Effects of manganese-modified biochar on accumulation of arsenic and lead in garlic and soil enzyme activity

供试土壤取自浙江省绍兴市上虞区的一块农田(30º00′N，120º79′E)，紧邻废弃的铅锌矿。该区域位于亚热带，气候温和湿润，四季分明，无霜期长达8~9个月。年平均气温为17.0 ℃，年平均降水量为1 319.7 mm。采用多点取样法采集0~20 cm表层土壤，充分混合后在自然条件下风干。在实验室内，去除土样中肉眼可见的植物根系和碎石等，并过2 mm筛后备用。土壤中砷和铅质量分数分别为99.73和447.84 mg·kg⁻¹，超过中国农用地土壤污染风险筛选值(总砷为30 mg·kg⁻¹，总铅为100 mg·kg⁻¹)。土壤pH为5.6，碱解氮为96.3 mg·kg⁻¹，速效钾为107.0 mg·kg⁻¹，有效磷为4.9 mg·kg⁻¹，有机质为3.9 g·kg⁻¹。

供试植物为大蒜小瓣种，种子来源于杭州种业集团有限公司。原始生物质炭制备：供试原材料稻壳购自山东省栖霞泰宇生物工程有限公司。干燥的稻壳在650 ℃下进行2 h恒温缺氧热解处理(使用浙江宜可欧环保科技有限公司的ECO-8-10型小型炭化设备)，制得原始生物质炭(RB)。随后，该生物质炭被研磨过2 mm筛以备用。

锰改性生物质炭制备：基于现有文献^[13−18]的方法进行改进和优化。将过筛后的原始生物质炭与0.2 mol·L⁻¹高锰酸钾溶液按炭锰质量比为1∶10混合，搅拌0.5 h以确保均匀混合。在16 ℃、40%超声功率下震荡1 h，使混合物进一步均匀，静置12 h。滤出生物质炭，在70 ℃下烘干至恒量，制得锰改性生物质炭(MB)。在此基础上，对改性过程进行细微调整和优化，以提高效果和适应性。

称取3 kg过筛土装进塑料盆中(直径为23.5 cm，高为14.0 cm)，以不添加生物质炭的土壤为对照(ck)。此外，设置4个生物质炭处理，分别加入10和30 g·kg⁻¹的原始生物质炭(RB1、RB3)及锰改性生物质炭(MB1、MB3)，共计5个处理：ck、10 g·kg⁻¹RB、30 g·kg⁻¹RB、10 g·kg⁻¹MB和30 g·kg⁻¹MB。每个处理设置4个重复。为降低外界环境对实验的影响，所有盆随机排列，并每周按顺时针方向调换位置1次。初次浇水至田间持水量的70%，基肥采用尿素和磷酸二氢钾(施肥量参照当地农业生产标准)。根据大蒜生长需求，氮(N)、 五氧化二磷(P₂O₅)、氧化钾(K₂O)的施用量分别为0.259、0.329和0.200 g·kg⁻¹，以颗粒状施入盆栽并与土壤充分混合^[1]。施肥后静置3 d，在每盆中均匀播种7~8颗大蒜种子，发芽7 d后进行间苗，每盆保留5株生长状况相同的植株。实验期间定期浇水、松土及防治病虫害，隔3 d记录1次植株的生长情况。为了研究大蒜各个器官对砷、铅的吸收情况，在大蒜成熟后，分别收集生长60 d后的第1茬大蒜地上部分，以及再次生长60 d后的第2茬大蒜地上部分和地下部分样品。同时，采集根系附近1~2 cm的根际土壤(鲜样)用于测定土壤酶活性；其他土壤样品经风干后过10目筛备测。对于收集的大蒜地上部分和地下部分样品分别记录鲜质量后，用自来水和去离子水清洗干净，先在105 ℃烘箱内杀青30 min，再在65 ℃下烘干至恒量。记录干质量后，将植物样品研磨备测。

供试土壤理化性质参照《土壤农业化学分析方法》^[19]测定。土壤pH采用FE20型酸度计测定(土水质量比为1.0∶2.5)。土壤有机碳质量分数采用重铬酸钾外加热法测定。土壤有效磷质量分数采用盐酸-氟化铵(HCl-NH₄F)法提取，分光光度计(UVA132122)测定。碱解氮质量分数采用碱解氮扩散法测定。速效钾质量分数采用乙酸铵-火焰分光光度计(FP6431)法测定。土壤阳离子交换量经三氯化六氨合钴浸提后，采用同一分光光度计进行比色测定。土壤有效态砷和有效态铅分别经0.5 mol·L⁻¹磷酸二氢铵(NH₄H₂PO₄)法和0.004 mol·L⁻¹二乙烯三胺五乙酸(DTPA)法浸提，采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定质量分数。土壤全砷和全铅先采用硝酸-氢氟酸-高氯酸消解法，再用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定。

生物质炭pH使用FE20型酸度计测定(炭水质量体积比为1∶20)。生物质炭中的灰分百分比根据ASTM D 1726—84《炭化学分析标准试验方法》测定。比表面积在77 K氮气环境下采用比表面积分析仪(TristarⅡ3020)测定。主要元素组成则采用元素分析仪(Flash EA1112)测定。生物质炭的表面形貌特征采用扫描电镜(SU-8010)分析。表面官能团采用傅里叶红外光谱仪(Nicolet iS10)测定。生物质炭的矿质元素组成利用X射线能量色谱仪(pK-Alpha⁺)测定。

土壤酶活性采用微孔板荧光法进行分析。该方法基于底物和酶的水解反应释放4-甲基伞形酮酰，进行荧光检测^[20]。具体参考包建平等^[21]的方法：首先，称取2 g新鲜土样放入50 mL离心管中，加入30 mL pH为5的醋酸钠溶液。随后，在25 ℃下以180 r·min⁻¹振荡30 min，之后用70 mL的醋酸钠溶液(pH为5)多次洗涤并转移到烧杯中，用磁力搅拌器制备成土壤悬浊液。随后，取200 μL土壤悬浊液放入96孔微孔板中，并加入50 μL的反应底物。将微孔板放入25 ℃培养箱中避光孵育3 h后，加入15 μL 0.5 mol·L⁻¹氢氧化钠并终止反应。使用多功能酶标仪(Synergy^TM H1)在365 nm的荧光激发光和450 nm的检测光波长下测定反应液的荧光值，从而测得土壤中的β-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶、β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶和酸性磷酸酶的活性。

大蒜样品的分析测定依据《土壤农业化学分析方法》^[19]进行。将研磨的大蒜样品使用硫酸-双氧水法消解；大蒜样品中的碱解氮、有效磷和速效钾质量分数分别采用奈氏比色法、钼锑抗比色法和火焰光度计法测定。大蒜样品中的砷和铅质量分数通过硫酸-双氧水消解法提取，并使用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定。

采用SPSS 26对试验数据进行处理和分析。不同处理间的数据差异显著性通过单因素方差分析和Duncan多重比较分析(P＜0.05)，使用Origin Pro 2021作图。

锰改性生物质炭的pH和灰分百分比高于原始生物质炭(表1)，这主要是引入锰氧化物的结果。另外，灰分百分比的增加与pH升高有密切联系^[16]。锰改性过程中，锰氧化物在生物质炭表面形成均匀的覆盖层。尽管大部分的中、微孔隙被锰氧化物填充，部分孔隙被转化为较大的孔隙，导致比表面积降低，但是平均孔径显著增加。这不仅增强了对锰氧化物的负载，也提升了生物质炭表面的吸附和氧化特性^[15]。扫描电镜图像(图1A)显示：原始生物质炭表面为管状结构，孔隙丰富；而锰改性生物质炭表面更为粗糙和疏松，明显可见锰氧化物颗粒的附着^[22]。锰改性增加了生物质炭表面新的氧化还原活性位点，提升了其电子传递能力和催化性能；同时，也形成了新的化学键和结构，加强了其稳定性^[22]。傅里叶红外光谱图(图1B)揭示，原始生物质炭在3 739、1 649、1 398、1 083、790和565 cm⁻¹处有明显峰值，而锰改性后在3 400 cm⁻¹附近的峰通常是水分子中的—OH伸缩振动^[23]，1 094 cm⁻¹处的峰值则指示C—O伸缩振动，表明生物质炭中的羰基、芳环结构和碱性基团增多。549和560 cm⁻¹处的峰值分别对应氧化锰(MnO)和氧化亚铁(FeO)的振动峰^[24]，表明锰已成功负载至生物质炭。X射线能谱分析(图1C~D)显示：碳元素下降，氧和锰元素上升。

Figure 1.  Scanning electron microscopy images (A), Fourier transform infrared spectroscopy spectra (B), X-ray energy spectrum analysis diagrams of the original biochar (C), and manganese-modified biochar (D)

土壤pH作为一项重要的理化性质，不仅影响土壤中养分的有效性和结构，还是影响重金属形态变化的关键因素。根据图2A的数据，除了RB1和MB1处理外，其余施炭处理均使土壤pH相比对照显著提高(P＜0.05)。尤其在MB3处理下，土壤pH较对照提高了8.9%，显示出30 g·kg⁻¹施炭处理的pH高于10 g·kg⁻¹施炭处理。由于生物质炭本身呈碱性，改性后其表面吸附了大量阳离子，能够与土壤中的H⁺进行交换^[25]，从而提高土壤pH，降低酸度。刘玉学等^[26]通过田间试验发现：高剂量的稻草炭和竹炭显著提高土壤pH，而低剂量添加的效果与本研究结果不符。添加RB3处理比对照提高了阳离子交换量，而锰改性生物质炭处理则降低了阳离子交换量(图2B)。这可能是因为原始生物质炭表面有更丰富的含氧官能团，提升了其阳离子交换能力^[27]，而经锰改性后的生物质炭可能与土壤中的阳离子(如钙离子、镁离子、钾离子等)竞争吸附，从而降低阳离子交换量。添加生物质炭后，土壤中的有效磷质量分数均显著高于对照(P＜0.05)，特别是MB1处理的有效磷质量分数最高(提升了46.7%，图2C)。在所有处理下，土壤有机质质量分数随生物质炭添加量的增加而增加，与高凤等^[28]的研究结果相符。锰改性处理生物质炭导致土壤有机质质量分数低于原始生物质炭处理(图2D)。除了RB1处理外，其他3个施炭处理与对照相比均显著降低了土壤中的碱解氮质量分数(P＜0.05，图2E)。这可能是因为生物质炭增加了土壤中的有机质质量分数，导致土壤碳氮比上升，从而降低了土壤中的有效氮质量分数^[29]。与对照相比，所有施炭处理均显著提高了土壤中速效钾质量分数(P＜0.05)，其中RB1和MB1处理分别使土壤速效钾质量分数比对照提高了64.3%和94.3%，而RB3和MB3处理的提升率分别为143.5%和178.7%(图2F)。这是由于锰改性后生物质炭中钾元素质量分数增加，易于释放并溶解于土壤水溶液中，进而增加了土壤速效钾质量分数^[30]。

Figure 2.  Effect of biomass charcoal on the physical and chemical characteristics of the soil and the quality fraction of the nutrients

图3A显示：相较于对照，MB1处理显著降低了土壤中有效态砷质量分数，减少了11.5%，而其他施炭处理对有效态砷质量分数没有显著影响。MB处理减少了有效态砷，这可能是因为锰改性后的生物质炭改变了土壤表面电荷，增强了对含氧砷离子的吸附，从而减少了砷的有效性和移动性^{[15, 22]}。此外，二氧化锰颗粒的强氧化性能将土壤中的砷(Ⅲ)转化为毒性更低、更易固定的砷(Ⅴ)，加之锰改性生物质炭本身较强的吸附能力，进一步降低了土壤中有效态砷质量分数^[18]。除RB1处理外，其他施炭处理均显著降低了土壤中DTPA可提取态铅的质量分数(P＜0.05)，尤其是MB3处理最为显著，比对照降低了28.3% (图3B)。土壤pH与土壤有效态砷变化呈正相关关系，但未达显著水平(图4)，MB1处理虽然降低了有效态砷，但MB3未达显著水平，这可能因为土壤pH的上升导致砷酸根的溶出，增加了土壤中砷的活性和生态风险^[31]。与RB相比，MB更显著提高了土壤pH，增加了土壤颗粒表面的负电荷，进而减弱与砷阴离子(AsO₄ ³⁻和AsO₃ ³⁻)的静电作用，提高了砷的移动性和生物有效性^[31]。聂天宏^[32]的研究表明：土壤pH的升高增加了土壤表面的活性电位，增强了对铅的吸附和钝化。土壤pH的上升还促进了OH⁻与铅形成难溶的重金属沉淀^[33]。此外，施用MB后土壤中有效磷质量分数升高，铅与磷酸根形成难溶性磷酸盐^[34]。总体而言，相比RB，MB更有效地降低了土壤中铅的活性。MB丰富的孔隙结构为表面或界面反应提供了丰富的活性位点^[22]，有助于吸附土壤中的铅，从而降低土壤溶液中DTPA可提取态铅的质量分数。

Figure 3.  Effect of biochars on concentrations of the soil available arsenic and DTPA-extractable lead

Figure 4.  Correlation analysis of soil physicochemical properties, enzyme activities, and available arsenic and DTPA-extractable lead

由图5可知：除RB1处理外，RB3、MB1、MB3处理相较于对照显著提升了β-葡萄糖甘酶(分别提高17.3%、21.7%和37.7%)和酸性磷酸酶(分别提高了14.4%、8.0%和9.8%)的活性(P＜0.05，图5A~B)。同时，施用MB显著增强了β-N-乙酰氨基葡萄糖甘酶的活性(P＜0.05，图5C)。在RB3和MB1处理下，土壤中β-木聚糖苷酶的活性分别显著提高了18.5%和6.4% (P＜0.05，图5D)。总体而言，MB提高了各类酶的活性，从大到小依次为β-葡萄糖甘酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖甘酶、酸性磷酸酶、β-木聚糖苷酶活性。土壤酶活性是衡量土壤微生物活性的重要指标，反映了土壤中物质代谢的活跃程度^[27]。β-葡萄糖甘酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖甘酶和β-木聚糖苷酶作为水解酶，在土壤的碳氮循环中扮演关键角色，催化糖类和蛋白质的分解^[35]。β-葡萄糖苷酶主要参与土壤纤维素的降解和碳循环过程，与土壤有机质质量分数呈正相关^[36−37]。本研究中，4种施炭处理均增加了土壤有机质质量分数，并伴随着β-葡萄糖苷酶活性的显著提升。郑慧芳等^[38]的研究表明：生物质炭施用量的增加可以显著提升土壤β-葡萄糖苷酶活性，促进土壤生物化学反应，加快养分循环，从而提高土壤养分的可利用性。酸性磷酸酶主要参与土壤有机磷的矿化，影响土壤有机磷的分解转化及其生物有效性^[39]。与对照相比，MB1和MB3处理分别使酸性磷酸酶活性提高了7.4%和9.8%，表明不同比例和类型的生物质炭对土壤酶活性的影响不同。总体而言，RB1施用量下土壤酶活性降低，而其他处理则显示土壤酶活性升高。这是由于RB1处理下的土壤有机质、速效磷质量分数和pH相对较低(图2)，直接影响了土壤酶的活性。相关分析表明：土壤有机质、速效磷质量分数和pH与酶活性呈正相关关系(图4)。然而，RB1处理下的土壤有机质、速效磷质量分数和pH与对照相比有所提高，但土壤酶活性却有所降低，具体机理还需进一步探讨。β-葡萄糖苷酶活性与土壤有机质质量分数正相关，而酸性磷酸酶主要参与土壤有机磷的矿化过程，其活性直接关联土壤有机磷的分解和转化。同时，β-N-乙酰氨基葡萄糖甘酶和β-木聚糖苷酶的活性也受土壤pH的影响。由于这些因素的共同作用，在RB1处理下，土壤酶活性降低。与对照相比，在其他处理中，由于土壤有机质、速效磷质量分数和pH相对较高，土壤酶活性表现出上升趋势。

Figure 5.  Effect of biochars on soil enzymatic activity

图6显示：与对照相比，在4种施炭处理下，大蒜地上部分生物量均显著增加，锰改性生物质炭处理下的地下部分生物量均显著增加(P＜0.05)。尤其在MB3处理下，大蒜地上部分和地下部分生物量的增加最为显著，地上部分增加了25.8%。对于地下部分，与对照相比，MB处理使大蒜的生物量显著提高，其中MB1和MB3处理下的大蒜生物量分别增加了21.6%和37.2% (P＜0.05)。这是由于MB对土壤中重金属(如砷和铅)的钝化作用降低了它们对土壤和植物的毒害效应。此外，生物质炭(特别是MB)富含中微量元素(铁、锰、锌等，图1)，施用后显著提高了土壤中磷、钾等养分的有效性，直接提升了土壤肥力，促进了植物对这些养分的吸收，进而促进了作物的生长。MB的施用还提高了土壤pH和有机质质量分数，进一步促进了大蒜的生长。谭笑^[40]的研究表明：在MB处理下，水稻的地下部分和地上部分鲜质量以及千粒重均有所增加。李双建等^[41]的研究也发现：在减少施肥量的同时施用生物质炭，并不会降低大蒜产量。相反，生物质炭的施用能够降低土壤容重，提高土壤孔隙度，为作物根系提供更大的生长空间，从而增强其生理功能，最终提高作物产量。这些结果进一步说明了生物质炭在提高作物生产力方面的作用。

Figure 6.  Impact of biochar on garlic biomass

本研究将大蒜划分为3个部分：生长60 d收获的第1茬大蒜叶片、生长120 d的第2茬大蒜叶片以及持续120 d生长的大蒜根系。由图6可知：第2茬大蒜叶片中的全氮质量分数是根系的近2倍，且第1茬大蒜叶片的全氮质量分数高于第2茬。与对照相比，施加MB处理使第1茬大蒜叶片的全氮质量分数较高，特别是在MB3处理下，提高了8.1% (图7A)。第2茬大蒜叶片的全氮质量分数有所下降。WOLDETSADIK等^[42]的研究发现：施用不同量的生物质炭会显著减少第1个生长季中生菜Lactuca sativa var. ramosa叶片的全氮质量分数，但第2个生长季的全氮质量分数。这可能是因为生物质炭的强吸附能力导致土壤中铵离子(NH₄⁺)的降低，从而限制了作物对氮素的吸收^[43]。此外，4种施炭处理均显著提高了大蒜中的全钾质量分数(P＜0.05)，且叶片中的钾整体高于根系。另外，第2茬大蒜中的全钾质量分数高于第1茬(图7B)。这一方面是因为生物质炭本身含有钾元素，施用后可以直接提高土壤中速效钾；另一方面，MB的吸附能力增强，施用后能有效降低土壤中钾的淋溶损失，提升土壤中可交换性钾质量分数^[44]，进而促进地上部分对土壤中钾的吸收。同时，4种施炭处理都提高了大蒜叶片的全磷质量分数，而根系全磷量则有所降低(图7C)。生物质炭的施用提高了土壤pH和阳离子交换量，同时提高了土壤中磷素有效性^[45]。根系对磷元素的吸收过程受到土壤元素生物有效性的控制，以及土壤-溶液-根界面元素迁移扩散速率和根系吸收不同离子时的离子竞争作用等多种因素的影响^[45]。生物质炭丰富的孔隙结构能吸附和固持土壤中的养分，从而提高养分利用效率^[46]，促进植物养分吸收。MB的添加提高了土壤有效磷质量分数。有效磷以PO₄ ³⁻离子形式存在，容易形成难溶性的磷酸盐^[34]，并且需要经过土壤微生物的长时间分解和转化才能被植物吸收利用，因此，在较短时间内种植的大蒜根系中的含磷量有所降低。

Figure 7.  Effect of biochar on the total nitrogen, total phosphorus, and total potassium contents of the garlic roots and leaves at different growth stages

与对照相比，4种施炭处理显著降低了大蒜叶片和根系中的砷质量分数(P＜0.05)。施用RB对2茬大蒜叶片中砷质量分数的影响不显著，但施用MB后，第2茬大蒜叶片中的砷质量分数显著低于第1茬(图8A)。同时，与对照相比，MB1和MB3处理使大蒜根系中的铅质量分数分别降低了23.8%和32.1%。在不同生物质炭处理下，第2茬大蒜叶片中的铅质量分数显著低于第1茬，且大蒜根系中砷和铅质量分数普遍高于叶片部分。在RB3处理下，大蒜根系中的铅质量分数高于其他处理，这可能是因为提高生物质炭的投加量反而降低了其吸附量(图8B)。陈志良等^[47]的研究显示：当生物质炭的投加量从1 g·L⁻¹增加到50 g·L⁻¹的时，其对Cu(Ⅱ)的吸附量从11.0 mg·g⁻¹降低到1.18 mg·g⁻¹。这可能是由于高质量分数的生物质炭颗粒形成微小的团聚体，从而减少了有效吸附面积。与RB相比，施用MB更有效地降低了大蒜植株中砷和铅质量分数，且根系中的砷和铅质量分数显著高于叶片部分。此外，随着施炭量增加，大蒜中的砷和铅质量分数呈降低趋势(图8)。CARBONELL-BARRCHINA等^[48]的研究发现：土壤中砷铅等重金属过高会对植物产生生理毒害，植物会启动自我保护机制，将这些重金属固定在根系中以阻碍其向地上部分的迁移。研究表明：生物质炭能够通过吸附固定土壤中的重金属，减少土壤中重金属的可交换态比例，从而修复土壤，减少植物对重金属的吸收^[49]。董盼盼等^[50]的研究发现：添加生物质炭能够加强芦苇Phragmites australis对重金属铅的固定作用。富含羟基基团的锰氧化物通过络合、沉淀等多种机制，实现对砷、镉和铅的同步钝化^[51]。然而，本研究中，RB处理下第2茬大蒜叶片中的砷质量分数高于第1茬，而MB处理的结果相反。这表明随着时间的增加，MB表面附着的锰氧化物颗粒变得更加稳定，对砷离子的吸附也更为强烈，从而更有效地固定土壤中的砷，使得植物中砷质量分数降低。此外，改性过程中的2次热解作用使得锰改性生物质炭具有更高的芳化程度和更多潜在的活性吸附位点，从而提高了对砷和铅等元素的固定效果。董双快等^[52]研究发现：铁锰改性生物质炭对小白菜Brassica rapa var. glabra可食部分和根系吸收砷的抑制作用较强，添加改性生物质炭能够抑制小白菜根对土壤中砷的富集，且在土壤中，高锰酸钾与砷发生的氧化还原反应能生成难溶的化合物，从而也减少了植物对砷的吸收。本研究虽然使用了2种生物质炭和2种施用比例，但大蒜中的的砷和铅质量分数仍未达到食用安全水平，这可能是由于施用比例或环境因素等的影响，具体原因还需进一步探索。

Figure 8.  Effect of biochars on arsenic and lead contents in the garlic roots and shoots

MB处理比RB处理提高土壤pH的作用更明显，更有效地提高了土壤有机质和速效养分质量分数。特别是在MB3处理下，提高土壤有效磷、速效钾质量分数和pH的作用最为显著。此外，MB处理显著增加了大蒜的地上和地下部分生物量，尤其在MB3处理下，生物量分别提升了25.8%和37.2%。大蒜叶片氮质量分数也在MB3处理下显著提高了8.1%，其他处理对大蒜叶片磷质量分数的影响不明显。所有施炭处理都显著提高了大蒜中的钾质量分数。MB3处理下，土壤中DTPA可提取态铅质量分数降低了28.3%，表明MB处理对土壤有效铅的降低效果更为显著。MB1处理下，土壤中有效态砷质量分数降低了11.5%。这揭示了生物质炭具有吸附和固定重金属的强大潜力。MB处理有效提高了土壤酶活性，减少了大蒜中砷和铅的积累。相比对照，MB3和RB3处理分别使β-葡萄糖甘酶和酸性磷酸酶活性提高了37.7%、17.3%和9.8%、14.4%。在MB1和MB3处理下，大蒜根系中铅质量分数分别降低了23.8%和32.1%，且施用生物质炭显著降低了第2茬大蒜叶片中砷的质量分数。总体而言，锰改性生物质炭在修复砷铅复合污染土壤方面的表现优于原始生物质炭，在降低铅质量分数方面效果更显著，但对砷的影响效果仍有待进一步探讨。锰改性生物质炭在重金属污染土壤修复中的应用前景仍需在实际生产中不断验证，同时需解决锰改性生物质炭的成本高，造成环境二次污染和回收利用等问题。