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植物进行光合作用的主要器官是叶片，研究发现不仅植物叶片能够进行光合作用，其他绿色非叶器官也能够进行光合作用[1-3]。NILSEN[3]发现植物绿色茎秆具有与叶片相似的光合能力；MANETAS[4]研究发现大量的光照(10%~50%)是被树干吸收的；SUN等[5]研究表明：树干木质部和韧皮部纤维以及管胞管壁对不同方向照射光线具有良好的茎向导光特性。HIBBERD等[6]发现：C3植物烟草Nicotiana tabacum和芹菜Apium graveliens茎中具有C4光合途径。NILSEN[3]认为虽然景天酸代谢途径(CAM)植物叶片多为C3途径，但其茎秆多为CAM途径，其他植物茎秆光合为C3途径。占东霞等[7]对棉花Gossypium hirsutum叶片和非同化器官的研究证明了非同化器官对光合作用的贡献。类囊体是叶绿体中光能向化学能转化的主要场所，一直是光合作用研究的热点[8]。类囊体膜又称光合膜，光合作用的4个多亚基蛋白复合体——光系统Ⅱ(PSⅡ)、光系统Ⅰ(PSⅠ)、ATP合成酶(ATP-ase)和细胞色素b6f复合体(Cytb6f)都定位在类囊体膜上[9-10]，这些蛋白复合体和许多其他辅助因子共同完成光合电子传递和光合磷酸化的过程[11]。高荣孚等[12]用含有聚乙二醇(PEG)的提取液提取和分离了油松Pinus tabulaeformis和豌豆Pisum sativum的类囊体膜，并得到完整的PSⅠ，证明存在2种PSⅠ，而且这种存在具有一定普遍性。蔡霞等[13]在低温(83 K)下利用稳态荧光光谱技术对PSⅡ核心复合物中激发能的传递进行了研究，发现最大峰所在位置没有因激发波长的不同而发生改变；在不同波长光的激发下，核心复合物中能量传递的途径不同。周伟等[14]利用蓝绿温和胶电泳(BN-PAGE)、结合质谱鉴定对条斑紫菜Porphyra yezoensis类囊体膜蛋白复合物进行了研究，检测到PSⅡ核心复合物中D2、D1、CP47、CP43和Cytochrome f等蛋白。在分子水平上揭示各种膜蛋白复合体的结构与功能，对于揭示光能转化的机理具有重要意义[15]。毛竹Phyllostachys edulis是江浙地区极富经济和生态价值的竹种。目前，对毛竹的研究主要在毛竹光合生理特性[16]、茎叶绿素荧光特征和光合酶活性[17-18]、碳水化合物代谢[19-20]、蛋白组学[21]和基因组学[22]等方面。关于毛竹茎秆类囊体膜蛋白复合物、快速生长期毛竹茎秆光合特性的研究未见报道。本研究通过分析毛竹茎秆快速生长期叶片和茎秆的光合色素含量、77 K低温荧光发射光谱、蓝绿温和胶电泳来揭示类囊体膜蛋白复合物的变化，为阐明毛竹茎秆光合作用机理提供理论依据。
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2018年5月初，在浙江省杭州市临安区现代毛竹示范园内，选取生境条件一致、生长状况良好、株高(6.0±0.2) m、基径约15 cm、自然状态下的当年生毛竹笋竹，从茎秆基部将其伐倒，将节间按照从基部至顶部的顺序编号，1~6节(笋衣完全脱落)为茎秆基部，7~13节(笋衣开始脱落，茎秆呈现绿色)为茎秆中部，13节以上(笋衣包裹完好，茎秆为黄色)为茎秆顶部，取茎秆外层表皮，厚度为＜3 mm。6月初，选择枝条梢部下3~4位无病斑的当年生叶片，取样时间为10: 00−12: 00。取样后直接进行发射荧光的测定；用于光合色素和电泳样品取下后，迅速将样品放进液氮中冷冻，存于−80 ℃备用。
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采用ARNON[23]的方法略做修改。称取毛竹叶片和茎秆0.5 g，剪碎后置于带盖的试管中，加体积分数为80%丙酮溶液5 mL，在暗处浸提48 h，分别在470、645和663 nm处测定其光密度D(λ)，参考LICHTENTHALER[24]的方法，计算叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)和类胡萝卜素(Car)质量分数。选取5株笋竹和5株成竹，每株作为1个独立实验，共5次重复。
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利用AvaSpec-HS-TEC超高灵敏型光纤光谱仪(北京爱万提斯科技有限公司)，在液氮(77 K)中测量活体状态下毛竹叶片和茎秆荧光发射光谱。采用陈登举等[25]方法稍作修改，以AvaLight-LED为激发光源(480 nm)，光照强度控制在3 000 μmol·m−2·s−1，发射波长范围为600~900 nm，发射步长为1 nm，扫描速度为500 nm·s−1。测量前先用标准白板校对调0，每个样品选择无病斑毛竹叶片和各部位茎秆材料各20片，每片采集数据1次。
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采用SCHÄGGER等[26]方法稍作修改。称取毛竹叶片10 g和笋竹茎秆50 g，加入100 mL预冷的提取液(0.1 mol·L−1蔗糖，0.2 mol·L−1氯化钠，50 mmol·L−1 pH 7.4磷酸缓冲液，质量浓度为2.5%聚乙二醇6000)中，用50 g多功能粉碎机(上海市蒲恒信息科技有限公司)粉碎至匀浆中无明显碎片为止(大约1 min)，将匀浆通过4层过滤，滤液3 000×g离心10 min (4 ℃)，收集沉淀。将沉淀用10倍体积预冷后的清洗液(不含聚乙二醇的提取液)悬浮起来，3 000×g离心10 min (4 ℃)，收集沉淀。再用5倍体积的冷清洗液将沉淀悬浮起来，500×g离心5 min，弃沉淀，将上层悬液3 000×g离心10 min (4 ℃)，收集沉淀，并用悬浮液(0.3 mol·L−1蔗糖，50 mmol·L−1氯化钠，50 mmol·L−1磷酸缓冲液，pH 6.9)悬浮。得到的悬液即为类囊体膜蛋白制备液，测定叶绿素质量分数后储藏于−20 ℃冰箱中。
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电泳样品制备：取类囊体膜蛋白制备液1 000 μL (约含10 000 μg蛋白和1 000 μg叶绿素)，3 000×g离心10 min(4 ℃)，取沉淀，用1 000 μL上样缓冲液[ACA缓冲液：750 mmol·L−1氨基己酸，50 mmol·L−1 pH 7.0双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷(Bis-Tris)，0.5 mmol·L−1乙二胺四乙酸(EDTA)]悬浮，再加入0.05 g毛地黄皂苷，混匀使之完全溶解，在冰浴中用JY88-IIN超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)处理混合液1 min，4 ℃下放置30 min，然后8 780×g离心30 min，取上清液，加入5 μL考马斯亮蓝染液(质量浓度为5%考马斯亮蓝G250，750 mmol·L−1氨基己酸)，混匀后上样。第1向电泳：胶体由质量浓度为4%浓缩胶和5%~13%梯度分离胶组成，上样量为30 μL。加入阳极缓冲液(50 mmol·L−1Bis-Tris-HCl，pH 7.0)和阴极缓冲液A [15 mmol·L−1 Bis-Tris，50 mmol·L−1 N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)，质量浓度为0.02%考马斯亮蓝G250]，80 V恒压电泳，当样品完全进入浓缩胶后，吸出阴极缓冲液A，换阴极缓冲液B (15 mmol·L−1 Bis-Tris，50 mmol·L−1 Tricine)，120 V恒压直到电泳完成。整个电泳过程在4 ℃下完成。第2向电泳：将经蓝绿温和胶分离的类囊体膜蛋白复合物胶条切下，在室温下经样品处理液(质量分数为5%十二烷基硫酸钠(SDS)，体积分数为20%甘油，体积分数为10%巯基乙醇，50 mmol·L−1 Tris-HCl，pH 6.8)处理30 min后，置于50 ℃水浴锅中加热5 min，然后用去离子水洗去巯基乙醇。把胶条放置在准备好的第2向胶体上，进行第2向电泳。电泳在室温条件下进行，25 mA恒流，阴极缓冲液：100 mmol·L−1 Tris-HCl，100 mmol·L−1 Tricine，质量浓度为0.1%SDS，pH 8.25，阳极缓冲液：100 mmol·L−1 Tris-HCl，pH 8.9。
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荧光光谱采集得到的数据经Multispec 5.1初步处理，用Origin 9统计软件进行统计分析，经卷积平滑消除噪音后，经归一处理，采用高斯函数对荧光发射光谱进行拟合，肩峰数目和峰位置通过四阶导数光谱确认，多次拟合使残差最小。所有数据均为5次重复的平均值±标准误差。利用Origin 9进行统计分析和作图，统计方法采用One-way ANOVA，进行Turkey多重比较(P＜0.01)。
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毛竹叶片和茎秆之间光合色素存在极显著差异(表1)，在茎秆顶部，叶绿素和类胡萝卜素的质量分数最低，比叶片分别低了93.4%和96.3% (P＜0.01)。随着茎秆的发育成熟，叶绿素和类胡萝卜素开始大量累积，在茎秆基部达到最高，比叶片分别低了30.6%和47.6%(P＜0.01)。茎秆叶绿素a/b均比叶片小，在茎秆成熟过程中，叶绿素a/b逐渐升高。茎秆基部和中部叶绿素a/b与叶片之间无显著差异，茎秆顶部叶绿素a/b比叶片高46.5% (P＜0.01)。
表 1 毛竹叶和茎秆的光合色素质量分数
Table 1. Pigment content in leaves and stems of Ph. edulis
位置 质量分数/(μg·g−1) 叶绿素a/类胡萝卜素 叶绿素a/b 叶绿素a 叶绿素b 总叶绿素 类胡萝卜素 叶 311.60±0.07 A 89.30±0.01 A 400.90±0.08 A 96.00±0.01 A 3.23±0.25 A 3.46±0.27 B 茎秆基部 158.00±1.09 B 52.10±0.20 B 210.10±1.28 B 66.60±0.48 B 2.37±0.06 B 3.03±0.10 B 茎秆中部 64.90±0.29 C 17.00±0.09 C 81.90±0.23 C 28.90±0.17 C 2.25±0.15 B 3.83±0.35 B 茎秆顶部 12.50±0.01 D 2.50±0.01 D 15.00±0.01 D 6.30±0.09 D 2.02±0.31 B 5.07±0.23 A 说明：同列不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01) -
采用非变性BN-PAGE电泳技术分析了毛竹叶片和茎秆类囊体膜蛋白复合物(图1)。毛竹叶片BN凝胶中蛋白复合物包括2种LHCⅡ-PSⅡ超复合物、约600 kDa的PSⅡ核心二聚体和PSⅠ、不同分子量的ATP合酶(ATP-synthase)组件、约290 kDa的PSⅡ核心单体、缺少CP43亚基的PSⅡ核心单体、约140 kDa的游离LHCⅡ三聚体和游离LHCⅡ单体。通过对比叶片类囊体膜蛋白复合物，茎秆BN凝胶中明显的条带有LHCⅡ-PSⅡ超复合物、PSⅡ核心二聚体几乎与PSⅠ相连、ATP合酶、PSⅡ核心单体和LHCⅡ单体。在叶片BN凝胶中，最丰富的捕光色素蛋白复合物是LHCⅡ三聚体；而在茎秆BN凝胶中，最多的则是LHCⅡ单体。茎秆基部PSⅡ单体和二聚体与叶片相似，而缺少CP43亚基的PSⅡ单体的颜色明显比叶片淡。随着茎秆的成熟，PSⅡ单体和二聚体越显著。
图 1 毛竹类囊体膜蛋白BN-PAGE电泳图
Figure 1. Blue-native gel electrophoresis analysis of Ph. edulis thylakoid membrane protein complexes
为了更好地比较两者差异，将第1向分离的胶条切下，进行第2向Tricine-SDS-PAGE电泳。BN-PAGE第1向电泳分离了类囊体膜大分子蛋白复合物，经第2向电泳分离得到各小亚基(图2)，参考RANTALA等[27]的研究结果，比较光系统发育情况。经过考马斯亮蓝染液的染色补充，显示了与CP47、CP43、D2、D1和LHCⅡ亚基对应的位置。蛋白复合物对应于：LHCⅡ-PSⅡ超复合物、PSⅡ核心二聚体、PSⅡ核心单体、LHCⅡ三聚体和LHCⅡ单体。ATP合酶在第2向电泳中分离得到57 kDa的ATPα和55 kDa的ATPβ。毛竹叶片和茎秆基部PSⅠ经第2向电泳分离得到PsaA/B和PsaD，茎秆中部得到PsaA/B，但在茎秆顶部的胶体中没有明显地显示出PsaA/B。
图 2 类囊体膜蛋白复合物第2向电泳
Figure 2. Two-dimension Tricine-SDS-PAGE results of protein complex in thylakoid membranes in Ph. edulis
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如图3A所示：以毛竹叶片光谱为参考，毛竹叶片77 K荧光发射光谱呈典型的M型，分别对应于PSⅡ (685 nm)和PSⅠ(745 nm)。茎秆荧光发射光谱被归一化为最大值，以便于茎秆相互之间的比较以及与毛竹叶片的比较。茎秆基部光谱与毛竹叶片的基本一致，茎秆中部在685 nm对应PSⅡ，荧光强度比毛竹叶片高；在745 nm对应PSⅠ，荧光强度最低。茎秆顶部在680 nm处出现蓝移现象。此外，荧光强度与茎秆中部一致；在745 nm处荧光强度比毛竹叶片低且主峰不明显。
图 3 毛竹叶和茎秆的77 K荧光发射光谱和四阶导数光谱
Figure 3. 77 K fluorescence emission spectrum and fourth-derivative spectrum from leaves and stems of Ph. edulis
对毛竹叶片和茎秆的77 K荧光发射光谱进行四阶导数处理(图3B)。红光区毛竹叶片与茎秆基部以及中部的四阶导数光谱基本一致，主峰均在685 nm处，各有1个肩峰均在653 nm处；茎秆顶部的四阶导数光谱出现明显的蓝移现象。主峰在680 nm处，在650 和710 nm处有2个肩峰。毛竹叶片和茎秆的四阶导数光谱在远红光区差异很大，毛竹叶片和茎秆基部及中部主峰在745 nm处，在725和765 nm处有2个肩峰；茎秆顶部的主峰在741 nm处，在725 和750 nm处有2个肩峰。
在77 K荧光发射光谱范围内，通过高斯函数解析出2个高斯光谱组分(表2，图4)。在红光区，毛竹叶片和茎秆的荧光峰都在685 nm左右；在远红光区，毛竹叶片和中下部茎秆的荧光峰在740 nm左右，但茎秆顶部荧光峰在756 nm处，出现明显红移。基部和顶部的2个解析峰面积比(A1/A2)、峰高比值(H1/H2)和2个荧光峰的半峰宽比(W1/W2)分别比毛竹叶片低46.7%和9.9%、30.8%和41.1%、22.1%和35.6% (P＜0.01)；中部的A1/A2、H1/H2、W1/W2分别比毛竹叶片高191.1%、40.4%和109.3% (P＜0.01)。
表 2 毛竹叶和茎秆的77 K荧光发射光谱高斯解析结果
Table 2. Results of Gaussian decomposition of 77 K fluorescence spectra for leaves and stems of Ph. edulis
峰 主峰1 主峰2 峰面积1 峰面积2 半峰宽1 半峰宽2 峰高1 峰高2 峰面积比 峰高比 半峰宽比 叶 687 741 18.94 42.20 26.38 50.87 0.57 0.66 0.45 0.52 0.86 茎秆基部 685 738 12.29 51.10 23.89 66.76 0.41 0.61 0.24 0.36 0.67 茎秆中部 688 768 31.39 23.92 30.32 41.30 0.83 0.46 1.31 0.73 1.80 茎秆顶部 684 756 20.09 61.85 28.09 130.48 0.57 0.38 0.32 0.22 1.50 
图 4 毛竹叶和茎秆的77 K荧光发射光谱的高斯拟合
Figure 4. 77 K fluorescence emission spectra and results of Gaussian fitness for leaves and stems of Ph. edulis
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光在植物生长中具有特殊作用，除了作为一种能源控制着光合作用，还作为一种触发信号影响着植物生长[28]。ALEXANDER等[29]研究发现：樟子松Pinus sylvestris var. mongolica针叶和树皮中叶绿素a/b和类胡萝卜素组成相似。本研究结果显示：茎秆受到光照后，色素大量形成。茎秆基部和中部叶绿素a/b相似，但茎秆顶部叶绿素a/b显著高于毛竹叶片。这可能因为中上部有笋衣包裹，受到光照强度随着茎秆节间的升高而减弱，为了适应这种环境，茎秆叶绿体中会有较高的叶绿素a/b。
在芒果Mangifera indica等绿色肉质水果中，PSⅡ的效率普遍较高，与叶片的效率相当[30-31]。FERRONI等[32]研究发现，成熟果实中CP43-less PSⅡ核心单体含量比叶片高，成熟果实中LHCⅡ-PSⅡ超复合物的含量比叶片低。BONORA等[33]发现类囊体在成熟早期发生，随后在成熟后期大量积累类胡萝卜素。PSⅡ反应中心由蛋白D1和D2组成[34]，两侧是内周捕光天线蛋白CP47和CP43[35]，大多数与PSⅡ相关的叶绿素都存在于外周捕光天线(LHCⅡ)复合体中[36]。BARSAND等[37]发现番茄Solanum lycopersicon叶绿体向色质的转变与光系统发生机制的破坏(囊泡运输、为类囊体生物合成提供材料、光系统组装)是一致的，会导致光反应蛋白的减少。毛竹叶片PSⅡ经分离得到了反应中心蛋白D2、D1、内周天线蛋白CP47、CP43以及大量外周捕光天线蛋白，叶片PSⅡ发育完全；茎秆PSⅡ经分离也得到了D2、D1、CP47、CP43蛋白，但外周捕光天线蛋白明显比叶片少，从茎秆基部到顶部外周捕光天线蛋白数量显著减少。表明毛竹茎秆中PSⅡ核心复合物已形成，随着茎秆发育，笋衣逐渐脱落，茎秆受到光照加强，色素大量形成，捕光天线蛋白逐渐增多，使得PSⅡ复合体发育更完整。
SMART等[38]发现：psaA或psaB基因失活都将导致PSⅠ复合物在类囊体中缺失，表明PsaA或PsaB不能单独形成二聚体，而PsaA/B异二聚体的存在是整个PSⅠ复合物组装所必需的。PSⅠ的外周蛋白PsaD和PsaE位于类囊体基质侧形成一个凸点。有研究[39]显示：PsaD、PsaE和Fd之间有互作关系，普遍认为PsaD通过与带负电荷Fd之间的静电互作而为Fd提供必要的结合位点，同时PsaD也是PSⅠ中PsaC和PsaE正确组装所必需的。毛竹叶片PSⅠ经分离得到了PsaA/B和PsaD小亚基，叶片PSⅠ已发育完全；茎秆基部发现了PsaA/B和PsaD亚基，PSⅠ核心复合物已形成，小亚基正在整合到PSⅠ核心复合物上；茎秆中部发现PsaA/B，但未发现其他小亚基，这可能是因为茎秆中部PSⅠ核心复合物在组装过程中，小亚基都呈现游离状态，在提取类囊体膜蛋白复合物时，这些小亚基未能够完整提取；茎秆顶部未发现PsaA/B和小亚基，PSⅠ核心复合物还未组装。这表明茎秆PSⅠ的发育是从基部开始的，随着笋衣脱落，裸露的茎秆受到光照，色素大量形成，PSⅠ核心复合物开始组装完整。
植物叶绿体内不同的色素蛋白复合物发射的荧光构成了叶绿体的荧光发射光谱[40]，而这些蛋白复合物具有不同的发射荧光峰位[41]。茎秆基部在红光区的77 K荧光发射光谱与毛竹叶片基本一致，这说明光照不足对毛竹叶片与成熟茎秆PSⅡ核心复合物的组成无显著影响。红光区内的肩峰主要是CP47、CP43和LHCⅡ引起的[42]；远红光区附近的肩峰是由PSⅠ反应中心和LHCⅠ引起的[43]。在红光区内茎秆顶部的最大峰出现了蓝移现象，这可能是由于茎秆顶部被笋衣包裹，光照不足会导致CP47等亚基含量减少[44]；也可能是因为PSⅡ中的CP47、D1、D2等色素蛋白的二级结构以及色素分子的空间位置发生了改变，导致蓝移现象[45]。毛竹叶片的叶绿素a和类胡萝卜素远远高于茎秆，而毛竹叶片荧光强度比茎秆低。这可能是因为PSⅡ核心复合物只结合有叶绿素a和β-胡萝卜素(β-Car)，当激发光激发PSⅡ核心复合物时，稳态发射光谱显示随着β-胡萝卜素分子吸收强度的增加，向叶绿素a分子进行能量传递的荧光耗散就越少，其发射荧光强度就降低[13]。远红光区内的光谱特征可能只由于毛竹叶片和茎秆基部叶绿体中的PSⅠ核心复合物基本都已形成，但茎秆中部和顶部 PSⅠ核心复合物还未完全形成，还有较多的的LHCⅠ和PSⅠ-LHCⅠ，所以光谱中出现肩峰。
综上所述，在毛竹茎秆成熟早期，PSⅡ核心复合体已形成，随着茎秆发育，笋衣逐渐脱落，色素大量合成，内周天线蛋白CP47和CP43以及外周捕光天线蛋白逐渐形成，PSⅡ的77 K发射光谱荧光强度逐渐减小；同时，茎秆受到光照后PSⅠ核心蛋白PsaA和PsaB开始形成，逐渐组装合成PSⅠ核心复合体，PSⅠ的77 K发射峰荧光强度逐渐增大。
BN-PAGE analysis of thylakoid membrane protein complex during rapid growth of Phyllostachys edulis
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摘要:
目的 探讨毛竹Phyllostachys edulis笋竹茎秆的光合特性和光系统的发育情况。 方法 以当年生毛竹叶片和笋竹茎秆为材料，采用蓝绿温和胶电泳(BN-PAGE)分析茎秆和叶片类囊体膜蛋白，同时测定了光合色素含量和77 K低温荧光发射光谱。 结果 茎秆叶绿素和类胡萝卜素质量分数显著低于叶片(P＜0.01)，随着茎秆发育，叶绿素和类胡萝卜素质量分数显著升高。茎秆和叶片类囊体膜PSⅡ核心复合物较完整，捕光色素较多；叶片和茎秆基部PSⅠ核心复合物分离主要得到PsaA/B和PsaD亚基，茎秆中部得到PsaA/B，茎秆顶部未发现PsaA/B。叶片和茎秆77 K低温荧光发射光谱在685和745 nm处有2个明显主峰，四阶导数光谱出现6个极大值，主要是PSⅡ和PSⅠ核心复合物的荧光发射峰以及由PSⅡ外周捕光天线(LHCⅡ)、PSⅡ内周捕光天线(CP47)、PSⅡ内周捕光天线(CP43)、PSⅠ反应中心复合体(RCI)、PSⅠ捕光天线(LHCⅠ)的发射荧光峰引起的肩峰，其中茎秆顶部LHCⅡ和PSⅡ核心复合体的特征发射峰与叶片相比有明显蓝移现象。 结论 毛竹茎秆中PSⅡ核心复合体已形成，随着茎秆发育，笋衣逐渐脱落，色素大量合成，内周天线蛋白CP47和CP43以及外周捕光天线蛋白逐渐形成；同时，茎秆受到光照后PSⅠ核心蛋白PsaA和PsaB开始形成，逐渐组装合成PSⅠ核心复合体。图4表2参45 Abstract:Objective The objective of this research is to reveal the photosynthetic characteristics and the development of photosystem of the stem of Phyllostachys edulis. Method Blue-greengel electrophoresis (BN-PAGE) was used to analyze the thylakoid membrane proteins in stems and leaves, and the changes in pigment content and the 77 K low temperature fluorescence emission spectrum were measured. Result The content of chlorophyll and carotenoid in stems was significantly lower than that in leaves (P＜0.01), and with the development of stems, the pigment content increased significantly. The core complex of PSⅡ in the thylakoid membrane of stems and leaves was relatively complete and there were more light-catching pigments. PsaA/B and PsaD subunits were mainly isolated from PSI core complex in leaves and the stem base, and PsaA/B was obtained from the middle of stem, but no PsaA/B was found at the top of stem. There were two obvious main peaks at 685 and 745 nm in the 77 K low temperature fluorescence emission spectrum of leaves and stems, and six maximum values in the fourth derivative spectrum, which were mainly the fluorescence emission peaks of the core complex of PSⅡ and PSⅠ, and the shoulder peak caused by the emission fluorescence peak of the PSⅡ peripheral light catching antenna (LHC Ⅱ), PSⅡ inner peripheral light catching antenna (CP47), PSⅡ inner peripheral light catching antenna (CP43), PSⅠ reaction center complex (RCI), and PSI light catching antenna (LHC Ⅰ). The characteristic emission peak of LHC Ⅱ and PSⅡ core complex at the top of stem had obvious blue shifts compared with that of leaves. Conclusion The core complex of PSⅡ in stems of Ph. edulis has been formed. With the development of stems, the bamboo shoot coat gradually falls off, the pigments are synthesized in large amount, the inner antenna proteins CP47 and CP43 and the peripheral light-catching complex are formed gradually. Meanwhile, the PSⅠ core proteins PsaA and PsaB begin to form after the stems are exposed to light, and the core complex of PSⅠ is gradually assembled and synthesized. [Ch, 4 fig. 2 tab. 45 ref.] -
Key words:
- Phyllostachys edulis /
- thylakoid membrane protein /
- photosystem /
- emission fluorescence
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喜树Camptotheca acuminata是中国特有树种，属于蓝果树科Nyssaceae喜树属Camptotheca植物，因叶片含有抗癌物质喜树碱（camptothecin），被认为是重要药用植物。施肥是高效培育喜树、增加叶片产量的重要措施之一[1]。氮素是植物生长和产量形成的首要因素，植物吸收氮素的形式主要有铵态氮（NH4+-N）和硝态氮（NO3--N）。研究表明：合理增施氮肥可以促进植物生长，提升植物品质[2]；除了影响光合作用，氮素还影响植物中抗氧化酶和膜脂过氧化物的生理代谢。过量氮肥会打破植物内活性氧代谢的平衡，破坏膜系统结构[3]，导致植物生理系统的紊乱，影响植物类囊体数量和类囊体蛋白形成。psbA，psbB和psbC是光系统Ⅱ核心复合体（PSⅡ）中重要的蛋白编码基因。卡尔文循环中，核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶（rubisco）是光合特性中碳同化的关键酶，主要由大、小2个亚基组成，在植物碳同化过程中具有重要作用，影响植物的光合特性[4]。不同植物在不同环境和生育期表现出对不同氮素形态吸收的显著性差异[5-6]。三叶青Tetrastigma hemsleyanum[7]和铁核桃Juglans sigillata[8]都表现出对NO3--N吸收的偏向性，而水稻Oryza sativa的叶绿素荧光动力学参数在2种氮素营养下没有差异[9]；出现差异的原因可能与研究对象和条件都存在一定的相关性[10]，但氮素形态对植物叶绿素荧光动力学过程及其参数的影响机制，目前尚无明确定论。总的来说，不同植物对氮素形态吸收具有偏向性，而后者直接影响了植物生长和叶绿素荧光特性，从而影响植物生长的产量和品质，因此合适的氮肥水平及形态对植物生长具有重要意义。近年来，关于氮肥对喜树生长的研究，主要集中在氮肥处理的不同水平[11]，而尚未采用不同氮素形态的不同水平对喜树进行处理研究。因此，本研究以2年生喜树实生苗为实验材料，采用不同水平的铵态氮和硝态氮施肥处理，通过研究叶片生长、叶绿素荧光特性和叶绿体相关基因的表达，来探究适于喜树生长的最佳氮素水平和氮素形态，为喜树施肥栽培提供一定的理论依据。
1. 材料与方法
1.1 供试材料与试验方法
于2017年4月5日选取无病虫害、生长健壮、规格基本一致的优质2年生喜树实生苗270株（江西九江森淼绿化苗木公司），栽植在直径30.0 cm，高40.0 cm的花盆中。栽植基质为V（泥炭）:V（珍珠岩）:V（园土）＝1:1:3，填土（10.0±0.2）kg·盆-1，土壤pH值为6.8，土壤电导率（EC）为0.305 mS·cm-1，水解氮为86.6 mg·kg-1，速效磷为3.2 mg·kg-1，速效钾为94.6 mg·kg-1。苗木于浙江农林大学平山试验基地（30°15′50.09″N，119°42′54.67″E）缓苗2月，缓苗期间正常浇水，待全部成活后，于6月18日搬于浙江农林大学温室内（30°15′30.39″N，119°43′26.92″E）进行施肥处理。
试验以清水组为对照（ck），铵态氮处理组使用硫酸铵[（NH4）2SO4]施肥，施氮量分别为2.5（T1），5.0（T2），7.5（T3）和10.0（T4）g·株-1，硝态氮处理组使用硝酸钾（KNO3）施肥，施氮量分别为2.5（W1），5.0（W2），7.5（W3）和10.0（W4）g·株-1。所有盆栽苗均随机摆放，叶片之间无重叠，各盆配有直径40.0 cm的托盘，防止养分流失，每处理设置10株，重复3次。试验从6月18日至10月4日，隔15 d施肥1次。供试氮肥均为分析纯（AR99%），购自国药（硫酸铵CAS#: 7783-20-2，硝酸钾CAS: 7757-7）。施铵态肥时，肥料中加入7.0 μmol·L-1二氰二氨（C2H4N4, DCD）以抑制硝化反应，于0，30，60，90，105 d测定相关数据。试验期间进行正常的管理。
1.2 测定项目和方法
叶长：分别于处理前后（0，105 d）选第2轮叶的倒数第3，4，5片叶子，用直尺测量苗木的叶长（测量3株，取平均值），从叶片与叶柄连接基部到叶片尖端，精确到0.1 cm。叶面积：于处理前后（0，105 d）选第2轮叶的倒数第3，4，5片叶子，用方格纸测定苗木的叶面积（测量3株，取平均值），从叶片与叶柄连接基部到叶片尖端的整个范围，精确到0.01 cm2。叶绿素a和叶绿素b：采集喜树顶端第5，6片叶，参照李合生[12]乙醇浸提法测定叶绿素质量分数。叶绿素荧光参数：采用Li-6400便携式光合仪（LI-COR，Lincoln，美国），于晴天上午9：00-11：00测定植株上位叶（第2轮叶倒数3，4片）叶绿素荧光参数。叶片暗适应30 min后测定初始荧光产量（Fo），随后施加1次强闪光（6 000 μmol·m-2·s-1，脉冲时间0.7 s）测最大荧光产量（Fm），然后在自然光下适应20 min，待荧光基本稳定再测得稳态荧光产量（Fs），最后给予1次强闪光，获得光适应下的最大荧光产量（Fm′）和最小荧光（Fo′）。各处理均3次重复。暗反应下PSⅡ最大光化学效率Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm，光系统下PSⅡ最大捕获效率Fv′/Fm′=（Fm′-Fo′）/Fm′，光化学猝灭系数qP＝（Fm′-Fs）/（Fm′-Fo′），非光化学猝灭系数qNP＝1-Fv′/Fm′[13]。测定叶绿素荧光参数时，同时任选3株，从各株顶端6~9片叶中任意采集3片，放入液氮罐中带回实验室置于-80 ℃冰箱中保存，用于测定光合酶基因的表达。叶绿体基因的表达：采用RNAperp Pure Plant Kit（TIANGEN，北京）试剂提取喜树RNA；参照Reverse Transcriptase M-MLV（Takara，大连）试剂说明书合成cDNA，于-20 ℃储存备用。从美国国立生物技术信息中心（NCBI）上获得喜树叶绿体基因序列，以Actin为内参基因，用Primer Express software（Applied Bio systems）设计引物（表 1）。反转录产物cDNA稀释10倍后，用SYBR®Primix Ex TaqTM试剂盒（Takara，大连）进行实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR），利用Light Cycler 480 Ⅱ（Roche）荧光定量仪器进行目的基因qRT-PCR表达分析，反应体系为20.0 μL，其中SYBR®Primix Ex TaqTM荧光染料10.0 μL，cDNA模板2.0 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.8 μL，双蒸水6.4 μL。两步法PCR扩增标准程序：预变性95 ℃ 30 s；聚合酶链式反应95 ℃ 5 s，61 ℃ 30 s，40个循环，每个样品重复3次，采用2-ΔΔCt算法分析结果。
表 1 荧光定量PCR引物Table 1. Primers sequence of target genes基因 正向引物（5′→3′） 反向引物（5′→3′） psbA ACAGATTCGGTCAAGAGGAAGA CAGTGAACCAGATACCTACTACAG psbB GGAGGAATCGCTTCTCATCATAT CGGACGCTAAGATGGAATAGAC psbC GTCAATTATGTCTCGCCTAGAAGT GACCTACGAAGAAGAAGAATCCTAA RbcL CTTGGCAGCATTCCGAGTAAC GTTGTCCATGTACCAGTAGAAGATT Actin GGTACTCGTTCACAACAACTGCTG CTGTCCATCGGGCAACTCATAG 1.3 数据统计与分析
采用Excel 2007和SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。采用单因素（one-way ANOVA）和Duncan法进行方差分析和多重比较（α＝0.05）。利用Origin 9.0软件作图。图表中数据为平均值±标准差。
2. 结果与分析
2.1 氮素处理水平对喜树叶片生长的影响
表 2显示：喜树生长至105 d，叶长和叶面积均增加，处理组叶长和叶面积均显著高于ck（P＜0.05）。随着氮素处理水平的提高，叶长和叶面积均呈先上升后下降趋势。与其他处理相比，T3和W3叶长和叶面积最大，叶长较ck（8.10±0.02）cm分别增加了32.3%和78.5%，叶面积较ck（25.43±0.15）cm2依次增加了130.0%和242.0%；且硝态氮处理水平下的叶长和叶面积均高于铵态氮，说明硝态氮更有利于植物生长。
表 2 氮素处理水平对喜树叶长和叶面积的影响Table 2. Effects of different concentrations of ammonium nitrogen and nitrate on leaf lengh of Camptotheca acuminata处理 叶长/cm 叶面积/cm2 ck 13.00 ± 0.12 Ad 58.83 ± 0.14 Ae T1 15.80 ± 0.12 Ac 79.07 ± 0.08 Bd T2 16.70 ± 0.03 Bb 98.93 ± 0.08 Bc T3 16.70 ± 0.03 Bb 124.03 ± 0.12 Ba T4 16.40 ± 0.05 Bb 116.37 ± 0.31 Bb ck 13.00 ± 0.12 Ad 53.83 ± 0.14 Ae W1 19.20 ± 0.06 Ac 139.73 ± 0.24 Ad W2 20.80 ± 0.08 Ab 152.07 ± 0.35 Ab W3 23.20 ± 0.21 Aa 184.30 ± 0.05 Aa W4 20.50 ± 0.03 Ab 150.97 ± 0.12 Ac 说明:不同小写字母表示同种氮素不同水平间差异显著(P < 0.05)，不同大写字母表示同种氮素相同水平下与ck差异显著(P < 0.05) 2.2 氮素处理水平对喜树叶片叶绿素质量分数的影响
2.2.1 铵态氮不同处理水平对喜树叶片叶绿素质量分数的影响
由表 3可知：随生长时长，植株叶片叶绿素质量分数总体升高，除T4外，其他处理叶绿素质量分数60 d较30 d时有所下降，90 d时又有所上升，至105 d时达到最大值。相同生长时长下，不同处理水平间差异较小。生长至105 d时，T3叶绿素质量分数显著高于其余处理（P＜0.05），较ck，T1，T2和T4依次上升了35.2%，17.2%，23.8%和15.2%。
表 3 不同铵态氮处理水平对喜树叶片叶绿素质量分数的影响Table 3. Effects of different concentrations of ammonium nitrogen and nitrate on chlorophyll content in C. acuminata处理 w叶绿素/（mg·g－1） 0 d 30 d 60 d 90 d 105 d ck 1.61 ± 0.26 Da 1.90 ± 0.26 Db 2.80 ± 0.10 Cb 3.96 ± 0.22 Ba 4.38 ± 0.16 Ac T1 1.63 ± 0.19 Da 4.54 ± 0.83 Aa 4.30 ± 0.08 Ca 3.72 ± 0.85 Ca 5.05 ± 0.12 ABb T2 1.61 ± 0.09 Da 4.78 ± 0.49 Aa 4.36 ± 0.19 Ca 4.72 ± 0.39 Ca 5.14 ± 0.36 ABb T3 1.67 ± 0.14 Da 5.25 ± 0.32 Ba 4.53 ± 0.17 Ca 4.80 ± 0.32 Ca 5.92 ± 0.11 Aa T4 1.61 ± 0.11 Da 4.88 ± 0.11 Ba 4.39 ± 0.15 ABa 4.26 ± 0.23 ABa 4.78 ± 0.22 Ab 说明：不同小写字母表示同种氮素不同水平间差异显著(P < 0.05)，不同大写字母表示同种氮素相同水平下与ck差异显著(P < 0.05) 2.2.2 硝态氮不同处理水平对喜树叶片叶绿素质量分数的影响
表 4表明：随处理时间的延长，硝态氮处理下喜树叶片叶绿素质量分数变化显著；但不同处理水平相比，质量分数差异较小。处理30~60 d，所有铵态氮处理下叶绿素质量分数均显著高于ck，各处理水平相比，W3处理下叶绿素质量分数最高，较ck和其他处理依次高出73.9%，44.5%，10.2%和31.3%。处理90~105 d，ck和W1的叶绿素质量分数继续上升，W2，W3和W4先上升后下降，105 d时，W1叶绿素质量分数高于其他处理，W4最低。
表 4 不同硝态氮处理水平对喜树叶片叶绿素质量分数的影响Table 4. Effects of different concentrations of ammonium nitrogen and nitrate on the chlorophyll content in C. acuminata处理 w叶绿素/（mg·g－1） 0 d 30 d 60 d 90 d 105 d ck 1.61 ± 0.17 Ca 1.90 ± 0.26 Ba 2.80 ± 0.10 ABc 4.38 ± 0.16 Ba 3.69 ± 0.22 Aab W1 1.65 ± 0.24 Ca 2.97 ± 0.84 Ba 3.37 ± 0.16 Ab 4.39 ± 0.10 Aa 4.41 ± 0.13 ABa W2 1.63 ± 0.12 Ba 3.84 ± 0.09 Aa 4.42 ± 0.38 Aab 3.68 ± 0.11 Abc 3.95 ± 0.11 Aa W3 1.67 ± 0.19 Ca 3.89 ± 0.14 Aa 4.87 ± 0.23 Aa 3.15 ± 0.49 Ac 3.83 ± 0.29 Ba W4 1.61 ± 0.11 Ba 3.45 ± 0.10 Aa 3.71 ± 0.28 Ab 3.22 ± 0.13 Ac 3.80 ± 0.35 Aa 说明:不同小写字母表示同种氮素不同水平间差异显著(P < 0.05)，不同大写字母表示同种氮素相同水平下与ck差异显著(P < 0.05) 2.3 氮素处理水平对喜树叶片叶绿素荧光参数的影响
2.3.1 铵态氮不同处理水平对喜树叶片叶绿素荧光参数的影响
由图 1可知：至30 d，Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP呈显著上升趋势（P＜0.05），qNP呈下降趋势，T4处理下Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP达到最大。到60 d时，T2和T3处理下Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP达到最大值，与ck相比，依次提高了1.4%，9.2%和84.8%。60 d时T3处理组各测试参数显著高于其他处理（P＜0.05），T4显著低于其他处理。处理90~105 d，T2，T3和T4处理下Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP值呈下降趋势，T1处理下Fv/Fm下降，Fv′/Fm′和qP值呈上升趋势，T3依然高于其余处理。90 d时，T3处理下qNP显著低于其他同类处理，与ck相比下降了12.9%；105 d时，T4处理下Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP降到最小，显著低于其他处理；与ck相比，依次下降了11.1%，3.3%和5.6%。
图 1 铵态氮不同处理水平对喜树叶片叶绿素荧光参数的影响Figure 1. Effects of different concentrations of ammonium nitrogen on chlorophyll fluorescence characteristics of Camptotheca acuminata2.3.2 硝态氮不同处理水平对喜树叶片叶绿素荧光参数的影响
图 2显示：30 d时，不同硝态氮处理下Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP显著上升，qNP显著下降，其中W4处理Fv/Fm和Fv′/Fm′达到最大值，此后显著下降（P＜0.05）。60 d时，W2和W3处理下Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP达到最大值，与ck相比，依次上升了2.6%，12.3%和115.8%；此时W3处理下这3个参数值显著高于其他处理。处理90~105 d，W2，W3和W4处理Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP值呈下降趋势；W1处理Fv/Fm下降，Fv′/Fm′和qP值上升；W3处理Fv′/Fm′和qP值依然高于其他处理，qNP显著低于其他处理，与ck相比下降了29.9%。至105 d时，W4处理Fv/Fm，Fv′/Fm′和qP显著低于其他处理，与ck相比，依次下降了11.1%，3.3%和5.6%。
图 2 铵态氮不同处理水平对喜树叶片叶绿素荧光参数的影响Figure 2. Effects of different concentrations of nitrate nitrogen on chlorophyll fluorescence characteristics of C. acuminata2.4 氮素形态和处理水平对喜树叶片核心复合体叶绿体基因和光合酶基因表达的影响
以不同处理在0 d时的表达量为ck，增施氮肥对PSⅡ蛋白编码基因psbA（图 3A和图 3B），psbB（图 3C和图 3D），psbC（图 3E和图 3F）和光合酶基因RbcL（图 3G和图 3H）表达的影响显著（P＜0.05）。由图 3可知：生长30 d，所有基因表达量显著提高。处理60 d时，T3处理下psbA表达上调，其余处理下所有基因表达显著下调（P＜0.05），T3和W3处理下psbA，psbC和RbcL表达量显著高于其他同类处理（P＜0.05），所有铵态氮处理psbB随处理水平的升高而升高，T2处理psbB表达量显著低于其他同类处理（P＜0.05）；与T1，T2和T4相比，T3处理psbA表达量上升了76.3%，50.8%和55.6%，psbC表达量上升了15.8%，16.5%和52.5%，RbcL表达量上升了66.8%，34.4%和39.9%。与W1，W2和W4相比，W3处理psbA表达量上升了71.9%，57.9%和75.6%；psbC表达量上升了8.7%，61.7%和15.4%；RbcL表达量上升了47.1%，22.3%和79.1%，处理90~105 d，T3和W3也保持显著优势，90 d时，T3较T1，T2和T4依次增加了88.9%，28.7%，379.1%，W3较W1，W2，W4依次增加了201.8%，52.3%和45.5%。105 d时，T4处理psbA和RbcL表达量显著低于其他同类水平处理，达到最小值。
图 3 氮素形态和氮素水平对喜树叶绿体基因和光合酶基因表达的影响Figure 3. Effects of different ammonium nitrogen and nitrate on the expression of chloroplast genes and photosynthetic enzyme genes in C. acuminata3. 讨论
植物不同生长过程对氮肥需求不同，在合理范围内增施氮肥，可以显著促进植物生长，提高植物的产量和品质[14]。研究认为：与铵态氮相比，硝态氮具有更好的亲和力、氮转运和吸收效果[15]。本研究发现：铵态氮和硝态氮均提高了喜树的叶面积和叶长生长量，以T3和W3优势最为明显；相比而言，硝态氮处理下喜树生长更优；随着氮素水平的继续提高，喜树叶长和叶面积显著下降，说明植物吸收利用氮素存在一定限度，过量添加不利于生物量的积累[16]。
叶绿素参与光能的吸收传递及分配，是重要的光合色素；不同氮素形态对植物叶绿素合成及对光能吸收、传递、捕获和转换具有重要影响[17]。研究表明：适量增加氮素可促进米老排Mytilaria laosensis[18]和菘蓝Isatis indigotica[19]叶绿素合成，提高光合效率。本研究发现：合理范围内（T1~T3，W1~W3）增施氮肥，喜树叶片叶绿素合成和光合效率显著提高，以T3和W3效果最佳。对油麦菜Lactuca sativa var. longifoliaf[20]和黄瓜Cucumis sativus[21]而言，硝态氮处理下叶绿素相对含量和叶绿素荧光参数高于铵态氮处理；本研究同样发现，处理初期，相同氮素水平下，硝态氮处理组叶绿素质量分数和叶绿素荧光参数显著高于铵态氮，这可能与植物对氮素形态的吸收代谢有关。李晓静等[22]发现铵态氮以被动吸收为主，扩散进入生物膜并破坏生物膜结构，阻碍质子动力势的建立和碳同化物的形成；而硝态氮以主动吸收为主，进入生物膜并储存于液泡中，对植物体内离子平衡、碳同化物的形成有利。RAAB等[23]研究发现：高氮会造成叶绿素酶失活，叶绿素分解，光系统Ⅱ遭到破环，光子传递受阻，使植物发生光抑制现象；如小麦Triticum aestivum在高氮处理下，植物光合结构和功能受到伤害，光合特性降低[24]。本研究发现，处理中后期（60~105 d）高氮水平下（T4和W4），喜树的叶绿素质量分数、叶绿素荧光特性显著下降。原因可能是高铵态氮造成铵离子在体内积累，类囊体结构被破坏，质子形成受阻，形成氧化磷酸化，破坏碳水化合物的形成，导致叶绿素合成受阻和植物光合特性降低[25]；高硝态氮处理破坏土壤理化性质，造成喜树缺素症，表现出对铁、镁等元素吸收的拮抗作用，从而影响植物光合特性[26]。不同氮素形态或水平对qNP影响无显著规律，其原因还需要进一步研究。
光系统Ⅱ（PSⅡ）由多亚基复合组成，吸收外界光能并将激发能转移到反应中心；psbA，psbB和psbC是编码PSⅡ反应中心蛋白质基因，RbcL基因编码核酮糖二磷酸羧化酶的大亚基。研究发现：增施氮肥可以提高植物碳同化能力，促进RbcL表达[27]。以甜菜Beta vulgaris[28]为例，铵态氮处理，其叶片中Rubisco酶基因表达高于硝态氮处理。本研究中，处理初期（30 d）不同氮素形态处理均促进了叶绿体基因的表达，相同水平下硝态氮处理RbcL的表达高于铵态氮；至中后期，T1和W1处理下RbcL的表达显著高于其他同类处理，说明适宜的铵态氮和硝态氮处理提高了植物的碳同化能力；相比之下，硝态氮较铵态氮更有利于提高喜树的碳同化能力，进一步说明了喜树是喜硝植物[29]。叶绿素荧光过程极其复杂，受各种刺激调控，植物碳同化和氮同化可能存在相应的竞争关系。本试验60 d时，叶绿体基因表达下调，可能原因是随着植物对长期环境变化的响应和适应，相关叶绿体基因表达受到影响[30-31]。环境胁迫造成PSⅡ中的蛋白质破坏，受蛋白编码基因刺激表达的影响，受损的蛋白质不断被新合成的蛋白质替代。SHAO等[32]发现：2.0 mg·L-1氮处理下，连苯三酚引起的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa损害可通过psbA的刺激表达弥补。本实验中psbA，psbB和psbC在不同氮素水平处理下表达差异不显著，可能是氮素刺激了PSⅡ的蛋白质合成，形成自我保护机制[33]。高氮处理下，植物光电子传递受阻、热耗散能力显著下降、碳同化能力下降，发生了明显的光抑制现象[34]，也会造成叶绿体基因的表达显著下调。高铵态氮下铵离子的积累破坏了类囊体蛋白，降低了Rubisco酶活力，而高硝态氮下，植物对三价铁离子、二价镁离子的吸收下降，Rubisco酶活力受损，导致叶绿体基质中类囊体光驱电子的转移受阻碍，从而影响质子中铁硫-氧化蛋白的还原[35]。
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图 1 毛竹类囊体膜蛋白BN-PAGE电泳图
Figure 1 Blue-native gel electrophoresis analysis of Ph. edulis thylakoid membrane protein complexes
图 2 类囊体膜蛋白复合物第2向电泳
Figure 2 Two-dimension Tricine-SDS-PAGE results of protein complex in thylakoid membranes in Ph. edulis
图 3 毛竹叶和茎秆的77 K荧光发射光谱和四阶导数光谱
Figure 3 77 K fluorescence emission spectrum and fourth-derivative spectrum from leaves and stems of Ph. edulis
图 4 毛竹叶和茎秆的77 K荧光发射光谱的高斯拟合
Figure 4 77 K fluorescence emission spectra and results of Gaussian fitness for leaves and stems of Ph. edulis
表 1 毛竹叶和茎秆的光合色素质量分数
Table 1. Pigment content in leaves and stems of Ph. edulis
位置 质量分数/(μg·g−1) 叶绿素a/类胡萝卜素 叶绿素a/b 叶绿素a 叶绿素b 总叶绿素 类胡萝卜素 叶 311.60±0.07 A 89.30±0.01 A 400.90±0.08 A 96.00±0.01 A 3.23±0.25 A 3.46±0.27 B 茎秆基部 158.00±1.09 B 52.10±0.20 B 210.10±1.28 B 66.60±0.48 B 2.37±0.06 B 3.03±0.10 B 茎秆中部 64.90±0.29 C 17.00±0.09 C 81.90±0.23 C 28.90±0.17 C 2.25±0.15 B 3.83±0.35 B 茎秆顶部 12.50±0.01 D 2.50±0.01 D 15.00±0.01 D 6.30±0.09 D 2.02±0.31 B 5.07±0.23 A 说明：同列不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01) 
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表 2 毛竹叶和茎秆的77 K荧光发射光谱高斯解析结果
Table 2. Results of Gaussian decomposition of 77 K fluorescence spectra for leaves and stems of Ph. edulis
峰 主峰1 主峰2 峰面积1 峰面积2 半峰宽1 半峰宽2 峰高1 峰高2 峰面积比 峰高比 半峰宽比 叶 687 741 18.94 42.20 26.38 50.87 0.57 0.66 0.45 0.52 0.86 茎秆基部 685 738 12.29 51.10 23.89 66.76 0.41 0.61 0.24 0.36 0.67 茎秆中部 688 768 31.39 23.92 30.32 41.30 0.83 0.46 1.31 0.73 1.80 茎秆顶部 684 756 20.09 61.85 28.09 130.48 0.57 0.38 0.32 0.22 1.50
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