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果胶类多糖广泛分布于高等植物的根、茎、叶、果实等的细胞初生壁和细胞间隙，对细胞组织起着软化和黏合作用，同时还是抵御病原体微生物入侵的天然屏障[1]。2-酮-3-脱氧辛糖酸（KDO）是果胶类多糖鼠李半乳糖醛酸聚糖-Ⅱ（Rhamnogalacturonans Ⅱ，RG-Ⅱ）成分中很少见的八碳糖[2]，在进化过程中非常保守，对花粉管的伸长和生长具有一定的作用[3-4]。KDO合成过程中涉及到5种酶[5]，其中阿拉伯糖-5-磷酸异构酶（D-arabinose 5-phosphate isomerase，KdsD）是KDO生物合成过程中的第1个关键酶，可以催化核酮糖-5-磷酸（D-ribulose 5-phosphate，Ru5P）的异构化，以产生在KDO生物合成途径中的第1个中间产物D-阿拉伯糖-5-磷酸（D-arabinose 5-phosphate，A5P）。KDO最初是在革兰氏阴性菌中发现的，它连接O-特异侧链与类脂A共同嵌入细胞壁外膜上[6]。细胞壁中KDO合成的阻断会导致类脂A物质的累积和细胞生长停滞[7]。研究发现，KDO生物合成途径也存在于藻类植物与高等植物中[2, 8]。大肠埃希菌Escherichia coli中的KdsD晶体结构已经被解析，它是一个同源四聚体[9-11]。每个KdsD亚基包含2个不同的结构域：N-末端糖异构酶（SIS）结构域，主要参与磷糖异构化作用，以及1对未知功能的胱硫醚-β-合酶（CBS）结构域。通过定点突变确定了大肠埃希菌的Lys59，His88和His193对应于绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa的Lys56，His85和His190[12-14]分别是其活性重要的保守残基。目前，植物中KdsD的研究很少，其晶体结构也尚不清楚，植物来源的KdsD酶功能及催化作用机制、酶的催化特性等科学问题仍需要更加深入研究。毛竹Phyllostachys edulis是中国广泛分布的一种经济价值很高的植物，在林业生产中的地位至关重要。本研究拟克隆毛竹KdsD基因，分析它在不同组织的表达特异性，进行生物信息学分析和原核表达，经过Ni-NTA亲和层析和分子筛层析（SEC）纯化获得高纯度的蛋白，并对其酶学性质进行分析，为后续KdsD晶体学结构和植物KdsD基因功能的研究打下理论基础。
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毛竹采自浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，取半年生毛竹实生苗新鲜的根、茎、叶分装于冻存管中，于液氮中速冻，放-80 ℃冰箱备用。
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取毛竹新鲜的根、茎、叶在液氮中迅速研磨成粉末，用Trizol法[15]提取总RNA，用脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）消除DNA污染。分别以毛竹约1.0 μg的根、茎、叶RNA为模板，利用逆转录试剂盒合成cDNA。
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通过美国生物技术信息中心（NCBI）数据库获得拟南芥Arabidopsis thaliana的KdsD基因序列，检索毛竹数据库，得到一条同源序列。根据该基因的开放读码框（ORF）设计引物。上游BamH I酶切位点引物5′-CGGGATCCATGGGCTCGCTCCCCGTGCCCT-3′；下游Hind Ⅲ酶切位点引物5′-CCAAGCTTTTATAATCCAGCAGAGACCAAT-3′（酶切位点用下划线显示）。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以反转录后的cDNA 为模板进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。将PCR扩增产物电泳分析后经DNA胶回收试剂盒回收，获得的目的DNA片段插入经同样酶切后的pE-SUMO表达载体，得到1个N-末端含有6个His亲和标签的重组质粒。将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，提取阳性克隆质粒进行双酶切和单酶切验证。
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根据毛竹KdsD基因的保守序列设计qRT-PCR引物（正向引物：GTGTTGGATTCTGGATGGTTC；反向引物：CAGCCGTAGTGGTGAATGAGTAAC）。内参Actin（正向引物：CGACATTGGCTCGCTCTTC；反向引物：CGGCAGAGGTGAGGGAGAT），使用荧光定量PCR仪对PeKdsD基因在根、茎、叶不同组织的表达量进行分析。
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将构建好的重组表达质粒转化到表达菌株E. coli（Ril）中，挑取单克隆，接入2 mL 溶菌肉汤（LB）培养基（A+）37 ℃培养，当菌体吸光度D（600）达到0.5~0.8时，加入终浓度为0.4 mmol·L-1的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，分别在37 ℃摇床上诱导3 h，在20 ℃摇床上过夜诱导，最后收集菌体，超声破碎，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）检测蛋白表达情况。
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在确定的最佳温度表达条件下，将菌株接种于1.0 L LB培养基中进行扩大培养。加入诱导剂后，菌液在20 ℃，220 r·min-1条件下过夜培养。离心收集菌体，将裂解液[1.0 mol·L-1氯化钠，30.0 mmol·L-1三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl），体积分数为5%的甘油]加入到收集的菌体中，超声破碎细胞后，20 000 r·min-1，4 ℃条件下离心45 min，将上清转移至镍柱，置于摇床缓慢结合1 h，后分别用低浓度咪唑缓冲液洗脱杂蛋白，用高浓度咪唑缓冲液洗脱目的蛋白。将目的蛋白收集在10 kDa浓缩柱中离心进行浓缩，至体积为500.0 μL左右。使用分子筛层析柱SuperoseTM 12 10/300 GL上样，根据蛋白的出峰顺序收集蛋白，用SDS-PAGE胶检测蛋白的纯度，将较高纯度的蛋白收集浓缩，置于-80 ℃保存。
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酶活力测定采用半胱氨酸-咔唑法[16-17]。25.0 μL的酶用100.0 mmol·L-1 Tris-HCl，pH 8.5配制，37 ℃保温3 min，加入25.0 μL 2.0 mmol·L-1 阿拉伯糖-5-磷酸（A5P），37 ℃反应5 min，加入50.0 μL 12.5 mol·L-1硫酸终止反应，采用半胱氨酸-咔唑法显色，测定D（540） nm吸光度。酶活力单位（1 U=16.67 nkat）定义为: 以A5P为底物，每分钟催化产生1.0 μmol的核酮糖-5-磷酸（Ru5P）所需的酶量。所有酶活测定结果均为3次重复平行试验数据的平均值。
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最适pH值的测定，将样品KdsD稀释在100.0 mmol·L-1不同pH值缓冲液中，MES缓冲液从pH 6.0~6.5，Tris-HCl缓冲液从pH 7.0~9.0。37 ℃反应5 min，测定酶活。最适温度则是在测定的最适pH值下，将反应温度控制在25~65 ℃，隔10 ℃进行酶促反应，然后测定酶活性。
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PeKdsD基因经PCR扩增重组后测序，得到1条开放读码框（ORF）为1 038 bp的目的片段。该基因编码346个氨基酸（图 1）。将PCR产物与pE-SUMO表达载体连接，产物转化到DH5α，挑取阳性菌落进行菌检测出，成功构建原核表达载体。
图 1 毛竹PeKdsD基因开放读码框区及预测的氨基酸序列
Figure 1. ORF of PeKdsD gene and the corresponding amino acid sequence
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通过blast在线软件分析，结果显示，PeKdsD含有2个不同的结构域：SIS结构域和CBS结构域，大肠埃希菌序列中关键的催化残基Lys59，His88和His193在毛竹中是完全保守的。PeKdsD编码的氨基酸序列与玉米Zea mays，高粱Sorghum bicolor和水稻Oryza sativa具有较高的一致性，均为91.00%，与杨树Populus trichocarpa和拟南芥的一致性分别为69.00%和66.38%，而与大肠埃希菌和脆弱拟杆菌Bacteroides fragilis的一致性分别只有29.21%和31.12%（图 2）。采用MEGA6软件构建不同物种KdsD氨基酸序列的系统进化树（图 3），结果表明：毛竹与玉米位置较近，位于同一个分支上；与杨树、水稻位于同一大分支上，与拟南芥和脆弱拟杆菌分支较远。
图 2 不同物种Kd.D氨基酸多序列比对
Figure 2. Sequence multiple alignment of KdsD from different species
图 3 不同物种KdsD氨基酸序列构建的分子系统进化树
Figure 3. Molecular phylogenetic tree of KdsD from different species
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PeKdsD不同组织qRT-PCR结果显示：PeKdsD在毛竹的根、茎、叶中均有表达，但在表达量上存在较大的差异，在叶中的表达量远远大于根与茎（图 4）。
图 4 PeKdsD在毛竹不同组织中的表达分析
Figure 4. Relative expression of PeKdsD in the root, shoot and leaf of Phyllostachys edulis
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将PeKdsD重组载体转化到表达菌株E. coli（Ril）感受态细胞，使用IPTG诱导表达，SDS-PAGE检测蛋白表达及可溶性情况（图 5A）。对比发现表达菌株Ril在20 ℃培养温度下表达量相对较高，故在后续试验中确定重组蛋白诱导表达的最佳温度为20 ℃。
图 5 PeKdsD在表达菌株E. coli（Ril）中的表达（A）和PeKdsD 的Ni-NTA 亲和层析纯化的SDS-PAGE 检测（B）
Figure 5. Prokaryotic expression of PeKdsD in Escherichia coli（Ril） cell （A） and SDS-PAGE analysis from Ni-NTA affinity chromatography of PeKdsD （B）
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将收集的菌体超声破碎离心后，上清加入Ni-NTA柱，冰上结合后，采用咪唑梯度洗脱蛋白，SDS-PAGE检测（图 5B）。结果显示：条带出现的位置与目的蛋白大小一致，目的蛋白被成功地纯化出来。将目的蛋白进一步经SuperoseTM 12 10/300 GL分子筛层析后，出现2个明显的吸收峰。对比小牛血清BSA出峰位置（二聚体C峰对应分子量为132.86 kDa，单聚体D峰对应分子为66.43 kDa），A峰对应是KdsD多聚体，B峰对应的是KdsD单体（图 6），说明KdsD蛋白在溶液中存在多种聚体形式。2步纯化Ni-NTA结合SEC可分离纯化得到不同状态的高纯度KdsD蛋白，可满足今后酶学特性的研究和蛋白晶体生长的要求。
图 6 PeKdsD分子筛层析图
Figure 6. Purification of PeKdsD by size exclusion chomatography
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酶活性测定结果表明：纯化的KdsD酶最适温度为37 ℃，在35~45 ℃范围内酶活力较高，45 ℃以上酶活力急剧下降，而在25 ℃时仍保持在60%以上（图 7A）；不同的pH值条件也会影响酶的活性，最适作用pH值为pH 8.5，此时活性较高，过酸或过碱环境都会对酶活性有较大的抑制作用（图 7B）。
图 7 温度（A）和pH值（B）对酶活性的影响
Figure 7. Effect of temperature and pH value on activity of enzyme
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自2010年大肠埃希菌的KdsD结构公布后，又陆续有其他微生物的KdsD结构报道。2014年CHIU等[14]解析出了脆弱拟杆菌API（bfAPI）的晶体结构，为四聚体。但是植物来源的KdsD相关研究甚少，其结构和功能至今仍未被解析。本研究首次成功克隆到了毛竹KdsD基因，该基因具有一个完整的开放阅读框（ORF），编码346个氨基酸。生物信息学分析预测其含有2个不同的结构域：N-末端糖异构酶（SIS）结构域和胱硫醚-β-合酶（CBS）结构域。尽管大肠埃希菌序列中关键的催化残基Lys59，His88和His193在毛竹中是完全保守的，但是毛竹KdsD蛋白序列与大肠埃希菌KdsD蛋白序列相似度不足30%，因此，推测植物KdsD与微生物中的KdsD蛋白空间结构和功能可能存在一定的差异。为进一步了解植物KdsD和微生物KdsD结构上的差异，还需进一步纯化获得高纯度的蛋白，进行蛋白结晶，通过X射线等方面的研究进一步分析验证结构与功能的关系。实时定量PCR在根、茎、叶中均检测到有表达，尤其在叶中表达量比其他组织高约5~8倍，表现出明显的组织特异性现象。Ni-NTA纯化显示所得的目的蛋白大小与预测的蛋白分子量相一致，成功纯化出了PeKdsD蛋白。进一步的SEC纯化结果表明：毛竹KdsD在30 mmol·L-1 Tris-HCI pH 8.0，200 mmol·L-1氯化钠溶液条件，以多聚体混合的形式存在，SEC中KdsD的多聚体究竟是几聚体还需分析超速离心（AUC）等实验做进一步的分析验证。酶学性质初步测定结果表明：PeKdsD的最适温度为37 ℃，最适pH值为pH 8.5。最适pH值与预测的pH值有所偏差，故后期试验采用pH 8.5为宜。当然，要揭示毛竹KdsD酶功能及催化作用机制，还有待于后续晶体结构与功能等方面的进一步深入研究。
Gene cloning, expression, and purification of the arabinose-5-phosphate isomerase from Phyllostachys edulis
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摘要: 毛竹Phyllostachys edulis阿拉伯糖-5-磷酸异构酶（PeKdsD）是2-酮-3-脱氧辛糖酸（KDO）生物合成途径的第1个关键酶。采用逆转录实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）克隆得到毛竹KdsD基因。该基因cDNA全长1 038 bp，编码346个氨基酸；对不同物种来源的KdsD氨基酸序列进行比对和系统进化树分析。结果表明：毛竹的KdsD与玉米Zea mays等植物来源的KdsD有很高的序列一致性，而与微生物来源的KdsD序列一致性较低。毛竹不同组织实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）结果表明：PeKdsD基因在叶中表达量远远高于其他组织。在大肠埃希菌Escherichia coli原核表达系统中获得了KdsD的可溶性高表达蛋白，将大量表达的重组蛋白经过Ni-NTA亲和层析和分子筛层析（SEC）进行纯化，发现KdsD在溶液（30 mmol·L-1三羟甲基氨基甲烷pH 8.0，200 mmol·L-1氯化钠）中以多种聚体的形式存在；酶学性质测定的结果表明：毛竹KdsD酶最适pH值为pH 8.5，最适作用温度为37℃。此结果为后期研究植物KdsD蛋白的结构与功能奠定了基础。图7参17Abstract: Phyllostachys edulis arabinose-5-phosphate isomerase (PeKdsD) is the first key enzyme in the biosynthesis of 3-deoxy-D-manno-octulosonate (KDO). The full length cDNA of the KdsD gene (1 038 bp with 346 amino acids) was cloned using reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) followed by protein Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) and phylogenetic tree analysis of the amino acid sequence. Then a qRT-PCR analysis of diverse tissues in Ph. edulis was conducted, and a mass of soluble KdsD protein was obtained through a prokaryotic expression system in Escherichia coli. The recombinant protein was further purified through Ni-NTA affinity and size exclusion chromatography (SEC) in a buffer of 30 mmol·L-1 Tris-HCl pH 8.5, 200 mmol·L-1 NaCl to determine enzymatic properties. Results of the amino acid sequence among different species indicated that the PeKdsD isomerase had a high sequence similarity with KdsD in Zea mays but was low in microorganisms. The qRT-PCR analysis of diverse tissues in Ph. edulis revealed that PeKdsD had its highest expression level in the leaf. SEC results showed that the recombinant KdsD protein existed as protein polymers, and for enzymatic properties of PeKdsD the optimum reaction temperature was 37℃ with a pH of 8.5. This work provides a basis for determining the structure and function of plant KdsD.[Ch, 7 fig. 17 ref.]
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《全国土壤污染状况调查公报》显示，中国耕地土壤污染点位超标率高达19.4%，重金属污染点位超标率为15.5%，其中镉的点位超标率为7.0%，居首位[1]。镉是一种毒性很强的人体非必需元素，极易被作物吸收进入食物链，从而危害人体健康[2]。如何阻遏环境中的镉进入食物链，已成为当前土壤及生态环境领域的研究热点之一[3]。目前，微生物修复技术成为镉污染治理的研究方向之一[4]。蒋成斌[5]筛选到2种耐镉细菌：腐败希瓦菌Shewanella putrefaciens和假单胞菌Pseudomonas sp.，在LB(Luria-Bertani)固体和液体培养上耐受重金属镉离子(Cd2+)浓度分别达到150和40 mmol·L−1。张欣等[6]在模拟镉轻度污染(1 mg·kg−1)试验中通过施入微生物菌剂(枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、光合细菌和乳酸菌)后使菠菜Spinacia oleracea镉含量平均下降14.5%。王微等[7]和何小三等[8]利用硅藻土制备的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa菌剂能够显著促进镉胁迫苗期水稻Oryza sativa的生长，抑制镉在根、茎鞘、叶片中的迁移与积累。汪敦飞等[9]研究指出：耐镉铜绿假单胞菌及其菌剂能显著提高镉胁迫水稻苗期的根系活力，增强水稻叶片抗氧化酶系统的活力，提高水稻叶片抗氧化物的含量，从而有效缓解水稻镉胁迫效应。假单胞菌为革兰氏阴性菌，环境适应能力强，世代周期短，具有根际促生能力，已被广泛用作生防菌[10-11]。本课题组前期从水稻根际土壤筛选了1株耐镉的假单胞菌TCd-1，能在高达900 mg·L−1 Cd2+下生长，在100 mg·L−1镉处理下，菌株体内吸收的镉质量分数为9.04 mg·g−1，镉富集系数达到90.4，具有较强镉富集能力，因此有应用于镉污染的修复潜力[12]。但该菌株的培养条件有待优化。响应面分析法是一种综合试验设计和数学建模的方法，既能有效减少试验次数又能考察各个因素之间的交互作用[13-14]，在优化试验设计中，被人们广泛使用[15]。胡瑞萍等[16]利用响应面法优化了枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis NHS1菌株培养基组分，使芽孢含量比优化前提高1.5倍。印杨等[17]利用响应面法优化了生防菌株(巨大芽孢杆菌Megaterium bacillus RB10)的发酵培养条件参数，证实了Box-Behnken设计的有效性和模型的准确可靠[17]。袁辉林[18]以植物促生菌SZ7-1为研究对象，在5 L自动发酵罐中采用单因素试验设计及响应曲面法进行扩大培养，结果表明：优化后的培养条件更利于菌株的生长，且活菌数是优化前的1.62倍。刘江红等[19]通过响应面法优化了芽孢杆菌Bacillus S2的培养条件，使最优乳化指数(E24)提高为81.20%。巩志金等[20]利用响应面法优化了铜绿假单胞菌产鼠李糖脂的发酵培养基，结果使其产量提高了14.43%。本研究基于响应面法通过单因素筛选试验、Plackett-Burman试验、Box-Behnken 试验和响应面分析法，对TCd-1菌株培养条件进行优化，以期为菌株潜在价值的开发利用和菌剂制备提供技术支持。
1. 材料与方法
1.1 菌种及其活化培养
供试菌株为耐镉的假单胞菌Pseudomonas sp. TCd-1(专利号CN 103952333A)[21]，甘油保存于−80 ℃冰箱。菌株活化时取出塑料冻存管，立即置于30~40 ℃恒温水浴锅中匀速摇动进行快速复苏，待冻存管内结冰全部溶解后，开启冻存管，将内容物转移至种子液培养基内培养。
种子液培养条件：采用牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠 5.0 g，琼脂 15.0~20.0 g，1.0 L蒸馏水，pH 7.2~7.4)。菌株长出后选取直径约为3 mm的菌落进行平板划线法过夜培养，再从2次培养的固体培养基上挑取1环菌落至100 mL的三角瓶，150 r·min−1，37 ℃，恒温培养18 h，制成菌株种子液。发酵培养条件：牛肉膏蛋白胨液体培养基100 mL，质量分数为0.5%氯化钠，1.0%种子液，150 r·min−1，37 ℃恒温培养24 h。
1.2 试验设计
1.2.1 单因素试验
在发酵培养条件下，选择不同氮源：N1为酵母粉，N2为硫酸铵[(NH4)2SO4]，N3为硝酸铵(NH4NO3)，N4为蛋白胨，N5为硝酸钾(KNO3)，N6为氯化铵(NH4Cl)，N7为硝酸纳(NaNO3)，设置质量分数为0.5%、1.0%、1.5% 3个水平；不同碳源：C1为牛肉膏，C2为可溶性淀粉，C3为葡萄糖，C4为蔗糖，设置质量分数为0.1%、0.3%、0.5% 3个水平；不同无机盐：W1为氯化钙(CaCl2)，W2为氯化镁(MgCl2)，W3为氯化钠(NaCl)，W4为氯化钾(KCl)，W5为磷酸氢二钠(Na2HPO4)，W6为硫酸钠(Na2SO4)，W7为磷酸二氢钠(NaH2PO4)，设置质量分数为0.2%、0.5%、0.8% 3个水平。以菌株最大吸收波长660 nm下的吸光度D(660)作为评价指标，筛选最适的碳源、氮源、无机盐及其质量分数。
1.2.2 Plackett-Burman试验
根据单因素试验得到的最适碳源(牛肉膏)、氮源(酵母粉)、无机盐(MgCl2)，进行Plackett-Burman试验。试验设计如表1。试验次数 n=12，各因素水平设置为高低2个水平，高水平(1)取值为低水平(−1)的1.25倍，其中 D、H、K为空白试验，用于误差估计。考察牛肉膏(A)、酵母粉(B)、MgCl2(C)、培养温度(E)、初始pH(F)、接菌量(G)、培养时间(I)和转速(J) 8个因素对菌株生长的影响，确定影响菌株生长的关键因素。
表 1 Plackett-Burman试验设计因素和水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design因素 水平 因素 水平 因素 水平 −1 1 −1 1 −1 1 A 牛肉膏/% 4.0 5.0 E 温度/% 30.0 37.50 I 培养时间/h 20 24 B 酵母粉/% 0.8 1.0 F 初始pH 6.0 7.50 J 转速/(r·min−1) 160 200 C MgCl2/% 4.0 5.0 G 接菌量/% 1.0 1.250 K 空白3 D 空白1 H 空白2 1.2.3 最陡爬坡及Box-Behnken试验
根据Plackett-Burman试验筛选得到的显著影响菌株生长的关键因素(酵母粉、温度、初始pH)，确定最陡爬坡试验的步长和方向，获得最佳的响应区域。
以最陡爬坡试验得到最佳响应区域(2号试验)作为Box-Behnken试验设计的中心点，各因素取3个水平，以(−1，0，1)表示，设计包括了5个中心点(0，0，0)，即酵母粉0.9%、温度35 ℃、pH 7，共17个组合的响应面试验。各处理3次重复。
表 4 最陡爬坡试验Table 4 Factors and levels of steepest ascent design试验
号B 酵
母粉/%E 温
度/℃F 初
始pH编码 吸光度 1 0.8 40 8.0 (−1，1，1) 1.079±0.058 c 2 0.9 35 7.0 (0，0，0) 1.720±0.006 a 3 1.0 30 6.0 (1，−1，−1) 1.681±0.015 b 说明：不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) 1.2.4 响应面分析
根据Box-Behnken试验结果，进行方差分析，并拟合线性回归方程，检验拟合防方程的符合程度；利用拟合方程获得最佳培养条件，并在最佳培养条件下进行验证试验。
1.3 数据处理
数据处理和作图使用Excel 2016进行，统计分析使用Design Experts 10和IBM SPSS 22。试验结果以平均值±标准差表示，采用Duncan法进行数据差异显著性检验(P=0.05)。
2. 结果与分析
2.1 单因素试验结果
结果表明：碳源种类及其质量分数显著影响菌株的生长(图1A)，菌液吸光度随牛肉膏、可溶性淀粉质量分数的提高而增大，而葡萄糖和蔗糖质量分数对菌液吸光度的影响较小。各处理中以0.5%牛肉膏培养的吸光度(1.257)最高，显著高于其他各处理(P＜0.05)，比可溶性淀粉的最大值高10.8%，比葡萄糖和蔗糖的最大值分别提高了17.7%和23.6% (图1A)。不同氮源及其质量分数显著(P＜0.05)影响菌株的生长(图1B)，有机氮源(酵母粉、蛋白胨)更利于菌株生长，各处理中以1.0%酵母粉处理的吸光度(1.266)最高，比1.0%蛋白胨高14.2%，比硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾、氯化铵和硝酸钠处理的最大吸光度分别高出62.7%、79.8%、76.8%、52.7%、87.0%。不同无机盐显著(P＜0.05)影响菌株的生长(图1C)。培养基含0.5%镁离子时的菌液吸光度(1.197)最高，而钙离子最不利于菌株生长；培养基含0.5%的氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、硫酸钠、磷酸二氢钠与含0.8%的氯化镁、氯化钾、磷酸二氢钠间无显著性差异。可见，选择0.5%牛肉膏、1.0%酵母粉及0.5% MgCl2作为基础培养基是最合适的。
图 1 不同碳源(A)、氮源(B)、无机盐(C)对菌株生长影响Figure 1 Effect of carbon source(A)，nitrogen source(B)，inorganic salt (C) on the growth of strains不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)2.2 Plackett-Burman 试验结果
Plackett-Burman试验结果显示：菌株生长在不同处理间存在显著差异(表2)，以8号、9号、10号吸光度高，且之间无显著性差异。9号吸光度 (1.802)最高，比最低5号(0.981)的值高83.7%。
表 2 Plackett-Burman 试验结果Table 2 Results of Plackett-Burman design试验号 A 牛肉膏 B 酵母粉 C 氯化镁 D 空白1 E 温度 F pH G 接菌量 H 空白2 I 时间 J 转速 K 空白3 吸光度 1 1 1 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1 −1 1.235±0.078 f 2 −1 1 1 −1 1 1 1 −1 1 −1 −1 1.358±0.030 e 3 1 −1 1 1 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1.563±0.058 b 4 −1 1 −1 1 1 −1 1 1 −1 −1 1 1.397±0.021 de 5 −1 −1 1 −1 1 1 −1 1 −1 1 1 0.981±0.042 h 6 −1 −1 −1 1 −1 1 1 −1 1 1 1 1.440±0.028 cd 7 1 −1 −1 −1 1 −1 1 1 1 1 −1 1.121±0.026 g 8 1 1 −1 −1 −1 1 −1 1 1 −1 1 1.756±0.010 a 9 1 1 1 −1 −1 −1 1 −1 −1 1 1 1.802±0.003 a 10 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1 1 1 −1 1.783±0.012 a 11 1 −1 1 1 1 −1 −1 −1 1 −1 1 1.195±0.096 fg 12 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 −1 1.492±0.041 bc 说明：不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) 进一步的因子分析(表3)结果表明：在设定的试验条件下，显著影响菌株生长的因子为酵母粉(B)、温度(E)和pH (F)，显著性程度从大到小依次为温度、酵母粉、pH。确定这3个因素为影响菌株生长的关键因素，进行最陡爬坡试验。
表 3 Plackett-Burman试验显著性分析结果Table 3 Results of Plackett-Burman design来源 均方和 自由度 均方 F P 显著性 效应系数 显著性排序 效应正负 模型 0.780 00 8 0.098 00 70.01 0.002 5 ** 1.430 A 牛肉膏 0.004 07 1 0.004 07 2.91 0.186 5 0.018 7 ＋ B 酵母粉 0.200 00 1 0.200 00 141.15 0.001 3 ** 0.130 2 ＋ C 氯化镁 0.004 84 1 0.004 84 3.46 0.159 8 0.020 5 ＋ E 温度 0.540 00 1 0.540 00 387.22 0.000 3 ** −0.210 1 − F pH 0.017 00 1 0.017 00 12.45 0.038 7 * −0.038 3 − G 接菌量 0.004 76 1 0.004 76 3.40 0.162 2 −0.020 6 ＋ I 时间 0.000 03 1 0.000 03 0.022 0.892 7 0.002 8 ＋ J 转速 0.013 00 1 0.013 00 9.49 0.054 1 −0.033 4 − 说明：*表示差异显著(P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01) 2.3 最陡爬坡试验结果
参照表3因子的正负效应可知：因素B、因素E、因素F各具有不同正、负效应系数，即酵母粉(B)具有正效应(+)，依次增大；温度(E)具有负效应(−)，依次减小；pH (F)具有负效应(−)，依次减小。
最陡爬坡试验结果(表4)显示：随着酵母粉质量分数逐渐增大，温度和pH逐渐减小，菌株吸光度呈现先升高后下降的变化趋势。2号的吸光度达到最高水平(1.720)，比1号和3号分别高出2.3%和59.4%，以此确定为因子的最大相应值响应区域，即酵母粉质量分数为0.9%，温度为35 ℃，pH 7的组合可作为Box-Behnken试验设计的中心点(0，0，0)。
2.4 Box-Behnken试验结果
Box-Behnken试验结果表明：不同试验组合间存在显著差异(表5)。14 号吸光度(1.785)最高，比2号(0.922)高93.6%，即14号(0，0，0)：酵母粉质量分数为0.9%，温度为35 ℃，pH 7条件下的吸光度高于2号(0，1，1)：酵母粉质量分数为0.8%，温度为40 ℃，pH=7条件下的吸光度。
表 5 Box-Behnken试验设计Table 5 Results of Box-Behnken design试验序号 B 酵母粉/% E 温度/℃ F 初始pH 吸光度 试验序号 B 酵母粉/% E 温度/℃ F 初始pH 吸光度 1 0 0 0 1.505±0.007 g 10 1 −1 0 1.770±0.023 ab 2 0 1 1 0.922±0.014 j 11 −1 0 −1 1.634±0.021 f 3 1 0 1 1.655±0.035 ef 12 1 0 −1 1.670±0.007 ef 4 −1 −1 0 1.056±0.027 h 13 0 0 0 1.749±0.024 ef 5 0 0 0 1.661±0.018 ef 14 0 0 0 1.785±0.007 a 6 0 −1 −1 0.941±0.042 ig 15 −1 1 0 1.754±0.010 abc 7 −1 0 1 1.524±0.013 g 16 0 0 0 1.733±0.003 bc 8 0 1 −1 0.967±0.060 i 17 0 −1 1 1.727±0.009 cd 9 1 1 0 1.690±0.010 de 说明：不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) 2.5 Box-Behnken试验回归模型和方差分析结果
回归模型的方差分析结果表明：模型多元相关性系数为0.9958 (表6)，表明仅有0.042 0%的变异不能由此模型解释；回归模型P＜0.01，表明模型是极显著的。模型失拟项的显著性水平P=0.146＞0.05，表明模型失拟不显著。方差分析结果显示，Box-Behnken设计的模型显著性水平P＜0.000 1，表明所采用的拟合模型达到极显著水平，具有统计学意义。由表6可知，3个因素的影响程度从大到小次序为温度(E)、酵母粉(B)、pH(F)；B、E、F、E2 对响应值Y(吸光度)的影响达到极显著水平，EF显著影响Y值。此外，回归方程的相关系数R2=0.9958，变异系数为2.08%，说明该回归方程拟合度高，变异几率低，适用于该菌株试验条件下各影响因素的统计分析。该响应面拟合方程为：Y=1.750 0+0.050 0B−0.307 0E−0.033 3F−4.000 0E−0.030 0BE−0.011 0BF−0.040 7EF−0.023 6B2−0.441 0E2−0.034 9F2。依据单因素和Plackett-Burman试验的结果选择设定的酵母粉(B)、温度(E)和pH(F)的取值范围，利用响应面拟合方程得到3个关键因素的拟合值：酵母粉为1.0%，pH为6.3，温度为33 ℃。该拟合值条件下模型的预测吸光度最大，为1.856。
表 6 Box-Behnken试验回归模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model of Box-Behnken test来源 均方和 自由度 均方 F 显著性 来源 均方和 自由度 均方 F 显著性 模型 1.638 00 9 0.182 00 182.747 ** B2 0.002 36 1 0.002 36 2.371 B 0.020 00 1 0.020 00 20.091 ** E2 0.820 50 1 0.820 00 824.161 ** E 0.756 00 1 0.756 00 759.257 ** F2 0.005 14 1 0.005 14 5.159 F 0.008 90 1 0.008 91 8.951 ** 残差 0.006 97 7 0.001 00 BE 0. 000 06 1 0.000 06 0.064 失拟项 0.004 91 3 0.001 64 3.179 不显著 BF 0.000 48 1 0.000 48 0.486 纯误差 0.002 06 4 0.000 52 EF 0.006 64 1 0.006 64 6.672 * 总和 1.644 00 16 说明：变异系数为2.08%，相关系数为0.995 8，校正决定系数为0.9903，预测系数为0.950 3。*表示显著差异(P＜0.05)，**表示极显 著差异(P＜0.01) 2.6 优化结果验证
综合单因素筛选试验、Plackett-Burman及 Box-Behnken试验模型的拟合值，得到菌株最佳培养条件为：牛肉膏质量分数为0.5%，酵母粉1.0%，氯化镁 0.5%，pH 6.3，温度33 ℃，接菌量1.25%，转速160 r·min−1，培养时间24 h。利用最佳培养条件，进行重复试验验证，得到菌液的吸光度为1.801±0.015，与模型预测的最大值(1.856)相接近，接近程度97.03%，表明模型准确可信，能真实评价各因素及其交互作用对菌株生长的不同影响。同时，与未优化前培养条件下菌株吸光度(1.078±0.021)相比，优化后该值提高了67.07%，达到预期目的。
3. 讨论与结论
3.1 Plackett-Burman试验中显著因素对菌株生长影响
Plackett-Burman 是一种基于非完全平衡块原理的近饱和的两水平试验设计方法。通过N次试验最多可以考察N−1个因素，用最少试验次数可以从众多因素中快速有效地筛选出最为重要的几个主效因子，每个因素取低和高2个水平，高水平取低水平的1.25倍[22-23]。
在本试验中，Plackett-Burman试验从多个因素[牛肉膏(A)、酵母粉(B)、氯化镁(C)、培养温度(E)、初始pH(F)、接菌量(G)、培养时间(I)和转速(J)]中快速筛选出具有显著影响的因素为：酵母粉、pH和温度。其中酵母粉之所以能显著影响菌株生长，在于它能提供优质氮源满足细菌繁殖所必需，而且天然酵母粉主要由多种酵母菌自然繁殖而成，是一种纯天然、无污染的健康营养源[24]。有机氮源比无机氮源含有更丰富的氨基酸、维生素及生长因子等营养物质，其中氨基酸可以直接参与微生物体内的转氨或脱氨作用(图1)，更适用于菌株生长。温度是诸多因素中显著影响因素之一，因为可能随着温度升高，菌体生长速度及营养消耗的速率也随之加快，明显缩短进入生长稳定期的时间；从酶本身特性来看，酶具有高效催化性，能够降低生化反应的活化能，但酶本身作用条件较温和，对温度比较敏感，很容易因温度过高而丧失活性[25]。温度也会影响细胞膜的流动性，进而影响膜内外物质(水分、有机物、各种离子等)的交换和吸收。pH 显著影响菌株生长速率可能在于其对菌株生长需要的酶、各种生物大分子的稳定性造成破坏等，导致失去生物活性；pH也会影响到培养基中金属离子的存在形式，造成其不易或者不被吸收；pH同样会影响微生物细胞膜所带电荷状态，进而改变细胞膜的通透性，最终直接或间接影响微生物对所需营养物质的吸收和代谢产物的排出。
3.2 响应面在优化培养条件的应用
响应面分析是利用统计学和数学模型的方法对需要优化的多因素系统进行建模和分析[13-15]，Box-Behnken试验设计是其中拟合模型之一，目前常被用于生物发酵过程培养基和培养条件的优化。该方法不仅可以建立连续变量的曲面模型和拟合方程，还可以对影响微生物生长和发酵过程的各种因子及其交互作用进行评价，确定最佳水平范围，通过最少的试验组数获得更为精确有效的结论，极大地节约资源和降低成本，使其效应最大化[26]。
细菌生长和培养是一个动态发酵过程，受外部发酵环境以及内部培养基成分的共同影响。此次试验以牛肉膏蛋白胨培养基为基础，通过单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、Box-Behnken试验确定菌株培养基组分和外部培养条件，系统优化了重金属镉耐性假单胞菌TCd-1培养体系，为后续进一步深入研究其菌剂制备及应用于重金属镉污染土壤的修复效应奠定了基础。
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图 1 毛竹PeKdsD基因开放读码框区及预测的氨基酸序列
Figure 1 ORF of PeKdsD gene and the corresponding amino acid sequence
图 2 不同物种Kd.D氨基酸多序列比对
Figure 2 Sequence multiple alignment of KdsD from different species
图 3 不同物种KdsD氨基酸序列构建的分子系统进化树
Figure 3 Molecular phylogenetic tree of KdsD from different species
图 4 PeKdsD在毛竹不同组织中的表达分析
Figure 4 Relative expression of PeKdsD in the root, shoot and leaf of Phyllostachys edulis
图 5 PeKdsD在表达菌株E. coli（Ril）中的表达（A）和PeKdsD 的Ni-NTA 亲和层析纯化的SDS-PAGE 检测（B）
Figure 5 Prokaryotic expression of PeKdsD in Escherichia coli（Ril） cell （A） and SDS-PAGE analysis from Ni-NTA affinity chromatography of PeKdsD （B）
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.2016.06.002
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