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景宁木兰Magnolia sinostellata是木兰科Magnoliaceae木兰属Magnolia植物，属于典型的极小种群濒危树种。景宁木兰幼苗生长需要一定的荫庇环境[1]，但过度遮阴会抑制景宁木兰幼苗的光合速率[2]。自然状态下，群落所形成的遮阴是影响群落内濒危植物生长发育的重要因素[3]。景宁木兰多生长于光照充足的针叶群落，在针阔混交群落和阔叶群落分布较少[4]。据此推断，群落所形成的遮阴会削弱景宁木兰的生长势，是导致景宁木兰濒危的重要因素。光是影响植物生长发育的重要环境因子。植物的整个生命周期都受到不断变化的光环境影响。光敏色素是植物重要的光感受器，能够感受环境中光信号的变化。光敏色素作用因子(phytochrome interacting factors, PIFs)能够感知红光和远红光信号，在光信号传导和植物生长发育中起到重要作用。光信号在通过信号转导后，能够诱导一系列生理生化反应。光敏色素作用因子是光信号转导中的重要调控因子，属于bHLH超家族的第15亚族，其家族成员都具有高度保守的bHLH结构域。bHLH结构域由约15个氨基酸的碱性结构域(basic region)和60个氨基酸的HLH(helix-loop-helix)结构域组成[5]。目前对PIF家族转录因子的研究主要集中在模式植物拟南芥Arabidopsis thaliana中。PIF转录因子广泛参与了拟南芥的光调控反应，并在光敏色素介导的光信号网络调控中处于主导地位[6]。黑暗条件下，AtPIF1能够抑制拟南芥种子的萌发，AtPIF3、AtPIF4、AtPIF5能够促进叶绿素分解并抑制叶绿体活性，从而最终导致叶片衰老[7]。遮阴条件下，AtPIF1能够通过调控AtHB1的表达来促进下胚轴的伸长[8]；AtPIF4、AtPIF5和AtPIF7通过促进AtFT和AtTSF的表达从而促进拟南芥开花[9]；AtPIF4、AtBZR1和AtARF6通过整合生长素信号与BR和光敏色素通路来协同促进拟南芥下胚轴的伸长[10]。由此可见，PIF家族转录因子是遮阴条件下光信号转导途径中的关键调控因子。据此推测，PIF家族转录因子在光照强度对木兰属濒危树种生长发育的影响及光受体信号转导途径中起到重要作用。因此，本研究对景宁木兰PIF家族转录因子进行分析鉴定，探究其在极端遮阴条件下的表达模式，从而为揭示光介导的景宁木兰生长发育的分子机制、群落引起的遮阴而导致景宁木兰濒危的内在机制奠定基础，最终为珍稀植物景宁木兰的保育提供理论依据。
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景宁木兰来自浙江省杭州市青山湖花园中心苗圃培育的3年生扦插苗。2019年6月下旬，选择长势一致且无病虫害的扦插苗作为材料，置于温度为(25±2) ℃、光照强度为2 000~2 500 lx、相对湿度为40%~60%的人工气候室中进行培养，光照与黑暗时间各12 h，定期浇水保持土壤湿润。
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3层遮阳网形成的光照强度是景宁木兰自然生境光照条件之一，会显著削弱景宁木兰的生长势[1]。2019年7月上旬开始遮阴处理，本研究于浙江省杭州市临安区浙江农林大学人工气候室内，用3层黑色遮阳网及竹竿搭建极端遮阴处理(25%光照，ST)装置，以模拟遮阴条件下的景宁木兰野外生存环境。以100%全光照为对照(ck)。所有盆栽苗叶片之间无重叠。每个处理4个生物学重复。分别自实验开始处理第0、1、3、5、10、20、30天时，拍照记录植株表型变化、采集景宁木兰植株的中层叶片装入锡纸袋中，并迅速置于液氮中速冻，随后转入−80 ℃冰箱中储存，用于植物RNA的提取及后续实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)实验。
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基于实验室已有的转录组测序数据，在NR、NT、Swiss-Prot这3个数据库中进行注释，初步注释到46个PIF转录因子相关基因，将这些基因编码蛋白质逐个进行NCBI Blast和NCBI CDD预测，去除重复序列及冗余转录本后，最终得到9个PIF家族转录因子的蛋白质序列。利用MEGA 5.0对景宁木兰PIF转录因子序列与拟南芥PIF转录因子序列进行比对分析，根据TOLEDO等[5]命名拟南芥PIF家族的方法对9个景宁木兰PIF转录因子进行命名。拟南芥PIF转录因子序列从拟南芥转录因子数据库(https://www.arabidopsis.org/)中获得。
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采用Compute pI/Mw在线工具预测景宁木兰PIF转录因子蛋白质的等电点及分子量，采用在线网站Cell-PLoc 2.0预测亚细胞定位，利用NetPhos分析蛋白质磷酸化位点；利用MEME分析蛋白质保守结构域；利用DNAMAN比对分析保守结构域；利用在线软件heatmapper(http://www2.heatmapper.ca/expression/)绘制热图；为研究PIF转录因子家族的进化关系，利用MEGA5.0将9个景宁木兰MsPIF蛋白质序列、15个拟南芥AtPIF蛋白质序列[11]、6个玉米Zea mays ZmPIF蛋白质序列[12]、10个杨树Populus trichocar PtPIF蛋白质序列(http://www.Phytozome.net/poplar.php)[13]进行序列比对，并用邻接法构建系统进化树，进行Bootstrap测试，重复设置为1 000 次。
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采用植物RNA提取试剂盒提取样品总RNA。取1 μg RNA进行第1链 cDNA的合成。所用定量PCR试剂为BCG qPCR Master Mix。根据景宁木兰转录组数据设计特异性引物(表1)。以景宁木兰的EF1-α基因作为内参基因[1]，利用Light Cycler 480II(Roche)仪器进行目的基因qRT-PCR表达分析。反应程序结束后，65~95 ℃每隔0.2 s作溶解曲线，采用
${2^{ - \Delta \Delta {C_{\rm{t}}}}} $ 法计算目的基因的相对表达量。每个样品重复3次。表 1 实时荧光定量PCR引物
Table 1. Primers used for qRT-PCR analysis
基因名称 正向(反向)引物序列(5'→3') 退火温度/℃ 扩增效率/% 相关系数R2 MsbHLH68 F-CCTCAGGCTCTGTCATTGGG 59.5 90.86 0.998 R-AGCGGTTGGGCTTCTTCACG 59.5 MsPIF4 F-GCCGAAGAATCTGAGTGCCA 57.4 96.98 0.999 R-CTATCCCTCCGTCTCCTTTC 57.4 MsbHLH1 F-CTTTGTGCTATCTTCGGGAACG 57.7 104.48 0.997 R-GGGACCCACCAATCAACGAC 59.5 MsPIF8 F-AAGCGAGGATGAGAACAAGG 55.4 93.01 0.983 R-TGCGTTCGGATTGGTTATGG 55.4 MsbHLH66 F-AGCAGTAACGGCACGCAGAC 59.5 101.57 0.995 R-GAAATGGGCATGAGGCAGAG 57.4 MsPIF3 F-CAGACTCAGCCGTCAACTCA 57.4 92.93 0.991 R-GCAGGCCCACTTCCACCAAT 59.5 MsPIF1 F-CCACATATTCCTCCATTTGAT 51.7 100.90 0.994 R-GAAGGCTGAGGTAGTGTTGATA 55.8 MsbHLH48 F-CCGTCGAGTCTCCAGTGGTC 61.6 96.92 0.993 R-CGTTTGAAGGGAAGGTAGGG 57.4 MsbHLH23 F-GCAGACAAAGGACCCAAGGA 57.4 93.01 0.993 R-CACGAGGAGTGAGGAACAAGAA 57.7 -
采用SPSS 19.0进行方差分析并用SigmaPlot 14绘图，对平均值采用独立样本T检验进行比较，显著水平为0.05。
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利用ExPASy对9个基因编码的氨基酸进行理化性质进行分析(表2)，发现9个基因编码的蛋白质大小不等，最小的为MsPIF1，编码188个氨基酸，最大的为MsPIF3，编码735个氨基酸。9个蛋白质的理论等电点为5.18(MsbHLH68)~8.22(MsPIF8)，表明不同的PIF家族蛋白质在不同的微环境中发挥不同的生物学功能。9个PIF家族蛋白质均属于不稳定、亲水性蛋白质。
表 2 MsPIF基因家族
Table 2. MsPIF gene family of M. sinostellata
基因名称 蛋白质分子量/Da 氨基酸数/个 等电点 不稳定系数 脂肪系数 平均亲水性 亚细胞定位 磷酸化位点 Ser Thr Tyr MsbHLH68 53 604.79 506 5.18 58.19 77.51 −0.447 细胞核(N) 47 10 1 MsPIF4 57 883.06 527 5.96 56.05 64.57 −0.611 细胞核(N) 40 12 3 MsbHLH1 74 557.30 671 5.52 53.08 79.66 −0.452 细胞核(N) 34 14 6 MsPIF8 50 048.29 456 8.22 42.09 58.29 −0.686 细胞核(N) 36 20 4 MsbHLH66 45 976.46 430 6.79 60.45 69.72 −0.558 细胞核(N) 45 14 1 MsPIF3 78 957.02 735 6.31 67.37 63.80 −0.513 细胞核(N) 74 13 3 MsPIF1 20 314.56 188 5.93 60.78 60.32 −0.341 细胞核(N) 4 2 1 MsbHLH48 40 255.00 366 6.43 59.85 70.90 −0.639 细胞核(N) 40 6 2 MsbHLH23 39 480.07 362 5.82 72.07 70.14 −0.577 细胞核(N) 43 9 2 说明：Ser为丝氨酸，Thr为苏氨酸，Tyr为酪氨酸 -
通过在线软件Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)对9个PIF基因家族成员的氨基酸序列进行亚细胞定位预测(表2)，9个基因编码的蛋白质均定位于细胞核内，符合其转录因子的功能，可能通过调控细胞核基因的转录来发挥功能。
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蛋白质磷酸化在很多植物信号转导过程中起着重要作用[14]。蛋白质磷酸化的可逆性使得植物细胞能够快速响应外部环境变化[15]。在正常光条件下，PIF家族转录因子与光敏色素相互作用，从而导致PIF蛋白质的磷酸化和降解[16]。而在低光照条件下，PIF蛋白质的磷酸化和降解受到抑制[17]。因此，分析PIF蛋白质的磷酸化位点对研究其在信号转导中的功能有重要意义。利用NetPhos对9个PIF家族蛋白质的磷酸化位点进行分析(表2)，发现9个蛋白质均具有丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)磷酸化位点，且Ser的磷酸化位点最多，Tyr的磷酸化位点最少。其中磷酸化位点最多的是MsPIF3，为94个，MsPIF1的磷酸化位点最少，仅7个。
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进一步利用MEME在线软件分析MsPIF蛋白质[16]，共鉴定到6个基序(表3)。结果显示(图1)：9个蛋白质含有不同数目的基序，MsPIF4和MsPIF8含有的基序最多，为5个，而MsbHLH48中含有的基序最少，仅2个。bHLH家族蛋白质均含有bHLH基序，该基序由位于N端的basic基序(图2A)和位于C端的HLH基序(图2B)组成[5]。9个PIF家族蛋白质均含有basic基序及HLH基序。不同蛋白质的同源异型基序之间存在一定差异。MsPIF4、MsPIF3和MsPIF8中含有APB基序(active phyB-binding motif)(图2C)，表明其可以与PhyB(phytochrome B)相结合，从而对下游基因的表达进行调控[16]。此外，MsPIF4和MsPIF3中还含有APA基序(active phyA-binding motif)(图2D)，表明其既可以与PhyA(phytochrome A)相结合也可以与PhyB相结合。
表 3 景宁木兰PIF家族蛋白质的主要MEME基序
Table 3. Major MEME motif sequences in M. sinostellata PIF protein
基序 宽度/个 最佳匹配 Motif1 40 MKALQELIPNSNKTDKASMLDEAIEYLKSLQLQVQMLSM Motif2 21 RGRAAEVHNLSERRRRERINE Motif3 21 MMFPGVQQYMPPMGMGMGMGM Motif4 36 FEQZIVKLMEEDMGSAMQYLQGKGLCLMPIALAAAI Motif5 8 ELLWENGQ Motif6 8 CVPBWBTD 
图 1 MsPIF蛋白质的基序
Figure 1. Motif of MsPIF protein
图 2 MsPIF家族蛋白质的basic、HLH、APB和APA基序蛋白质序列比对
Figure 2. Sequence alignment of basic, HLH, APB and APA motif protein sequences of MsPIF
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运用MEGA5对所得景宁木兰的蛋白质序列与拟南芥、玉米、杨树中的序列对比分析(图3)，采用邻接法及Bootstrap分析(1 000次重复)构建系统进化树[18]。结果表明：植物PIF家族蛋白质表现出多样性，可以分为7个进化分枝。其中，9个MsPIF蛋白质分布在α、β、γ、δ、η、ε等6个进化枝。15个AtPIF蛋白质分布在α、β、γ、δ、ζ、ε等6个进化枝，其中ζ为拟南芥所特有。ZmPIF蛋白质仅分布于β和δ进化枝，10个PtPIF蛋白质分布在α、β、γ、δ、ε等5个进化枝。从进化树可以看出，MsPIF8、MsPIF4、MsPIF1、MsPIF3及MsbHLH23均与相应的拟南芥蛋白质与杨树蛋白质聚类在一起，表明其亲缘关系较为接近。MsbHLH68、MsbHLH66、MsbHLH48汇聚于η枝，为景宁木兰所特有。
图 3 景宁木兰、拟南芥、玉米和杨树的PIF家族蛋白质的系统进化分析
Figure 3. Phylogenetic tree analysis of MsPIF protein and AtPIF protein sequences in M. sinostellata, A. thaliana, Z. mays, P. trichocarpa
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光照是植物生长发育过程中不可或缺的因素，极端遮阴处理过程中，景宁木兰叶片表型变化十分明显(图4)。处理10 d，景宁木兰叶片出现褐色斑点；处理20 d，褐色斑点面积增大，植株开始萎蔫；处理30 d，大量叶片干枯脱落，植株萎蔫严重。
图 4 遮阴处理过程中景宁木兰的表型变化
Figure 4. Phenotypic changes of M. sinostellata during shading treatment
PCR扩增琼脂糖凝胶电泳检测发现9个基因均扩出预期条带(图5)。qRT-PCR检测结果(图6)表明：遮阴处理1 d时，MsbHLH23和MsbHLH66的表达水平显著上调，MsbHLH1、MsbHLH48、MsPIF8、MsPIF3的表达水平均显著下调，其余基因表达水平无显著变化。遮阴处理3 d时，MsPIF8的表达显著低于对照，其余基因的表达均显著上调。遮阴处理5 d时，MsPIF8的表达仍显著降低，MsbHLH68、MsbHLH23、MsbHLH66、MsbHLH1、MsbHLH48的表达显著上调，其余基因的表达无显著差异。遮阴处理10 d时，MsPIF8、MsPIF7、MsPIF3的表达均显著下调，MsbHLH68、MsbHLH23、MsbHLH66、MsPIF4的表达显著上调。遮阴处理20 d时，MsPIF8、MsbHLH23、MsPIF1的表达相对于对照显著下调，MsbHLH68和MsbHLH66的表达显著上调，其余基因无显著差异。遮阴处理30 d时，MsPIF8、MsbHLH23的表达相对于对照显著下调，MsbHLH68、MsbHLH1、MsbHLH66、MsbHLH48、MsPIF3的表达显著上调。其中，MsbHLH23的表达变化比其他基因更为明显，遮阴处理5和10 d时的表达量分别上调为对照的52.77与20.03倍。
图 5 qRT-PCR扩增产物特异性
Figure 5. Specificity of qRT-PCR amplification products
图 6 遮阴条件下景宁木兰PIF转录因子的qRT-PCR分析
Figure 6. qRT-PCR analysis of PIF transcription factor under shading treatment of M. sinostellata
基因的表达模式与基因功能关系密切，基于获得的景宁木兰处理组的qRT-PCR数据，采用heatmap在线软件对这些基因的差异表达进行分层聚类分析(图7)。结果发现：MsPIF1、MsPIF3、MsPIF4、MsPIF8的表达模式十分相似，其表达均在处理3 d时明显升高，随后逐渐下降。MsbHLH48的表达在处理0~30 d逐渐上调，其中处理30 d时的表达上调最为明显。MsbHLH1、MsbHLH68、MsbHLH66、MsbHLH23的表达模式均为先逐渐上调后逐渐下调，其中MsbHLH1和MsbHLH23的表达在处理5 d显著上调，MsbHLH68和MsbHLH66的表达分别在处理10和20 d明显上调。
图 7 长期极端遮阴条件下景宁木兰PIF转录因子的表达模式
Figure 7. Pattern of expression of PIF family during shading treatment period of M. sinostellata
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PIF家族转录因子广泛存在于植物中。目前PIF家族转录因子在拟南芥中研究的最为透彻，共有15个[5]。在其他物种中，杨树至少存在10个[13]，玉米有6个[12]，水稻Oryza sativa有6个[19]。本研究从景宁木兰中仅筛选到9个，这一方面是由于景宁木兰本身具有特异性，另一方面可能是因为转录组数据库还不够丰富造成的。NCBI blast及NCBI CDD预测结果表明：9个PIF蛋白质均含bHLH结构域，属于PIF转录因子家族。同源性较高的蛋白质通常功能也相似[18]。因此，本研究用所得9个景宁木兰PIF家族转录因子编码蛋白质与6个ZmPIFs、10个PtPIFs 和15个功能明确的AtPIFs编码蛋白质作系统进化树，主要根据与15个拟南芥PIF家族转录因子编码蛋白质进化关系的远近推测景宁木兰PIF转录因子的功能。AtPIF3与PtPIF3a、PtPIF3b同源性较高，且与AtPIF3和ZmPIF3位于同一进化枝，据此推测MsPIF3与AtPIF3功能相似。MsPIF4与PtPIF4、ZmPIF4、AtPIF4位于同一进化枝。AtPIF3蛋白质在植株刚刚暴露到光下时会急剧减少，在黑暗条件下会重新积累，在拟南芥幼苗阶段，AtPIF3在光诱导的叶绿体发育中起到积极的作用[20]。AtPIF3、AtPIF4和AtPIF5在年龄引起的和黑暗引起的植物衰老中起到重要作用，其中AtPIF4通过调控叶绿素降解和维持叶绿体活性的相关基因从而促进植株衰老[7]。AtPIF4能够调控下游基因从而促进拟南芥开花[21]。
此外，AtPIF4能与AtBZR1共同调节下游光响应的相关基因。AtPIF7与MsbHLH1同源性较高，推测其功能可能类似。遮阴条件下，AtPIF7是调控拟南芥茎伸长的重要因子[17]。AtPIF7是调节植物去黄化的弱负反馈因子，与PhyB结合的过程中通常不伴随着可以监测到的磷酸化和分解[22]。MsPIF8与AtPIF8同源，推测其功能相似。与AtPIF3不同，AtPIF8蛋白质在远红光下的积累比在黑暗条件中或红光条件下更多，AtPIF8能够抑制由PhyA介导的种子萌发、下胚轴伸长等生命活动[23]。MsbHLH23与AtbHLH24功能相似，AtbHLH24在抑制种子萌发和维持种子休眠状态中具有重要作用[24]。AtbHLH24能够激活细胞分裂素信号，同时激活生长素生物合成和雄蕊内部结构域的转运基因，并且在花瓣和果实发育中起到重要作用[25]。MsbHLH68，MsbHLH66和MsbHLH48共同汇集于同一进化枝，其功能还需要进一步挖掘。但是，即使是同一分支内蛋白质功能也可能存在差异，并且不同物种之间具有较大的差异[18]。因而关于MsPIF家族蛋白质的具体功能还需要通过后续研究。
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群落层片造成的遮阴会降低下层植被的生长率与成活率[26]。本研究极端遮阴处理组的景宁木兰在处理过程中逐步萎蔫死亡。光敏色素作用因子(PIFs)在植物的生长发育中起到重要调节作用。PIFs作为光信号转导途径中的负调控因子，对植物生长发育的多个过程都有调控作用[27-32]。PIF家族转录因子是光敏色素介导的光信号转导途径中的负反馈因子[28]。遮阴条件下，PIF蛋白质大量积累，从而调控植物发生一系列生理生化反应。考虑到植物的个体差异和基因表达差异，本研究的每个取样时间点都作了相应的空白对照。本研究中，长期极端遮阴条件下，景宁木兰的PIF类家族转录因子的表达水平多数显著上调，只有MsPIF8的表达水平显著下调。在拟南芥中，与其他PIF家族成员相比，AtPIF8能够与PhyB结合但效果微弱[23]。MsPIF8的表达模式与前人的研究结论存在差异，可能与物种特异性相关，有关MsPIF8的功能还需要进一步研究。MsPIF1、MsPIF3和MsPIF4的表达模式与前人的研究结论[29]吻合。黑暗条件下，AtPIF1的表达上调，从而抑制叶绿素的合成与种子萌发；AtPIF3、AtPIF4的表达显著上调，从而促进叶绿素的降解与叶片衰老[29]。植物群落造成的遮阴使得AtPIF4的表达上调，从而使成花诱导相关基因的表达上调，最终诱导拟南芥提早开花[21]。PIF功能十分复杂，景宁木兰PIF家族转录因子在遮阴调控网络中发挥的作用还需要进一步研究。
Bioinformatics analysis of PIF transcription factors in Magnolia sinostellata and expression pattern analysis under extreme shading condition
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摘要:
目的 群落所造成的遮阴是导致景宁木兰Magnolia sinostellata濒危的重要因素之一。PIF家族转录因子在光信号传导和植物生长发育中起到重要作用。对PIF家族转录因子进行系统分析和研究，为探究其在景宁木兰光信号转导机制中的作用奠定基础。 方法 从景宁木兰转录组数据中鉴定获得PIF家族转录因子并进行生物信息学分析，利用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术对其在极端遮阴条件下的表达模式进行分析。 结果 从景宁木兰转录组中共筛选出9个MsPIFs转录因子基因，其编码的蛋白质长度为188~735 个氨基酸，蛋白质大小为20 314.56~78 957.02 Da，理论等电点范围为5.18~8.22。MsPIFs基因编码的蛋白质均为不稳定蛋白质，所有蛋白质均为亲水性蛋白质。亚细胞定位预测结果显示所有蛋白质均定位于细胞核。9个蛋白质均具有丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Try)磷酸化位点。qRT-PCR结果表明：极端遮阴条件下，9个MsPIFs家族基因表达均发生不同程度的变化。其中，MsbHLH23的表达变化较其他基因更为明显，遮阴处理5和10 d时的表达量分别上调为对照的52.77与20.03倍。 结论 景宁木兰PIF转录因子家族均能响应遮阴，为后续对MsPIFs进行生物学功能鉴定奠定了基础。图7表3参32 Abstract:Objective The shading caused by the community is one of the important factors that lead to the endangerment of Magnolia sinostellata. Therefore, it is important to conduct a systematic analysis and research of PIF family transcription factors which play an important role in light signal transduction and plant growth. Also, such analysis will help lay a foundation for the exploration of its role in the light signal transduction mechanism of M. sinostellata. Method With the transcriptome data of M. sinostellata collected, transcription factors of PIF family were identified and analyzed by bioinformatic while the expression patterns were analyzed employing the qRT-PCR technology. Result The nine MsPIFs transcription factor genes screened from the M. sinostellata enjoyed a length of 188−735 aa, a protein size of 20314.56−78957.02 Da, and a theoretical isoelectric point range of 5.18−8.22. The proteins encoded by MsPIFs gene were unstable proteins, and all proteins were hydrophilic proteins localized in the nucleus as was demonstrated in the subcellular localization prediction. All nine proteins have Ser, Thr and Try phosphorylation sites. As was shown in the qRT-PCR results, under extreme shading conditions, there was the occurrence of changes of different degrees in the gene expression of 9 MsPIFs families of which MSBHLH23 has an expression level that was 52.77 and 20.03 times higher than that of the control at 5 d and 10 d after shading treatment. Conclusion The PIF transcription factor family of M. sinostellata can respond to shading and this study has laid a foundation for the identification of MsPIFs biological function. [Ch, 7 fig. 3 tab. 32 ref. ] -
在遗传转化获得抗性植株时，转化体的抗性筛选是遗传转化能否取得成功的关键步骤。通常在选择培养基中加入合适种类和浓度的筛选剂，使其产生一定的筛选压起到抗性筛选的作用。转化体内选择标记基因的表达产物可对特定筛选剂产生抗性，使转化受体材料继续保持正常的生长发育[1]。目前的研究中，卡那霉素、潮霉素等抗生素被普遍作为筛选剂使用[2-3]。但是由于水稻Oryza sativa胚性愈伤组织对抗生素具有生理抗性，以抗生素为选择标记进行抗性筛选，不能起到很好的筛选效果，且经抗生素筛选后的转化体在分化和再生阶段易受抑制或产生白化苗[4-6]。以草甘膦作为筛选剂可以提高选择的灵敏度，消除转化体生理抗性对筛选结果的影响，克服了以往研究中抗生素筛选的局限性。可遗传的草甘膦抗性基因突变率低，并可在后代中稳定表达，因此进行抗草甘膦作物的培育是可行的[7]。籼稻Oryza sativa subsp. indica和粳稻Oryza sativa subsp. japonica是栽培稻的2个亚种，随着水稻遗传转化技术的发展，大部分粳稻品种已经建立了成熟的遗传转化体系，并成功引入抗虫、抗病、生长发育调控等诸多有利基因[8]。而大多数籼稻品种组培特性不佳，愈伤组织诱导率低，继代过程易褐化且分化再生频率低，导致籼稻的遗传转化效率低，有的品种甚至难以转化。尤其是对生产上广泛推广、农艺性状优良的重要品种而言，其改良与育种进程受到严重限制[9]。CHAN等[10]于1992年尝试利用农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法转化籼稻幼根愈伤组织，对转化体进行Southern印记杂交，结果表明：目的基因片段已成功转入转化体细胞中。后经酶活性检测，目的基因可在转化体中稳定表达。1994年，HIEI等[11]为建立高效稳定的农杆菌遗传转化体系，采用了“双超元”载体，并通过在菌液添加乙酰丁香酮(As)活化Vir基因提高转化效率等方法，推进了遗传转化技术在籼稻中的研究应用。目前，虽然已有转抗草甘膦基因的籼稻遗传转化体系的报道，但是转化效率低，还未建立一个高效的转化体系[12]。基于此，本研究选取具有成功再生体系的籼稻‘中恢161’ Oryza sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’为材料，利用农杆菌介导法，转入草甘膦抗性基因(CP4)，探索适合的草甘膦质量浓度用于抗性筛选，并对农杆菌介导的转化过程进行了合理优化，建立‘中恢161’农杆菌介导的转化体系。
1. 材料与方法
1.1 材料
籼稻‘中恢161’成熟胚；农杆菌菌株EHA105；含CP4基因的表达载体p1300-HC。
1.2 方法
1.2.1 成熟胚胚性愈伤组织的诱导和增殖
将成熟种子去壳，进行消毒[13]，接种于诱导培养基R1[NB(N6+B5)+3.0 mg·L−12.4-D+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+30.0 g·L−1蔗糖+4.0 g·L−1Gelrite]上，接种20 粒·皿−1。放入培养条件为28 ℃，光照16 h/黑暗8 h的组培室中诱导培养。5~7 d后，可观察到幼芽处有淡黄色愈伤组织，统计每皿的出愈数和出愈率。15 d后，剥下色泽鲜黄、结构紧密、生理状态良好的胚性愈伤组织，分散平铺于新鲜配制的胚性愈伤组织增殖培养基R1上进行增殖培养。继代2~4次后，增殖并产生大量的胚性愈伤组织，可用做后期转化的受体材料。
1.2.2 胚性愈伤组织的草甘膦敏感性测试
设置5组草甘膦质量浓度(100、200、300、400和500 mg·L−1)，重复3次，设空白对照，接种20块·皿−1。15 d后，观察胚性愈伤组织的色泽、是否增殖等外观形态，统计胚性愈伤组织褐化率，选出合适的草甘膦质量浓度范围作为筛选压。
1.2.3 胚性愈伤组织的遗传转化和抗性筛选
利用悬浮培养基R2(NB+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+30 g·L−1蔗糖+100 μmol·L−1乙酰丁香酮)将培养好的含CP4基因表达载体的农杆菌菌株EHA105稀释至D(600)为0.5~0.8，用其侵染胚性愈伤组织[14]。将转化好的胚性愈伤组织用无菌滤纸吸干多余的菌液，适当干燥后，用灭菌镊子夹取愈伤组织分散地平铺在铺有1层无菌滤纸的共培养培养基R3(NB+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+30.0 g·L−1蔗糖+100 μmol·L−1乙酰丁香酮+4.0 g·L−1Gelrite)上，20 块·皿−1。于25 ℃培养室中暗培养2~3 d。取出共培养后的愈伤组织，用含100 mg·L−1羧苄青霉素的无菌蒸馏水清洗3~4次，直至清洗液澄清透明。适度干燥后，用镊子夹取愈伤组织整齐均匀地平铺在筛选培养基R4(NB+3 mg·L−12.4-D+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+0.5 g·L−1谷氨酰胺+30.0 g·L−1蔗糖+4.0 g·L−1Gelrite+0.5 g·L−1头孢霉素+不同质量浓度草甘膦)上。抗性筛选培养基中草甘膦质量浓度分别为300、350和400 mg·L−1。
1.2.4 分化、生根、移栽成活
将抗性愈伤组织系移至分化培养基R5(NB+0.5 mg·L−1 NAA+3.0 mg·L−16-BA+0.5 g·L−1脯氨酸+0.1 g·L−1肌醇+0.3 g·L−1水解酪蛋白+0.5 g·L−1谷氨酰胺+30.0 g·L−1蔗糖+4.0 g·L−1Gelrite)上进行分化培养。约15~25 d，部分抗性愈伤组织长出绿点。待绿点进一步分化形成小苗，并长至2 cm左右时将其转移至生根培养基R6(1/2NB+20.0 g·L−1蔗糖+0.1 g·L−1肌醇+8.0 g·L−1琼脂)上生根培养。待幼苗生长出大量的茁壮根系，可将其从生根培养基中取出，小心洗净其根系附着的培养基，置于培养箱中炼苗，增强幼苗对环境的适应性，1周后将健壮的幼苗移至大棚成活。
1.2.5 转基因植株的分子检测和CP4基因试纸条检测蛋白表达
利用TPS法提取转基因植株叶片DNA。利用CP4基因引物(CP4-F: TTCCTTTAGGATTTCAGCATCAGTG, CP4-R: TCCTTCATGTTCGGCGGTCTC)进行CP4基因的PCR扩增，目的片段大小为400 bp。扩增后的产物经质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，统计阳性率。取阳性植株叶片，利用CP4基因表达检测试纸条进行再生植株抗性检测。
2. 结果和分析
2.1 草甘膦抗性筛选最适质量浓度
图1和图2所示：‘中恢161’的胚性愈伤组织在不含草甘膦的培养基中可正常生长且大量增殖，未发生褐化现象；在含100 mg·L−1草甘膦的培养基中，绝大多数胚性愈伤组织可正常生长增殖，褐化率低，仅为5.00%，未起到选择作用；在含200 mg·L−1草甘膦的培养基中褐化率为16.67%，选择效果不明显；在含300 mg·L−1草甘膦的培养基中，褐化率为41.67%，且与200 mg·L−1相比差异显著(P＜0.05)，选择效果好，适合作为筛选压；在含400 mg·L−1草甘膦的培养基中，大部分胚性愈伤组织发生褐化，少部分正常生长，褐化率为65.00%，选择效果明显；在含500 mg·L−1草甘膦的培养基中，胚性愈伤组织基本发生褐化，褐化率为91.67%，显著高于其他质量浓度下的褐化率(P＜0.05)，说明选择压过大。结果表明：草甘膦质量浓度为300~400 mg·L−1时，胚性愈伤组织褐化率约50%，具有很好的筛选效果。
图 1 籼稻‘中恢161’胚性愈伤组织在不同质量浓度草甘膦培养基中培养20 d后的褐化率Figure 1 Browning rate of O.sativa subsp.indica ‘Zhonghui 161’ callus cultured in different concentrations of glyphosate for 20 days
图 2 籼稻‘中恢161’胚性愈伤组织在不同质量浓度草甘膦培养基中培养20 d后的褐化情况Figure 2 Browning rate of O. sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’ callus cultured in different concentrations of glyphosate for 20 days2.2 抗性愈伤组织和转基因植株的分子检测
转化后的胚性愈伤组织在含有300、350和400 mg·L−1草甘膦的选择培养基上进行抗性筛选，分别获得200、113、和84块抗性愈伤组织，提取抗性愈伤组织DNA进行CP4基因的PCR检测，阳性愈伤组织的PCR扩增产物经电泳可获得长度为400 bp的条带，与预期相符，表明CP4基因已成功整合到转化体内。进行3个草甘膦质量浓度抗性筛选后愈伤组织阳性率分别为40.16%、61.72%和84.04%。共获得67株再生植株，提取再生植株叶片DNA进行CP4基因的PCR检测。其中阳性植株43株，再生植株阳性率为64.18%(图3)。
图 3 籼稻‘中恢161’再生植株CP4基因的PCR检测Figure 3 PCR result of CP4 gene from glyphosate-resistance plants2.3 CP4基因试纸条检测蛋白表达
抗性检测结果(图4)表明：检测的43株PCR阳性植株中，有25株表现为CP4基因表达，表达率为58.13%。
2.4 ‘中恢161’成熟胚遗传转化体系的建立
遗传转化再生过程如图5所示：对籼稻‘中恢161’成熟胚进行胚性愈伤组织诱导，约7 d可诱导出胚性愈伤组织(图5A)。胚性愈伤组织进行2~4次继代增殖(图5B)，约40 d后进行遗传转化。转化后的胚性愈伤组织在选择培养基上进行抗性筛选(图5C~D)，一段时间后，抗性愈伤组织系会出现增殖(图5E)。约50 d后，抗性愈伤组织于R5培养基上进行分化培养，约15~25 d，长出绿点(图5F)。1个月左右，长出小苗(图5G)。小心取出转移至R6培养基进行生根培养(图5H)。约15 d，幼苗长出大量的茁壮根系，将其从培养基中移出，小心洗净根部培养基。置于培养箱中炼苗，炼苗1周后可移至大棚成活。对再生植株进行CP4基因的PCR检测，保留阳性植株。从诱导胚性愈伤组织至获得抗草甘膦再生植株的整个过程需要4~6个月。
图 5 CP4基因转化籼稻‘中恢161’胚性愈伤组织的各个阶段Figure 5 Various stages of transforming CP4 gene into embryogenic callus of O.sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’3. 结论与讨论
3.1 草甘膦抗性筛选及其优势
本研究建立了以草甘膦抗性基因CP4为选择标记的‘中恢161’遗传转化体系。非转化体的EPSPS酶活性较低，草甘膦可与S3P形成EPSPS-S3P-草甘膦复合体而竞争性抑制EPSPS酶活性，植物体内蛋白质合成受阻，生长受到抑制，不能正常生长分化[15]。而转化体抗草甘膦基因CP4的表达产物EPSPS酶具有高催化活性和低草甘膦亲和力不易与草甘膦结合，故能够进行正常的生长分化。因此，通过草甘膦筛选可获得转抗草甘膦基因CP4的再生植株。相较于以抗生素抗性基因为选择标记，草甘膦抗性基因不仅能作为筛选标记也能作为目的基因，使受体植物获得除草剂抗性，而且草甘膦比潮霉素等抗生素便宜[7]。不同植物细胞对草甘膦的抗性存在差异，选择合适的草甘膦质量浓度作为抗性筛选的筛选压是影响转化效率的关键因素。本研究将转化后的胚性愈伤组织分别在含有300、350和400 mg·L−1草甘膦的选择培养基上进行抗性筛选，进一步分化、成苗，共获得67株再生植株，进行CP4基因的PCR检测，其中阳性植株43株，再生植株阳性率为64.18%，达到很好的选择效果。
3.2 籼稻遗传转化体系的优化
3.2.1 受体材料的选择及胚性愈伤组织的代龄
能否成功进行遗传转化的重要前提是选择适合的植物材料作为转化受体。水稻幼胚分裂能力强，易形成大量优质胚性愈伤组织，但受季节的影响，水稻幼胚利用不便，且在组织培养过程中易受微生物污染，转化效率不高，因此作为转化体存在一定的困难[16]。成熟胚方便储存与利用，不受季节限制和胚性愈伤组织诱导率较高，通常被作为遗传转化和再生的良好的外源体材料。苏军[17]比较了不同代龄的胚性愈伤组织，发现第4、5代的胚性愈伤组织转化效率较高，并且分化能力也较强。早代愈伤组织不易接受外源遗传物质。但晚代愈伤组织容易出现质地软、水渍化等现象，影响遗传转化成功率。本研究选择胚性愈伤组织代龄为3~4代，可有效减少愈伤组织老化、色泽暗黄、结构松散和褐化率高等问题，有效提高了遗传转化效率。
3.2.2 转化过程的优化
为提高遗传转化效率，本研究采取一系列措施对转化过程进行合理优化。①转化阶段选用色泽鲜黄、外观形态良好、结构紧致的愈伤组织与农杆菌共培养，淘汰外观发白发软发褐的愈伤组织。②在共培养基R2和悬浮培养基R3中加入100 μmol·L−1乙酰丁香酮，可诱导农杆菌Vir基因的活化，从而促进外源基因的整合，极大提高转化效率[18]。③农杆菌菌液经悬浮培养液R3稀释后，D(600)为0.5~0.8。此时为最适菌液浓度，既不会使农杆菌在转化体表面过多繁殖影响其正常生长，又具一定的侵染能力，提高了转化效率。④黑暗条件下共培养2~3 d为适合的共培养时长。共培养时间过短，目的基因不能成功整合至转化体细胞内[19-20]。
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图 2 MsPIF家族蛋白质的basic、HLH、APB和APA基序蛋白质序列比对
Figure 2 Sequence alignment of basic, HLH, APB and APA motif protein sequences of MsPIF
图 3 景宁木兰、拟南芥、玉米和杨树的PIF家族蛋白质的系统进化分析
Figure 3 Phylogenetic tree analysis of MsPIF protein and AtPIF protein sequences in M. sinostellata, A. thaliana, Z. mays, P. trichocarpa
图 4 遮阴处理过程中景宁木兰的表型变化
Figure 4 Phenotypic changes of M. sinostellata during shading treatment
图 6 遮阴条件下景宁木兰PIF转录因子的qRT-PCR分析
Figure 6 qRT-PCR analysis of PIF transcription factor under shading treatment of M. sinostellata
图 7 长期极端遮阴条件下景宁木兰PIF转录因子的表达模式
Figure 7 Pattern of expression of PIF family during shading treatment period of M. sinostellata
表 1 实时荧光定量PCR引物
Table 1. Primers used for qRT-PCR analysis
基因名称 正向(反向)引物序列(5'→3') 退火温度/℃ 扩增效率/% 相关系数R2 MsbHLH68 F-CCTCAGGCTCTGTCATTGGG 59.5 90.86 0.998 R-AGCGGTTGGGCTTCTTCACG 59.5 MsPIF4 F-GCCGAAGAATCTGAGTGCCA 57.4 96.98 0.999 R-CTATCCCTCCGTCTCCTTTC 57.4 MsbHLH1 F-CTTTGTGCTATCTTCGGGAACG 57.7 104.48 0.997 R-GGGACCCACCAATCAACGAC 59.5 MsPIF8 F-AAGCGAGGATGAGAACAAGG 55.4 93.01 0.983 R-TGCGTTCGGATTGGTTATGG 55.4 MsbHLH66 F-AGCAGTAACGGCACGCAGAC 59.5 101.57 0.995 R-GAAATGGGCATGAGGCAGAG 57.4 MsPIF3 F-CAGACTCAGCCGTCAACTCA 57.4 92.93 0.991 R-GCAGGCCCACTTCCACCAAT 59.5 MsPIF1 F-CCACATATTCCTCCATTTGAT 51.7 100.90 0.994 R-GAAGGCTGAGGTAGTGTTGATA 55.8 MsbHLH48 F-CCGTCGAGTCTCCAGTGGTC 61.6 96.92 0.993 R-CGTTTGAAGGGAAGGTAGGG 57.4 MsbHLH23 F-GCAGACAAAGGACCCAAGGA 57.4 93.01 0.993 R-CACGAGGAGTGAGGAACAAGAA 57.7 
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表 2 MsPIF基因家族
Table 2. MsPIF gene family of M. sinostellata
基因名称 蛋白质分子量/Da 氨基酸数/个 等电点 不稳定系数 脂肪系数 平均亲水性 亚细胞定位 磷酸化位点 Ser Thr Tyr MsbHLH68 53 604.79 506 5.18 58.19 77.51 −0.447 细胞核(N) 47 10 1 MsPIF4 57 883.06 527 5.96 56.05 64.57 −0.611 细胞核(N) 40 12 3 MsbHLH1 74 557.30 671 5.52 53.08 79.66 −0.452 细胞核(N) 34 14 6 MsPIF8 50 048.29 456 8.22 42.09 58.29 −0.686 细胞核(N) 36 20 4 MsbHLH66 45 976.46 430 6.79 60.45 69.72 −0.558 细胞核(N) 45 14 1 MsPIF3 78 957.02 735 6.31 67.37 63.80 −0.513 细胞核(N) 74 13 3 MsPIF1 20 314.56 188 5.93 60.78 60.32 −0.341 细胞核(N) 4 2 1 MsbHLH48 40 255.00 366 6.43 59.85 70.90 −0.639 细胞核(N) 40 6 2 MsbHLH23 39 480.07 362 5.82 72.07 70.14 −0.577 细胞核(N) 43 9 2 说明：Ser为丝氨酸，Thr为苏氨酸，Tyr为酪氨酸
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表 3 景宁木兰PIF家族蛋白质的主要MEME基序
Table 3. Major MEME motif sequences in M. sinostellata PIF protein
基序 宽度/个 最佳匹配 Motif1 40 MKALQELIPNSNKTDKASMLDEAIEYLKSLQLQVQMLSM Motif2 21 RGRAAEVHNLSERRRRERINE Motif3 21 MMFPGVQQYMPPMGMGMGMGM Motif4 36 FEQZIVKLMEEDMGSAMQYLQGKGLCLMPIALAAAI Motif5 8 ELLWENGQ Motif6 8 CVPBWBTD
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20200488
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