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毛竹阿拉伯糖-5-磷酸异构酶的基因克隆、原核表达及纯化

屈亚平 张智俊 王超莉 王蕾 吴林军

付小斌, 陈琦, 刘苑秋, 等. 降水格局变化对杉木幼苗不同器官非结构性碳水化合物的影响[J]. 浙江农林大学学报, 2024, 41(6): 1114-1123. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20240253
引用本文: 屈亚平, 张智俊, 王超莉, 等. 毛竹阿拉伯糖-5-磷酸异构酶的基因克隆、原核表达及纯化[J]. 浙江农林大学学报, 2016, 33(6): 928-934. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.2016.06.002
FU Xiaobin, CHEN Qi, LIU Yuanqiu, et al. Effects of precipitation pattern change on non-structural carbohydrates in different organs of Cunninghamia lanceolata seedlings[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2024, 41(6): 1114-1123. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20240253
Citation: QU Yaping, ZHANG Zhijun, WANG Chaoli, et al. Gene cloning, expression, and purification of the arabinose-5-phosphate isomerase from Phyllostachys edulis[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2016, 33(6): 928-934. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.2016.06.002

毛竹阿拉伯糖-5-磷酸异构酶的基因克隆、原核表达及纯化

DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.2016.06.002
基金项目: 

浙江省自然科学基金资助项目 Y14C160039

详细信息
    作者简介: 屈亚平,从事生物技术与种质创新研究。E-mail:1173714002@qq.com
    通信作者: 张智俊,副教授,博士,从事生物技术与种质创新研究。E-mail:397942805@qq.com
  • 中图分类号: S722

Gene cloning, expression, and purification of the arabinose-5-phosphate isomerase from Phyllostachys edulis

  • 摘要: 毛竹Phyllostachys edulis阿拉伯糖-5-磷酸异构酶(PeKdsD)是2-酮-3-脱氧辛糖酸(KDO)生物合成途径的第1个关键酶。采用逆转录实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)克隆得到毛竹KdsD基因。该基因cDNA全长1 038 bp,编码346个氨基酸;对不同物种来源的KdsD氨基酸序列进行比对和系统进化树分析。结果表明:毛竹的KdsD与玉米Zea mays等植物来源的KdsD有很高的序列一致性,而与微生物来源的KdsD序列一致性较低。毛竹不同组织实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)结果表明:PeKdsD基因在叶中表达量远远高于其他组织。在大肠埃希菌Escherichia coli原核表达系统中获得了KdsD的可溶性高表达蛋白,将大量表达的重组蛋白经过Ni-NTA亲和层析和分子筛层析(SEC)进行纯化,发现KdsD在溶液(30 mmol·L-1三羟甲基氨基甲烷pH 8.0,200 mmol·L-1氯化钠)中以多种聚体的形式存在;酶学性质测定的结果表明:毛竹KdsD酶最适pH值为pH 8.5,最适作用温度为37℃。此结果为后期研究植物KdsD蛋白的结构与功能奠定了基础。图7参17
  • 过去20 a间,全球气候发生了巨大变化,对生态系统的结构和功能产生了深远影响[1]。气候改变会导致植物体内非结构性碳水化合物(NSC)的变化。有研究表明:气候变暖显著降低了陆地植被的NSC、可溶性糖和淀粉质量分数[2]。NSC主要由可溶性糖和淀粉组成,参与植物细胞在逆境下的渗透调节过程[3]。NSC在植物体内的累积量一定程度上可以反映植物体内碳的供需平衡关系,对维持植物体渗透调节、水力传输和生长发育,缓冲树木在年际、季节和器官间碳供需关系至关重要[4]。NSC质量分数是反映植物生存策略的重要指标[57],在改善植物对干旱环境的适应性、保持植物不利条件下的生长和提高植物存活率方面发挥着关键作用[8]

    降水格局变化是全球气候变化的研究热点[9],深刻影响着区域干旱[1011]、地表径流[1214]、河流水量[1415]等,同时也间接作用于生态系统的弹性与安全[16]。降水是植物获取水分的重要来源,是植物生长的关键因素[17]。降水量减少会导致树木死亡,严重损害森林生态系统的固碳能力[1819]。目前,有关降水格局变化对植物NSC的影响仅在少数植物,如红砂Reaumuria soongarica[20]和马尾松Pinus massoniana[21]等上有研究。其中,红砂幼苗NSC质量分数在干旱胁迫下随胁迫时间的增加而增加[20],持续隔离降水导致马尾松针叶NSC质量分数先显著增加后减少[21]。这说明不同树种在面临干旱条件时可能会采取不同方式调节各器官的NSC质量分数来适应干旱,但是目前对南方造林面积最大的树种杉木Cunninghamia lanceolata鲜有报道。因此,研究中国亚热带地区降水格局变化下先锋树种杉木的生理生态特性,对预测未来气候条件下基于碳水化合物调节的杉木适应降水变化的生理机制极具价值。

    杉木作为一种重要的速生针叶木材种类,以其迅速的生长速度、笔直的干形和上乘的材料而著称[22],在中国人工林木材资源中占比很大[2324]。但是,季节性干旱事件的频繁发生,对杉木人工林生产能力带来的负面影响逐渐加剧。杉木的树高与胸径比值较高,使其更容易受到极端气候的影响[25]。然而关于杉木幼苗不同器官NSC及其相关组分对降水格局变化的响应策略以及在降水格局变化时杉木人工林应制定的管理策略尚不清楚。本研究通过分析杉木幼苗不同器官NSC及其相关组分(可溶性糖、淀粉)在不同降水量和不同降水间隔的变化与分配情况,旨在全面和深入掌握杉木生长季中不同器官NSC对不同降水格局变化的响应,为亚热带地区杉木人工林的科学抚育管理提供理论指导和科学依据。

    研究区位于江西省南昌市(28°10′~29°11′N,115°27′~116°35′E),属亚热带湿润季风气候,极高温为40.9 ℃,极低温为−15.2 ℃,年平均气温为17.0 ℃,年平均降水量为1 600.0~1 700.0 mm,年平均相对湿度为78.5%。森林覆盖率为21.3%,主要植被类型为常绿阔叶林,主要土壤类型为红壤[26]

    试验开展于江西农业大学中药园。2021年4月,将2年生杉木幼苗置于40 cm×40 cm×50 cm的长方体花盆中开始缓苗,8月开始控制试验,7:00—8:00对幼苗进行降水,其余生态因子均保持一致,2022年1月结束试验。杉木幼苗胸径为1.5 cm,树高为1.0~1.3 m。以南昌1955—2018年旱季的月平均降水量(69.12 mm)为对照组(ck),分别设置减少30%、50%、80%降水量的处理组(W-30%、W-50%、W-80%)。在此基础上,参考南昌1955—2018年实测降水间隔数据,设置降水间隔5和10 d (T5和T10) 2个处理。因此,降水格局共8个处理组,每处理5次重复,共40盆。

    样品收集过程中,先从盆里完整地取出杉木幼苗,再用保鲜膜包裹根系,确保根系完整性的同时防止水分流失,并迅速将样品带回实验室。将杉木幼苗分为叶、枝条、枝干、运输根、吸收根5个部分,因幼苗较小,枝干为地上部分最粗壮的主干,枝条为除去主干后的其余地上分支[27]。放入105 ℃的烘箱中烘烤30 min,然后在60 ℃下烘干至恒量,研磨粉碎过0.25 mm筛,测定NSC及其相关组分质量分数。可溶性糖质量分数采用蒽酮比色法测定,淀粉质量分数采用稀酸水解法测定,NSC质量分数为可溶性糖和淀粉质量分数的总和[2829]。其中,根系按照欧阳园丽等[30]的根序级别划分方式分级。

    所有数值以平均值±标准差表示。数据分析和绘图采用R 4.3.0进行。采用线性混合模型分析降水格局对杉木幼苗不同器官NSC及其相关组分的影响;单因素方差(one-way ANOVA)分析不同降水量同一降水间隔不同器官NSC及其相关组分的差异。

    降水量对杉木幼苗不同器官可溶性糖质量分数具有极显著影响(P<0.01),降水间隔则整体无显著影响(表1)。由图1可知:降水间隔对运输根和叶的可溶性糖质量分数有显著影响(P<0.05),对吸收根、枝干和枝条无显著影响。T5处理下,随着降水量的减少,可溶性糖质量分数在吸收根、叶和枝条中呈先增加后减少的趋势,其中,枝条可溶性糖质量分数在W-80%处理下最小,显著低于ck (P<0.05),比ck降低了71.9%;可溶性糖质量分数在运输根和枝干中表现为持续减少,均在W-80%处理下最小,显著低于ck (P<0.05),分别降低了72.8%和63.1%。T10处理下,随着降水量减少,可溶性糖质量分数在吸收根、叶和枝条中呈先增加后减少的趋势,其中,吸收根的可溶性糖质量分数在W-30%处理下最大,显著高于ck (P<0.05),为ck的9.6倍;在运输根和枝干中可溶性糖质量分数表现为先减少后增加再减少,均在W-80%处理下最小,显著低于ck (P<0.05),分别降低了87.9%和65.8%。

    表 1  降水格局对杉木幼苗不同器官可溶性糖、淀粉、NSC质量分数影响的线性混合模型分析
    Table 1  Effect of precipitation patterns on soluble sugar, starch and NSC content of different organs of C. lanceolata seedlings based on analysis of linear mixed-effects models
    影响因素可溶性糖淀粉NSC
    FPFPFP
    W29.06<0.00187.72<0.001129.55<0.001
    T0.980.3200.200.6602.730.100
    G66.30<0.001119.74<0.00198.46<0.001
    W×T2.56<0.1002.18<0.1009.28<0.001
    W×G5.42<0.00111.79<0.00120.13<0.001
    T×G3.83<0.0100.380.8203.98<0.010
    W×T×G0.960.4904.57<0.0014.03<0.001
      说明:W. 不同降水量处理;T. 不同降水间隔处理;G. 杉木幼苗不同器官;×表示交互作用。P<0.01表示差异极显著。
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    图 1  不同降水量和降水间隔对杉木幼苗各器官可溶性糖质量分数的影响
    Figure 1  Effects of different precipitation amount and intervals on soluble sugar content in different organs of C. lanceolata seedlings

    降水量对杉木幼苗不同器官淀粉质量分数具有极显著影响(P<0.01),降水间隔则整体无显著影响(表1)。由图2可知:T5处理下,随着降水量的减少,淀粉质量分数在吸收根、运输根和叶中呈先增加后减少的趋势,其中,运输根和叶的淀粉质量分数在W-30%处理下最大,均显著高于ck (P<0.05),分别为ck的2.6和1.9倍。T10处理下,随着降水量的减少,淀粉质量分数在吸收根、运输根、叶、枝干和枝条中均呈先增加后减少的趋势,其中,运输根的淀粉质量分数在W-80%处理下最小,显著低于ck (P<0.05),比ck降低了78.0%;叶的淀粉质量分数在W-30%处理下最大,显著高于ck (P<0.05),为ck的2.5倍;枝干的淀粉质量分数在W-50%处理下最大,显著高于ck (P<0.05),为ck的1.8倍。

    图 2  不同降水量和降水间隔对杉木幼苗各器官淀粉质量分数的影响
    Figure 2  Effects of different precipitation amount and intervals on starch content in different organs of C. lanceolata seedlings

    降水量对杉木幼苗不同器官NSC质量分数具有极显著影响(P<0.01),降水量和降水间隔的共同作用对NSC质量分数整体有极显著影响(P<0.01),降水间隔则整体无显著影响(表1)。T5处理下,随着降水量的减少,NSC质量分数在吸收根、运输根、叶和枝条中呈先增加后减少的趋势(图3),其中,吸收根和叶的NSC质量分数在W-50%处理下最大,均显著高于ck (P<0.05),分别为ck的3.6和2.2倍;运输根和枝条的NSC质量分数在W-80%处理下最小,均显著低于ck (P<0.05),分别降低了79.5%和63.3%;NSC质量分数在枝干中表现为持续减少,在W-80%处理下最小,显著低于ck (P<0.05),比ck降低了53.9%。T10处理下,随着降水量的减少,NSC质量分数在吸收根、叶和枝条中呈先增加后减少的趋势,且吸收根、叶和枝条的NSC质量分数均在W-50%处理下最大,显著高于ck (P<0.05),分别为ck的5.3、3.0和1.7倍;NSC质量分数在运输根中表现为先减少后增加再减少,在枝干中表现为持续减少,均在W-80%处理下最小,显著低于ck (P<0.05),分别降低了88.7%和61.5%。

    图 3  不同降水量和降水间隔对杉木幼苗各器官NSC质量分数的影响
    Figure 3  Effects of different precipitation amount and intervals on NSC content in different organs of C. lanceolata seedlings

    NSC在树木生长和新陈代谢过程中发挥着重要作用,其质量分数和分布可用于推断植物碳储量状况以及对不同环境的生长适应性[3132]。本研究发现:杉木幼苗不同器官可溶性糖、淀粉和NSC质量分数对降水量变化具有显著响应。植物体内NSC积累可减少基本代谢活动,延长存活时间[31];可溶性糖的增加可降低植物水势,维持细胞膨胀压力,增加植物的吸水量[33];淀粉的增加可促进植物抗性的提高,在逆境条件下为植物提供更多的能量[34]。当降水量减少时,杉木幼苗可溶性糖主要分布于叶、枝条和枝干等地上部分,这可能是因为树干、枝条、叶中的淀粉水解转化为可溶性糖,有利于提高渗透势,促进植物吸水,最终增强植物光合固碳的过程并促进植物生长[35],且树干和枝条中更多的NSC也有利于提高杉木幼苗的抗逆性[36]。这说明可溶性糖直接参与植物的生理活动,其渗透调节功能是植物应对干旱胁迫的重要方式[37],而叶、枝条和枝干是树木的碳源器官[38],树木代谢活动的中间产物暂时储存在叶片中,降水量减少情况下需要大量的可溶性糖来帮助其维持正常的细胞张力[39]。植物体内可溶性糖和淀粉成分的比例和动态变化,即NSC的储存和转化机制,在缺水条件下可以维持植物生长、呼吸、繁殖等功能[40]。一定程度的干旱会促进植物体淀粉转化为可溶性糖,维持细胞膨压、抵御并适应干旱环境[41]。而淀粉作为植物体内重要的能量储存物质,其质量分数高低代表了植物耐受力的强弱。当降水量减少到一定程度时(W-30%、W-50%),淀粉主要存在于运输根和枝干等运输器官中。植物具有固碳能力,杉木幼苗通过存储更多的淀粉来应对缺水环境,以保持其新陈代谢的稳定[42];但降水量过少时(W-80%),树木会加快分解淀粉[43],导致淀粉质量分数先增后降。因此,降水量减少到一定程度时,会促进杉木幼苗的生长,导致NSC及其组分在植物体内形成和积累;杉木幼苗对降水量变化的响应是增加运输根、吸收根、叶和枝条的可溶性糖和淀粉,同时将吸收根中的淀粉水解为可溶性糖,以调节细胞内的水势,从而应对降水格局的变化。当降水量过少时,杉木幼苗通过减少运输根、枝干和枝条的NSC来应对降水格局的变化,各器官内的可溶性糖和淀粉质量分数并未发生转化,这是因为降水量过少时杉木会消耗体内的NSC及其组分,优先供给吸收根的生存需求。这与云南松Pinus yunnanensis[44]及樟子松Pinus sylvestris var. mongolica[45]的研究结果相似。

    降水的频率是影响植物生存、生长、物种组成及结构的重要因素[46],降水间隔的变化会影响植物遭受干旱的持续时间,而植物正常的生理代谢活动如生长、光合作用、呼吸作用等会受到干旱胁迫的影响,破坏植物体内碳供需的平衡,碳的转化和储存之间的关系也会随之改变,此时植物会调动储存在机体内的NSC,使其发生转移或转化,引起不同干旱时间下NSC的动态变化[47]。本研究发现:降水间隔和杉木幼苗不同器官之间的交互作用显著影响可溶性糖和NSC质量分数。随着降水间隔的增加,杉木幼苗各器官NSC及其组分质量分数呈波动性变化,运输根和叶的可溶性糖有显著差异,与T5处理相比,T10处理下叶的可溶性糖质量分数显著下降,运输根的可溶性糖质量分数显著上升;运输根和叶的NSC质量分数有显著差异,与T5处理相比,延长降水间隔导致叶和运输根的NSC质量分数显著上升。可能是因为延长降水间隔时,杉木新吸收的碳水化合物主要流向运输根,以维持资源供应;可溶性糖在叶片中转化为淀粉,增加细胞膨胀压力,提高杉木的抗旱能力。在延长降水间隔的条件下,杉木选择将生物量更多地分配给能够获取资源的器官(根和叶),而非主要起运输和支持作用的器官(茎),尽可能增大叶片面积来增加叶片碳水化合物的供应,从而维持自身的光合和生长过程,这与郭旭曼等[48]在桢楠Phoebe zhennan上的研究相似。杉木幼苗各器官的NSC并没有全部随着时间的推移而减少,这可能是由于在长期无降水的情况下,植物体内储存的碳未被充分利用或碳储量的利用率有限,因此即使植物死亡也不会发生碳耗竭[4950]。由于杉木林深层土壤含水量较低,干旱下幼苗可通过降低生长,将NSC及其相关组分供给根系等获取水分的器官,但仍需根据当地气候条件来调整浇水间隔,高降水量条件下适当延长降水间隔更有利于植物利用地表和深层土壤水分[51],使幼苗更好地成长。建议维持土壤含水量不低于当地多年旱季月平均降水量的50%,以保证杉木林中萌发的幼苗能够存活,完成天然更新。在经济条件较好的地区,可以实行定期喷灌的管理,保持土壤含水量在当地多年旱季月平均降水量的70%以上,同时根据当地气候条件可以适当延长浇水间隔,提高杉木幼苗存活率。

    为适应环境的变化,不同降水格局下杉木幼苗NSC及其相关组分会发生不同的转化和增减。当降水量减少时,杉木幼苗叶、枝条和枝干等地上器官NSC中可溶性糖的转化比例增加,储藏在根系,由运输根转移至吸收根,促进植物生长;延长降水间隔能促使杉木幼苗叶中的NSC转移到根系,提高根系水分获取能力,防止植物因缺水而死亡。为提高杉木人工林在降水格局变化下的存活率,土壤含水量应保持在当地多年旱季月平均降水量的50%以上,降水量较高地区可以适当延长浇水间隔。

  • 图  1  毛竹PeKdsD基因开放读码框区及预测的氨基酸序列

    Figure  1  ORF of PeKdsD gene and the corresponding amino acid sequence

    图  2  不同物种Kd.D氨基酸多序列比对

    Figure  2  Sequence multiple alignment of KdsD from different species

    图  3  不同物种KdsD氨基酸序列构建的分子系统进化树

    Figure  3  Molecular phylogenetic tree of KdsD from different species

    图  4  PeKdsD在毛竹不同组织中的表达分析

    Figure  4  Relative expression of PeKdsD in the root, shoot and leaf of Phyllostachys edulis

    图  5  PeKdsD在表达菌株E. coli(Ril)中的表达(A)和PeKdsD 的Ni-NTA 亲和层析纯化的SDS-PAGE 检测(B)

    Figure  5  Prokaryotic expression of PeKdsD in Escherichia coli(Ril) cell (A) and SDS-PAGE analysis from Ni-NTA affinity chromatography of PeKdsD (B)

    图  6  PeKdsD分子筛层析图

    Figure  6  Purification of PeKdsD by size exclusion chomatography

    图  7  温度(A)和pH值(B)对酶活性的影响

    Figure  7  Effect of temperature and pH value on activity of enzyme

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出版历程
  • 收稿日期:  2015-11-03
  • 修回日期:  2015-12-09
  • 刊出日期:  2016-12-20

毛竹阿拉伯糖-5-磷酸异构酶的基因克隆、原核表达及纯化

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.2016.06.002
    基金项目:

    浙江省自然科学基金资助项目 Y14C160039

    作者简介:

    屈亚平,从事生物技术与种质创新研究。E-mail:1173714002@qq.com

    通信作者: 张智俊,副教授,博士,从事生物技术与种质创新研究。E-mail:397942805@qq.com
  • 中图分类号: S722

摘要: 毛竹Phyllostachys edulis阿拉伯糖-5-磷酸异构酶(PeKdsD)是2-酮-3-脱氧辛糖酸(KDO)生物合成途径的第1个关键酶。采用逆转录实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)克隆得到毛竹KdsD基因。该基因cDNA全长1 038 bp,编码346个氨基酸;对不同物种来源的KdsD氨基酸序列进行比对和系统进化树分析。结果表明:毛竹的KdsD与玉米Zea mays等植物来源的KdsD有很高的序列一致性,而与微生物来源的KdsD序列一致性较低。毛竹不同组织实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)结果表明:PeKdsD基因在叶中表达量远远高于其他组织。在大肠埃希菌Escherichia coli原核表达系统中获得了KdsD的可溶性高表达蛋白,将大量表达的重组蛋白经过Ni-NTA亲和层析和分子筛层析(SEC)进行纯化,发现KdsD在溶液(30 mmol·L-1三羟甲基氨基甲烷pH 8.0,200 mmol·L-1氯化钠)中以多种聚体的形式存在;酶学性质测定的结果表明:毛竹KdsD酶最适pH值为pH 8.5,最适作用温度为37℃。此结果为后期研究植物KdsD蛋白的结构与功能奠定了基础。图7参17

English Abstract

付小斌, 陈琦, 刘苑秋, 等. 降水格局变化对杉木幼苗不同器官非结构性碳水化合物的影响[J]. 浙江农林大学学报, 2024, 41(6): 1114-1123. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20240253
引用本文: 屈亚平, 张智俊, 王超莉, 等. 毛竹阿拉伯糖-5-磷酸异构酶的基因克隆、原核表达及纯化[J]. 浙江农林大学学报, 2016, 33(6): 928-934. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.2016.06.002
FU Xiaobin, CHEN Qi, LIU Yuanqiu, et al. Effects of precipitation pattern change on non-structural carbohydrates in different organs of Cunninghamia lanceolata seedlings[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2024, 41(6): 1114-1123. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20240253
Citation: QU Yaping, ZHANG Zhijun, WANG Chaoli, et al. Gene cloning, expression, and purification of the arabinose-5-phosphate isomerase from Phyllostachys edulis[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2016, 33(6): 928-934. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.2016.06.002
  • 果胶类多糖广泛分布于高等植物的根、茎、叶、果实等的细胞初生壁和细胞间隙,对细胞组织起着软化和黏合作用,同时还是抵御病原体微生物入侵的天然屏障[1]。2-酮-3-脱氧辛糖酸(KDO)是果胶类多糖鼠李半乳糖醛酸聚糖-Ⅱ(Rhamnogalacturonans Ⅱ,RG-Ⅱ)成分中很少见的八碳糖[2],在进化过程中非常保守,对花粉管的伸长和生长具有一定的作用[3-4]。KDO合成过程中涉及到5种酶[5],其中阿拉伯糖-5-磷酸异构酶(D-arabinose 5-phosphate isomerase,KdsD)是KDO生物合成过程中的第1个关键酶,可以催化核酮糖-5-磷酸(D-ribulose 5-phosphate,Ru5P)的异构化,以产生在KDO生物合成途径中的第1个中间产物D-阿拉伯糖-5-磷酸(D-arabinose 5-phosphate,A5P)。KDO最初是在革兰氏阴性菌中发现的,它连接O-特异侧链与类脂A共同嵌入细胞壁外膜上[6]。细胞壁中KDO合成的阻断会导致类脂A物质的累积和细胞生长停滞[7]。研究发现,KDO生物合成途径也存在于藻类植物与高等植物中[2, 8]。大肠埃希菌Escherichia coli中的KdsD晶体结构已经被解析,它是一个同源四聚体[9-11]。每个KdsD亚基包含2个不同的结构域:N-末端糖异构酶(SIS)结构域,主要参与磷糖异构化作用,以及1对未知功能的胱硫醚-β-合酶(CBS)结构域。通过定点突变确定了大肠埃希菌的Lys59,His88和His193对应于绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa的Lys56,His85和His190[12-14]分别是其活性重要的保守残基。目前,植物中KdsD的研究很少,其晶体结构也尚不清楚,植物来源的KdsD酶功能及催化作用机制、酶的催化特性等科学问题仍需要更加深入研究。毛竹Phyllostachys edulis是中国广泛分布的一种经济价值很高的植物,在林业生产中的地位至关重要。本研究拟克隆毛竹KdsD基因,分析它在不同组织的表达特异性,进行生物信息学分析和原核表达,经过Ni-NTA亲和层析和分子筛层析(SEC)纯化获得高纯度的蛋白,并对其酶学性质进行分析,为后续KdsD晶体学结构和植物KdsD基因功能的研究打下理论基础。

    • 毛竹采自浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地,取半年生毛竹实生苗新鲜的根、茎、叶分装于冻存管中,于液氮中速冻,放-80 ℃冰箱备用。

    • 取毛竹新鲜的根、茎、叶在液氮中迅速研磨成粉末,用Trizol法[15]提取总RNA,用脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)消除DNA污染。分别以毛竹约1.0 μg的根、茎、叶RNA为模板,利用逆转录试剂盒合成cDNA。

    • 通过美国生物技术信息中心(NCBI)数据库获得拟南芥Arabidopsis thalianaKdsD基因序列,检索毛竹数据库,得到一条同源序列。根据该基因的开放读码框(ORF)设计引物。上游BamH I酶切位点引物5′-CGGGATCCATGGGCTCGCTCCCCGTGCCCT-3′;下游Hind Ⅲ酶切位点引物5′-CCAAGCTTTTATAATCCAGCAGAGACCAAT-3′(酶切位点用下划线显示)。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以反转录后的cDNA 为模板进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。将PCR扩增产物电泳分析后经DNA胶回收试剂盒回收,获得的目的DNA片段插入经同样酶切后的pE-SUMO表达载体,得到1个N-末端含有6个His亲和标签的重组质粒。将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中,提取阳性克隆质粒进行双酶切和单酶切验证。

    • 根据毛竹KdsD基因的保守序列设计qRT-PCR引物(正向引物:GTGTTGGATTCTGGATGGTTC;反向引物:CAGCCGTAGTGGTGAATGAGTAAC)。内参Actin(正向引物:CGACATTGGCTCGCTCTTC;反向引物:CGGCAGAGGTGAGGGAGAT),使用荧光定量PCR仪对PeKdsD基因在根、茎、叶不同组织的表达量进行分析。

    • 将构建好的重组表达质粒转化到表达菌株E. coli(Ril)中,挑取单克隆,接入2 mL 溶菌肉汤(LB)培养基(A+)37 ℃培养,当菌体吸光度D(600)达到0.5~0.8时,加入终浓度为0.4 mmol·L-1的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,分别在37 ℃摇床上诱导3 h,在20 ℃摇床上过夜诱导,最后收集菌体,超声破碎,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白表达情况。

    • 在确定的最佳温度表达条件下,将菌株接种于1.0 L LB培养基中进行扩大培养。加入诱导剂后,菌液在20 ℃,220 r·min-1条件下过夜培养。离心收集菌体,将裂解液[1.0 mol·L-1氯化钠,30.0 mmol·L-1三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl),体积分数为5%的甘油]加入到收集的菌体中,超声破碎细胞后,20 000 r·min-1,4 ℃条件下离心45 min,将上清转移至镍柱,置于摇床缓慢结合1 h,后分别用低浓度咪唑缓冲液洗脱杂蛋白,用高浓度咪唑缓冲液洗脱目的蛋白。将目的蛋白收集在10 kDa浓缩柱中离心进行浓缩,至体积为500.0 μL左右。使用分子筛层析柱SuperoseTM 12 10/300 GL上样,根据蛋白的出峰顺序收集蛋白,用SDS-PAGE胶检测蛋白的纯度,将较高纯度的蛋白收集浓缩,置于-80 ℃保存。

    • 酶活力测定采用半胱氨酸-咔唑法[16-17]。25.0 μL的酶用100.0 mmol·L-1 Tris-HCl,pH 8.5配制,37 ℃保温3 min,加入25.0 μL 2.0 mmol·L-1 阿拉伯糖-5-磷酸(A5P),37 ℃反应5 min,加入50.0 μL 12.5 mol·L-1硫酸终止反应,采用半胱氨酸-咔唑法显色,测定D(540) nm吸光度。酶活力单位(1 U=16.67 nkat)定义为: 以A5P为底物,每分钟催化产生1.0 μmol的核酮糖-5-磷酸(Ru5P)所需的酶量。所有酶活测定结果均为3次重复平行试验数据的平均值。

    • 最适pH值的测定,将样品KdsD稀释在100.0 mmol·L-1不同pH值缓冲液中,MES缓冲液从pH 6.0~6.5,Tris-HCl缓冲液从pH 7.0~9.0。37 ℃反应5 min,测定酶活。最适温度则是在测定的最适pH值下,将反应温度控制在25~65 ℃,隔10 ℃进行酶促反应,然后测定酶活性。

    • PeKdsD基因经PCR扩增重组后测序,得到1条开放读码框(ORF)为1 038 bp的目的片段。该基因编码346个氨基酸(图 1)。将PCR产物与pE-SUMO表达载体连接,产物转化到DH5α,挑取阳性菌落进行菌检测出,成功构建原核表达载体。

      图  1  毛竹PeKdsD基因开放读码框区及预测的氨基酸序列

      Figure 1.  ORF of PeKdsD gene and the corresponding amino acid sequence

    • 通过blast在线软件分析,结果显示,PeKdsD含有2个不同的结构域:SIS结构域和CBS结构域,大肠埃希菌序列中关键的催化残基Lys59,His88和His193在毛竹中是完全保守的。PeKdsD编码的氨基酸序列与玉米Zea mays,高粱Sorghum bicolor和水稻Oryza sativa具有较高的一致性,均为91.00%,与杨树Populus trichocarpa和拟南芥的一致性分别为69.00%和66.38%,而与大肠埃希菌和脆弱拟杆菌Bacteroides fragilis的一致性分别只有29.21%和31.12%(图 2)。采用MEGA6软件构建不同物种KdsD氨基酸序列的系统进化树(图 3),结果表明:毛竹与玉米位置较近,位于同一个分支上;与杨树、水稻位于同一大分支上,与拟南芥和脆弱拟杆菌分支较远。

      图  2  不同物种Kd.D氨基酸多序列比对

      Figure 2.  Sequence multiple alignment of KdsD from different species

      图  3  不同物种KdsD氨基酸序列构建的分子系统进化树

      Figure 3.  Molecular phylogenetic tree of KdsD from different species

    • PeKdsD不同组织qRT-PCR结果显示:PeKdsD在毛竹的根、茎、叶中均有表达,但在表达量上存在较大的差异,在叶中的表达量远远大于根与茎(图 4)。

      图  4  PeKdsD在毛竹不同组织中的表达分析

      Figure 4.  Relative expression of PeKdsD in the root, shoot and leaf of Phyllostachys edulis

    • PeKdsD重组载体转化到表达菌株E. coli(Ril)感受态细胞,使用IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达及可溶性情况(图 5A)。对比发现表达菌株Ril在20 ℃培养温度下表达量相对较高,故在后续试验中确定重组蛋白诱导表达的最佳温度为20 ℃。

      图  5  PeKdsD在表达菌株E. coli(Ril)中的表达(A)和PeKdsD 的Ni-NTA 亲和层析纯化的SDS-PAGE 检测(B)

      Figure 5.  Prokaryotic expression of PeKdsD in Escherichia coli(Ril) cell (A) and SDS-PAGE analysis from Ni-NTA affinity chromatography of PeKdsD (B)

    • 将收集的菌体超声破碎离心后,上清加入Ni-NTA柱,冰上结合后,采用咪唑梯度洗脱蛋白,SDS-PAGE检测(图 5B)。结果显示:条带出现的位置与目的蛋白大小一致,目的蛋白被成功地纯化出来。将目的蛋白进一步经SuperoseTM 12 10/300 GL分子筛层析后,出现2个明显的吸收峰。对比小牛血清BSA出峰位置(二聚体C峰对应分子量为132.86 kDa,单聚体D峰对应分子为66.43 kDa),A峰对应是KdsD多聚体,B峰对应的是KdsD单体(图 6),说明KdsD蛋白在溶液中存在多种聚体形式。2步纯化Ni-NTA结合SEC可分离纯化得到不同状态的高纯度KdsD蛋白,可满足今后酶学特性的研究和蛋白晶体生长的要求。

      图  6  PeKdsD分子筛层析图

      Figure 6.  Purification of PeKdsD by size exclusion chomatography

    • 酶活性测定结果表明:纯化的KdsD酶最适温度为37 ℃,在35~45 ℃范围内酶活力较高,45 ℃以上酶活力急剧下降,而在25 ℃时仍保持在60%以上(图 7A);不同的pH值条件也会影响酶的活性,最适作用pH值为pH 8.5,此时活性较高,过酸或过碱环境都会对酶活性有较大的抑制作用(图 7B)。

      图  7  温度(A)和pH值(B)对酶活性的影响

      Figure 7.  Effect of temperature and pH value on activity of enzyme

    • 自2010年大肠埃希菌的KdsD结构公布后,又陆续有其他微生物的KdsD结构报道。2014年CHIU等[14]解析出了脆弱拟杆菌API(bfAPI)的晶体结构,为四聚体。但是植物来源的KdsD相关研究甚少,其结构和功能至今仍未被解析。本研究首次成功克隆到了毛竹KdsD基因,该基因具有一个完整的开放阅读框(ORF),编码346个氨基酸。生物信息学分析预测其含有2个不同的结构域:N-末端糖异构酶(SIS)结构域和胱硫醚-β-合酶(CBS)结构域。尽管大肠埃希菌序列中关键的催化残基Lys59,His88和His193在毛竹中是完全保守的,但是毛竹KdsD蛋白序列与大肠埃希菌KdsD蛋白序列相似度不足30%,因此,推测植物KdsD与微生物中的KdsD蛋白空间结构和功能可能存在一定的差异。为进一步了解植物KdsD和微生物KdsD结构上的差异,还需进一步纯化获得高纯度的蛋白,进行蛋白结晶,通过X射线等方面的研究进一步分析验证结构与功能的关系。实时定量PCR在根、茎、叶中均检测到有表达,尤其在叶中表达量比其他组织高约5~8倍,表现出明显的组织特异性现象。Ni-NTA纯化显示所得的目的蛋白大小与预测的蛋白分子量相一致,成功纯化出了PeKdsD蛋白。进一步的SEC纯化结果表明:毛竹KdsD在30 mmol·L-1 Tris-HCI pH 8.0,200 mmol·L-1氯化钠溶液条件,以多聚体混合的形式存在,SEC中KdsD的多聚体究竟是几聚体还需分析超速离心(AUC)等实验做进一步的分析验证。酶学性质初步测定结果表明:PeKdsD的最适温度为37 ℃,最适pH值为pH 8.5。最适pH值与预测的pH值有所偏差,故后期试验采用pH 8.5为宜。当然,要揭示毛竹KdsD酶功能及催化作用机制,还有待于后续晶体结构与功能等方面的进一步深入研究。

参考文献 (17)

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