升。本研究将郁闭度作为候选变量，但在逐步筛选法中又将其剔除，因为在基于随机森林法的重要性排序中，林分郁闭度参数在48个候选变量中排名第44位。由此可见，在林业激光雷达应用中，将林分密度用于衡量林分水平结构信息更加可靠。
5. 结论
本研究通过2种参数回归方法(逐步回归、偏最小二乘回归)与2种非参数方法(随机森林回归、支持向量机回归)对林分蓄积量进行估测。在采用传统方法划分训练样本与验证样本的结果中，非参数方法模型精度均优于参数回归方法；采用留一法对各模型预测精度进行交叉验证时，表现最优模型RBF-SVR属于非参数回归方法，表明解决林业激光雷达领域中的回归预测问题时，非参数方法相较参数方法更有优势。本研究中蓄积量反演模型已在广西高峰林场内取得较好模型精度，但对于大尺度反演森林蓄积量的适用性有待进一步论证。
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图 1 沙棘(M1~M6)根瘤样品分类操作单元(OTU)花瓣图
Figure 1 Petal image of operational taxonomic unit (OTU) of H. rhamnoides root nodule sample (M1－M6)
图 3 6组根瘤样品的非加权组平均法(UPGMA)聚类树与物种分布柱状图
Figure 3 UPGMA clustering tree and the species distribution histogram of the six groups of nodule samples are combined drawing
表 1 各组样品的α多样性指数
Table 1. Alpha diversity index for each group of samples
样品 Shannon
指数Simpson
指数Ace
指数Chao1
指数覆盖
率/%M1 2.53 0.47 568.45 598.57 99.95 M2 4.73 0.79 595.09 600.60 99.95 M3 4.28 0.75 600.58 607.45 99.95 M4 2.52 0.44 542.32 543.52 99.94 M5 6.58 0.95 605.66 610.71 99.94 M6 4.82 0.77 602.63 611.97 99.94 平均 4.24 0.70 585.79 595.47 99.95 
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表 2 沙棘微生物区系门水平的相对分布
Table 2. Relative abundance of microbiota taxa at the level of phylum
分类 6组样品在门水平的相对丰度/% M1 M2 M3 M4 M5 M6 放线菌门 73.55 47.56 51.24 76.09 27.73 57.68 变形菌门 22.38 41.91 41.63 21.01 60.35 29.82 拟杆菌门 0.89 1.42 1.30 0.40 2.18 4.42 杆菌门 0.31 5.66 3.89 0.73 1.42 1.72 厚壁菌门 2.18 2.74 1.30 1.21 2.18 4.42 酸杆菌门 0.15 0.26 0.42 0.18 1.16 0.53 其他 0.54 0.45 0.22 0.38 0.75 0.60
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表 3 沙棘微生物区系属水平的相对分布
Table 3. Relative abundance of microbiota taxa at the level of genus
分类 6组样品在属水平的相对丰度/% M1 M2 M3 M4 M5 M6 弗兰克氏菌属 72.62 44.45 49.50 74.81 20.12 47.41 根瘤菌属 1.17 1.97 2.89 2.04 3.13 4.13 类固醇杆菌属 0.73 0.83 1.05 2.20 7.19 2.87 糖单孢菌属 0.28 5.61 3.85 0.71 1.41 1.68 肠杆菌属 6.93 2.19 1.05 0.08 0.22 0.40 泛菌属 0.63 5.19 4.69 0.01 0.05 0.11 欧文氏菌属 0.60 4.66 3.77 0.10 0.18 0.23 假黄色单胞菌属 0.85 1.98 1.67 0.75 3.56 0.68 鞘脂单胞菌属 0.39 1.06 2.10 1.55 2.10 1.64 假单胞菌属 0.51 1.27 5.60 0.03 0.21 0.09 其他 15.29 30.79 23.83 17.72 61.83 40.76
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