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梅花Prunus mume是中国十大传统名花，在中国有3 000多年栽培历史，江南地区花期为2月左右[1]。梅花适应性较强，耐高温、较耐低温和干旱。在年均气温为16~23 ℃的地区生长最好，根系不耐−8 ℃以下的低温[2-3]。梅花适栽范围介于自然分布区和历史分布区之间，北界为西藏经四川至甘肃天水，陕西宝鸡、西安，河南洛阳，最后到山东烟台，通过海岸线与自然分布区相接，以长江流域为集中赏梅地带[2, 4]。在华北、东北和西北等北方地区不能露地越冬，在江南地区，春季的极端低温(低于−3 ℃)则会对花(蕾)造成伤害，极大地影响观赏价值。因此，抗寒育种一直是梅花育种的重要方向[4-6]。WRKY转录因子是一类主要存在于植物中的锌指型转录因子，在植物响应生物胁迫与非生物胁迫的过程中起着重要作用。根据WRKY结构域数量和锌指结构特征，WRKY家族可分为3类：I类包含2个WRKY结构域和1个CX4−5CX22−23 HXH (C2H2)型锌指结构；Ⅱ类包含1个WRKY结构域和1个CX4−5CX22−23HXH (C2H2)型锌指结构；Ⅲ类包含1个WRKY结构域和1个CX7CX23HXC (C2HC)型锌指结构[7]。WRKY家族参与了广泛的生物过程，包括种子萌发、植物发育和植物激素信号传递等[8]。研究表明：WRKYs最重要的功能之一是参与防御非生物胁迫[9]，可显著提高小麦Triticicum aestivum[10]、水稻Oryza sativa[11]等的耐寒性和香蕉Musa acuminate[12]、棉花Gossypium hirsutum[13]等的抗旱性。近年来，随着梅花基因组正式公布[14]，关于梅花抗寒和抗旱基因的挖掘和研究逐渐展开，这为深入研究梅花抗寒、抗旱等机制提供了重要的基础。梅花中共鉴定出58个WRKY成员，PmWRKYs在梅花的不同组织(根、茎、叶、花和果实)中有不同程度的表达，其中17个PmWRKYs可能是调控梅花抗寒性的潜在转录因子[15]。本研究以梅花品种‘骨红朱砂’‘Guhong Zhusha’为材料，采用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆获得了2个PmWRKY2转录因子，通过生物信息学分析和同源基因序列比对，检测PmWRKY2基因在不同非生物胁迫下的表达模式，以期为后续开展WRKY转录因子在梅花抗寒和抗旱方面的作用机制研究奠定基础。
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梅花‘骨红朱砂’来自浙江农林大学梅花种质资源圃。采集生长势一致，无病虫害的1年生枝条，插于加入清水的培养瓶中，参照PENG等方法[16]处理，湿度为50%，光周期为16 h/8 h。低温(2 ℃)处理组取样时间为0(ck)、1、2、4、6、12、24、48、72 h。采用200 mmol·L−1的甘露醇溶液模拟干旱处理，取样时间为0(ck)、3、6、12、24、36、48 h。采用100 μmol·L−1脱落酸(ABA)处理，取样时间为0(ck)、3、6、12、24、36、48 h。所有新鲜样品采集后立即用液氮速冻，保存于−80 ℃，3次生物学重复。
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RNA的提取采用购自天津诺禾致源公司的UltraClean Polysaccharide and Phenol Plant RNA Purification Kit，方法参照试剂盒的提取说明书。cDNA的合成根据TAKARA PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time)说明书在冰上进行。
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通过梅花基因组和表达谱数据获得PmWRKY2-1和PmWRKY2-2序列，利用Prime 5.0设计特异性引物(表1)，以‘骨红朱砂’叶片cDNA为模板，利用r-Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经切胶回收试剂盒回收后连接到pMD18-T载体(Takara公司，大连)中，转化大肠埃希菌Escherichia coli DH5α感受态细胞后挑取阳性克隆，经PCR验证后送往杭州有康科技有限公司测序。
表 1 基因克隆及表达所用引物序列
Table 1. Primers used in Gene clone and Quantitative real-time PCR
用途 引物名称 序列(5′→3′) 基因克隆 PmWRKY2-1F ATGGCTGGCATCGATGA PmWRKY2-1R CTACATCTGTGGTCCAAG PmWRKY2-2F ATGGGATTTTTAAGAACC PmWRKY2-2R CTAGTACGATTGATGACTGCTTC 实时荧光定量PCR QPmWRKY2-1F GTCCCCTTATCTGACAATACCTC QPmWRKY2-1R AAAGCGAATGAAGTATTTATGTCCT QPmWRKY2-2F TCCGTTGCTTCCTCCCAATGATGAC QPmWRKY2-2R CAAAATCTATTGGTTGTTGCTCC QPmEF1αS CGGATTCAATGTTAAGAATGTTGC QPmEF1αA AGAACTGGAGCATATCCGTTACC -
采用在线软件BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 进行基因序列比对分析，用ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)在线分析开放阅读框，运用ProtParam 在线软件(http://web.expasy.org/protparam/)预测编码蛋白质的分子量、理论等电点；利用 SOPMA 在线工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)分析PmWRKY2蛋白质的二级结构组成；利用WOLFPSORT在线软件(https://psort.hgc.jp/cgi-bin/runpsort.pl)预测基因的亚细胞定位；利用 DNAMAN 9.0软件对梅花PmWRKY2蛋白质与其他物种WRKY蛋白质进行比对分析；使用ClutsalX-v1.83程序进行多序列比对，然后将比对结果输入到MEGA 6.0软件中，利用邻接法(neighbor-joining, NJ)构建系统发育树，Bootstrap值取1 000次。
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以不同处理的叶片为模板，反转录为cDNA，并进行实时荧光定量PCR。利用Prime 5.0设计PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的特异性引物，以梅花PmEF1α为内参基因。反应体系为SYBR Premix Ex Taq 酶(Takara，大连)10.0 μL，cDNA 2.0 μL，上下游引物(10 μm·L−1)各0.8 μL，双蒸水 6.4 μL，每个样品设置3次重复。反应程序为两步法：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃复性30 s，共40个循环；然后以95 ℃持续5 s，60 ℃持续1 min，95 ℃持续15 s作为溶解曲线分析程序，最后根据
$ {2^{ - \Delta \Delta {C_{\rm{t}}}}} $ 法计算目的基因的相对表达量。 -
利用特异性引物进行PCR扩增，经过连接、转化、测序后获得编码序列(CDS)。测序结果显示：PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的CDS长度分别为2 223和2 220 bp(图1)，编码的氨基酸数目分别为740和739个，蛋白质分子量分别为79.94和80.98 kD，理论等电点分别为5.65和5.82。不稳定系数分别为53.93和53.82，脂肪指数分别为54.18和59.53，预测它们为不稳定蛋白质。总平均亲水系数(GRAVY)分别为−0.774和−0.743，属于亲水性蛋白质。亚细胞定位预测结果显示：PmWRKY2-1和PmWRKY2-2均位于细胞核。
图 1 2个PmWRKY2基因的扩增
Figure 1. PCR amplification of 2 PmWRKY2 genes in P. mume
氨基酸序列比对结果显示(图2)：梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的同源性仅为45.87%，与拟南芥Arabidopsis thaliana的AtWRKY2相似性分别为51.26%和32.07%；其中PmWRKY2-1与欧洲甜樱桃P. avium(XP_021826759.1)、桃P. persica(XP_007206427.1)的WRKY2同源性分别为98.65%，98.78%；PmWRKY2-2与甜李P. dulcis(XP_034218428.1)、桃(XP_007207009.2)的WRKY2同源性分别为98.51%，98.11%，与月季Rosa chinensis(XP_024188041.1)WRKY2同源性为77.97%。进一步分析发现：梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2氨基酸序列与其他植物氨基酸序列一样，均包含2个WRKY结构域和1个CX4−5CX22−23 HXH(C2H2)型锌指结构，属于Group Ⅰ (图3)。
图 2 梅花与其他物种WRKY氨基酸序列的比对
Figure 2. Amino acid sequence of WRKY between P. mume and other species
图 3 PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的WRKY结构域
Figure 3. WRKY domain displays of PmWRKY2-1和PmWRKY2-2
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蛋白质二级结构预测结果显示(图4)：PmWRKY2-1蛋白质的二级结构中包含75.68%的无规则卷曲、10.81%的α螺旋、10.41%的扩展长链和3.11%的β转角结构；PmWRKY2-2蛋白质的二级结构中包含74.02%的无规则卷曲、13.80%的α螺旋、8.80%的扩展长链和3.38%的β转角结构。
图 4 PmWRKY2-1和PmWRKY2-2蛋白质的二级结构
Figure 4. Secondary protein structure of PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2
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利用MEGA 6.0软件构建梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2氨基酸序列的系统进化树(图5)。结果显示：梅花PmWRKY2-1与PmWRKY2-2的相似性较低，但与一些蔷薇科Rosaceae植物的亲缘关系都较近；其中PmWRKY2-1与桃(XP_007206427.1)、欧洲甜樱桃(XP_021826759.1)的WRKY亲缘关系较近，PmWRKY2-2与甜李(XP_034218428.1)、桃(XP_007207009.2)的WRKY氨基酸聚为一类，与麻疯树Jatropha curcas (XP_021629940.1)、酸枣Ziziphus jujube(XP_015875770.1)、蔓花生Arachis duranensis(XP_015962000.1)等SUSIBA2-Like(sugar signaling in barley)基因的氨基酸序列也有一定的相似性。
图 5 梅花与其他物种WRKY氨基酸序列系统进化树分析
Figure 5. Phylogenetic tree analysis of the amino acid sequence of P. mume and other species
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低温和干旱(甘露醇)处理后，PmWRKY2-1和PmWRKY2-2表达均发生显著变化(图6)。在低温处理下，PmWRKY2-1在2 和12 h时表达量最高，分别是对照的5.0和4.4倍，之后呈现下降的趋势；PmWRKY2-2的表达量呈现先上升后下降的趋势，在6 h时达到最大值，是对照的2.4倍。在干旱处理下，PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的表达模式均为先上升后下降的趋势，PmWRKY2-1的表达量在12 h达到最大且为对照的53.9倍，之后便呈现下降的趋势；PmWRKY2-2的表达量在6 h处达到最大，为对照的9.7倍，之后呈现下降趋势。在脱落酸(ABA)处理下，处理48 h前，PmWRKY2-1和PmWRKY2-2均显著下调(P＜0.05)，说明其表达可被ABA抑制。
图 6 非生物和ABA处理下的PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的表达
Figure 6. Expression levels of PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2 under abiotic stress and ABA
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植物在生长发育的过程中会受到多种因素的影响，而低温与干旱是常见的影响植物生长发育、果实品质以及地理分布的非生物胁迫因素，严重时可能会导致植物死亡。植物在长期适应进化的过程中逐渐形成了复杂而高效的应答机制，从分子、生理、细胞和生化等多方面做出适应性调整，以抵御和适应低温、干旱等胁迫。在植物响应低温、干旱胁迫过程中，普遍存在于植物中的WRKY转录因子发挥了重要作用[17]，目前已在拟南芥[7]、番茄Solanum lycopersicum[18]、玉米Zea mays [19]、苹果Malus domestica[20]、水稻[21]等大多数物种中均有报道。
本研究克隆获得的PmWRKY2-1和PmWRKY2-2基因都含有2个WRKY结构域，C端都为C2H2型锌指结构；但2个蛋白质序列的差异较大，相似性仅为45.87%；与一些蔷薇科植物的亲缘关系较近；PmWRKY2-1与拟南芥AtWRKY2的相似性为51.26%，PmWRKY2-2为32.07%。值得一提的是，PmWRKY2-2与麻风树(XP_021629940.1)、酸枣(XP_015875770.1)、蔓花生 (XP_015962000.1)等植物的SUSIBA2-Like氨基酸序列具有一定的相似性，有研究[22]报道SUSIBA2属于WRKY转录因子超家族并参与碳水化合物合成代谢。
罗昌国等[23]发现：低温处理下湖北海棠Malus hupehensis MhWRKY40b基因表达量呈现先上升后下降的趋势；低温处理下黄瓜Cucumis sativus CsWRKY46[24]和水稻OsWRKY76[11]也呈现先上升后下降的表达趋势，与本研究中梅花PmWRKY2-1和PmWRKY2-2基因对低温的响应趋势一致。干旱处理下PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的表达量先显著上升后下降，最高表达量分别上调了约50倍和10倍。ZHU等[25]发现：拟南芥中过表达甘薯Ipomoea batatas IbWRKY2和苦荞[26]Fagopyrum tataricum FtWRKY10能提高转基因植株的抗旱性；ZHANG等[27]发现：吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid)处理白车轴草Trifolium repens，其WRKY2作为干旱响应基因可以提高白车轴草的耐旱性。JIANG等[28]发现：ABI5、ABI3、ABA2和ABA3等ABA途径基因诱导拟南芥2个WRKY2的表达从而介导种子萌发和萌发后的发育停滞。本研究中，ABA处理下，梅花2个PmWRKY2基因的表达都被抑制，预测启动子序列中的PmWRKY2-1和PmWRKY2-2分别含有1个和7个ABA响应元件ABRE，推测这2个基因可能通过ABA调控低温相关基因的表达进而调控梅花的耐寒性，但这些推论还需进一步验证。
Cloning and expression analysis under adversity stress of 2 PmWRKY2 in Prunus mume
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摘要:
目的 低温是影响梅花Prunus mume栽培应用的重要环境因素。WRKY基因是一类主要存在于植物中的转录因子，参与响应非生物胁迫等过程。了解梅花WRKY基因对非生物和脱落酸(ABA)胁迫的响应，对梅花定向育种具有重要的意义。 方法 以梅花‘骨红朱砂’Prunus mume ‘Guhong Zhusha’为材料，通过反转录PCR(RT-PCR)克隆获得了2个WRKY2转录因子，命名为PmWRKY2-1和PmWRKY2-2；采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析PmWRKY2-1和PmWRKY2-2基因在低温和干旱下的表达模式。 结果 PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的编码区长度分别为2 223和2 220 bp，分别编码740和739个氨基酸，包含2个WRKY结构域和C2H2型锌指结构；PmWRKY2-1与PmWRKY2-2亲缘关系较远，但两者与蔷薇科Rosaceae植物欧洲甜樱桃P. avium、桃P. persica、李P. dulcis的亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示：在低温和干旱处理下，PmWRKY2-1与PmWRKY2-2都能被诱导；脱落酸(ABA)处理后，PmWRKY2-1与PmWRKY2-2的表达显著降低。 结论 PmWRKY2-1与PmWRKY2-2可能参与调控梅花低温和干旱响应，并可能受到ABA的调控。图6表1参28 Abstract:Objective Low temperature is a main environmental factor that influences the cultivation and application of Prunus mume whereas WRKY gene is a plant-specific transcription factor which participates in the response to abiotic stress process. This study, with an investigation of how WRKY gene responds to low temperature and drought stress, is aimed to provide guidance for the directional breeding of P. mume. Method With the P. mume ‘Guhong Zhusha’ cDNA template selected as the substance, two WRKY2 genes were cloned by means of RT-PCR, named as PmWRKY2-1and PmWRKY2-2 before their expression patterns were under low temperature and in the condition of drought employing real-time quantitative PCR (qRT-PCR). Result a) PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2, with respective coding area lengths of 2 223 and 2 220 bp, encode 740 and 739 amino acids respectively, both including 2 WRKY domains and a C2H2 zinc finger structure; b) though with a distant genetic relationshp with each other, both PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2 had a close relationship with P. avium, P. persica and P. dulcis; c) according to the results of the real-time quantitative PCR (qRT-PCR), both PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2 could be induced by low temperature and drought treatment And d) the expressions of PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2 were significantly reduced after abscisic acid (ABA) treatment. Conclusion PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2 are likely to participate in the regulation of low temperature and drought response of P. mume, yet might be subject to the regulation by ABA. [Ch, 6 fig. 1 tab. 28 ref.] -
Key words:
- Prunus mume /
- WRKY transcription factor /
- gene cloning /
- expression analysis of genes
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抚育间伐是常用的森林管理措施[1]，因伐除林冠相对密集的部分树木，增加了太阳辐射，改变了森林小气候和土壤微生境，必然影响森林生态系统的养分和生物地球化学循环过程，以及该循环过程的核心环节——土壤微生物活动和酶活性。目前，土壤胞外酶研究更多关注于碳、氮和磷循环相关的降解酶，如碳酶[β-葡糖苷酶(BG)、纤维二糖水解酶(CBH)、β-木糖苷酶(BX)]，氮酶[β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)]和磷酶[酸性或碱性磷酸酶(AcP)]，其活性可作为微生物资源分配的代理指标[2]。在养分循环期间酶活性的相对丰度变化可反映微生物群落的代谢水平。SINSABAUGH等[3]最先通过整合分析发现：在全球尺度上碳、氮和磷循环相关酶计量比接近1∶1∶1，表明土壤酶化学计量比呈稳态性。但也有研究发现：土壤酶化学计量比呈非稳态性[4−6]，说明微生物可能受到能量或关键营养物质(即碳、氮和磷)的限制[7]。
间伐措施对土壤胞外酶活性和酶化学计量的影响仍不确定。如土壤酶活性在森林间伐后会增加[8]、减少[9]或保持不变[10]。大多数研究主要围绕不同间伐强度对酶活性的影响[11]。间伐措施的影响效果还会随森林恢复过程而发生改变。如QIU等[12]对塞罕坝林场内华北落叶松Larix principis-rupprechtii人工林进行间伐恢复9 a后的结果显示：间伐措施显著增加了土壤BG、NAG+LAP和AcP活性。而LULL等[13]对地中海栎Quercus ilex林间伐后5个月至7 a内，氮和磷循环酶的活性并未发生显著改变。间伐处理和林下移除可在短时间内减少微生物对土壤资源的竞争，进而改变酶的活性[14]。但随树木生长速度和土壤养分含量的变化，微生物资源利用策略也发生改变，可能造成微生物受到不同养分的限制[15]。
目前，关于间伐处理对土壤胞外酶活性的研究大多侧重于间伐强度和人工林生态系统的研究，而对天然林生态系统间伐后不同恢复阶段土壤酶活性的研究较少。鉴于此，本研究采用空间代替时间的方法，探讨北亚热带秦岭松栎混交林在抚育间伐后不同恢复时间内林地表层土壤酶活性、酶化学计量比的变化规律，为制定森林可持续经营方案及合理的生态恢复措施提供理论依据。
1. 研究地区与研究方法
1.1 研究区概况
研究区位于陕西省安康市宁东林业局新矿林场(33°20′~33°26′N，108°32′~108°34′E)，地处秦岭山脉，海拔为1 400.0~1 800.0 m。该区属于北亚热带与温带过渡区，年均气温为8.5 ℃，年平均降水量为908.0 mm，土壤为山地棕壤。研究区域为20世纪70年代末采伐后天然更新形成的次生针阔混交林[16]，采取的是低强度间伐和林冠下补植等保护经营作业法。林内主要以油松Pinus tabuliformis、锐齿槲栎Quercus aliena var. acutiserrata、华山松Pinus armandii为主要建群种，伴生有漆树Toxicodendron vernicifluum、小叶女贞Ligustrum quihoui、青榨槭Acer davidii等树种。林下植被以卫矛Euonymus alatus、木姜子Litsea pungens、披针叶薹草Carex lanceolata、龙牙草Agrimonia pilosa、茜草Rubia cordifolia为主。
2021年10月，根据研究区内实际间伐处理、林木生长和分布状况，选择立地条件基本一致的林分，设置3种间伐处理，即未间伐(ck)、间伐恢复5 a (5 a，2018年间伐)和间伐恢复13 a (13 a，2010年间伐)。每个间伐处理设置4块面积为20 m×30 m的样地，共计12块样地。为防止样地之间相互干扰，样方之间的间隔不小于100 m。进行间伐处理后林下物种数量增加，更新了枫杨Pterocarya stenoptera、栗Castanea mollissima、桤木Alnus cremastogyne、灯台树Cornus controversa和胡桃楸Juglans mandshurica等树种。其中各样地内物种丰富度和Shannon-Wiener指数参照刘思泽等[17]的方法计算。样地调查基本概况见表1。
表 1 试验样地基本概况Table 1 Basic survey of test plots间伐后恢
复时间/a海拔/
m株数密度/
(株·hm−2)胸径/
cm郁闭度 物种
丰富度Shannon-Wiener
指数凋落物量/
(t·hm−2·a−1)林内主要树种 ck 1 585.00±61.85 1 420±88 14.60±0.49 0.7 25 2.48 7.01±0.37 油松、锐齿槲栎、华山松、毛樱桃、垂柳、
木姜子、三桠乌药5 1 457.32±13.14 1 208±355 13.80±0.84 0.5 32 2.78 5.69±0.26 锐齿槲栎、栗、油松、白桦、垂柳、
榆树、桤木13 1 757.57±20.17 1 254±207 13.80±1.19 0.6 29 2.68 6.55±0.29 毛樱桃、油松、锐齿槲栎、漆树、水蜡树、
木姜子、灯台树说明：毛樱桃Prunus tomentosa，垂柳Salix babylonica，三桠乌药Lindera obtusiloba，白桦Betula platyphylla，榆树Ulmus pumila，水蜡树Ligustrum obtusifolium。 1.2 采样设计
2023年7月，根据S型取样方法，在ck、5 a、13 a间伐样地内，用直径为3.6 cm的土钻采集0~10 cm的表层土样，为避免样品受到污染，将土壤混合储存于灭菌自封袋中，再用便携冷藏箱带回实验室。在室内充分混匀后过2 mm筛。一份新鲜土样于4 ℃冰箱保存，用于有效氮、土壤酶活性和土壤微生物生物量的测定；另一份土壤样品自然风干，用于其他土壤理化性质的测定。
1.3 测定指标及方法
1.3.1 土壤理化性质测定
土壤含水率采用105 ℃烘干法；土壤pH采用电位法(土水体积质量比为1.0∶2.5)；土壤总氮采用元素分析仪测定；土壤有机碳采用重铬酸钾氧化-外加热法；土壤有效氮指铵态氮和硝态氮的总和，分别采用2 mol·L−1氯化钾浸提-靛酚蓝比色法、氯化钾提取-双波长紫外分光光度法测定；土壤总磷采用硫酸-高氯酸-钼锑抗比色法[18]。微生物生物量碳、氮采用氯仿熏蒸法，使用岛津总有机碳分析仪测定。
1.3.2 土壤胞外酶活性及酶计量的测定与计算
参照SAIYA-CORK等[19]的方法，测定与碳、氮、磷循环密切相关的酶活性，各种土壤酶的名称、简称及底物见表2。其中，水解酶(BG、BX、CBH、NAG、LAP、AcP)活性采用微孔板荧光法，用多功能酶标仪在365 nm波长处激发，450 nm波长处荧光测定；氧化酶(POX、PER)活性采用DOPA-紫外分光光度法，用多功能酶标仪在450 nm波长处测定。
表 2 土壤胞外酶的简称及所用底物Table 2 Soil enzyme along with their enzyme abbreviation and substrate of soil enzyme酶名称 简称 底物 β-葡糖苷酶β-glucosidase BG 4-MUB-β-D-glucoside β-木糖苷酶β-xalosidase BX 4-MUB-β-D-xylopyranoside 纤维二糖水解酶Cellobiohydrolase CBH 4-MUB-β-D-cellobioside β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶β-N-acetylglucosaminidase NAG 4-MUB-N-acetyl-β-D-glucosaminde 亮氨酸氨基肽酶Leucine aminopeptidase LAP L-leucine-7-amido-4 methylcounarin 酸性磷酸酶Acid phosphatase AcP 4-MUB-phosphatase 酚氧化物酶Phenol oxidase POX L-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA) 过氧化物酶Peroxidase PER L-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA) and H2O2 说明：MUB为甲基伞形酮酰Methylumbelliferyl。 通过计算碳、氮和磷酶活性的比值研究土壤胞外酶化学计量[20]，同时，采用酶计量的载体分析，即用矢量长度(VL)及矢量角(VA)分析间伐处理对微生物能量和营养的相对限制状况[21]，计算公式如下。
$$ {E}_\text{C/N}\text{}\text=\text{}\text{ln}{H}_{\mathrm{B}\mathrm{G}}\text{/ln}\text{(}{H}_{\text{NAG}}\text+{H}_{\text{LAP}}\text{)}\text{;}\text{}\text{}\text{} $$ (1) $$ {E}_\text{C/P}\text{}\text=\text{}\text{ln}{H}_{\text{BG}}\text{/ln}{H}_{{\mathrm{Ac}}\mathrm{P}};\text{}\text{}\text{}\text{}\text{}$$ (2) $$ {E}_\text{N/P}\text{= ln}\text{(}{H}_{\text{NAG}}\text+{H}_{\text{LAP}}\text{)}\text{/ln}{H}_{{\mathrm{Ac}}\mathrm{P}}; $$ (3) $$ {V}_{\text{L}}\text=\text{SQRT}\text{[}\text{(}{E}_\text{C/N}\text{)}^2\text+\text{(}{E}_\text{C/P}\text{)}^2\text{]}\text{;} $$ (4) $$ {V}_{\text{A}}\text=\text{Degrees}\text{[}\text{ATAN2}\text{(}{E}_\text{C/P}\text{,}\text{}{E}_\text{C/N}\text{)}\text{]}\text{。}$$ (5) 式(1)~(5)中：$ {E}_\text{C/N} $、$ {E}_\text{C/P} $、$ {E}_\text{N/P} $分别为土壤碳获取酶/氮获取酶比值、土壤碳获取酶/磷获取酶比值、土壤氮获取酶/磷获取酶比值；$ {H}_{\mathrm{B}\mathrm{G}}\mathrm{、}{H}_{\text{NAG}}\mathrm{、}{H}_{\text{LAP}}\mathrm{、}{H}_{{\mathrm{Ac}}\mathrm{P}} $分别为BG、NAG、LAP、AcP的酶活性；SQRT为平方根函数，Degrees为角度转换函数，ATAN2为反正切函数。VL越大，表明碳限制越严重。VA以45°为分界线，＞45°为磷限制，＜45°为氮限制。偏离程度越大，限制程度越强。
1.4 数据分析
使用SPSS 25.0对不同间伐恢复时间下的土壤理化性质、胞外酶活性、酶化学计量比、酶矢量长度和角度的差异进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和最小显著性差异法(LSD)(P＜0.05)；利用Sperman检验分析与土壤酶活性和酶矢量变化显著相关的土壤因子，利用Origin 2021绘图。以酶活性及其矢量作为物种因子，土壤理化性质作为环境因子，利用Canoco 5.0进行冗余分析。通过方差膨胀因子(VIF)判断解释变量之间的线性关系，剔除共线性较强(VIF＞5)的变量，对剩余的pH、有效氮、有机碳和全磷共4个变量进行研究。
2. 结果与分析
2.1 间伐恢复对土壤理化性质的影响
从表3可见：间伐恢复对土壤pH、有效氮、全磷、碳氮比、氮磷比、有机碳、微生物量碳、微生物量氮和微生物量碳氮比均有显著影响(P＜0.05)。恢复5 a的土壤pH显著高于ck (P＜0.05)。恢复13 a的土壤全磷、微生物量碳和微生物量氮均显著高于ck (P＜0.05)，分别是ck的1.28、1.19和1.15倍。土壤有效氮、碳氮比和氮磷比均显著低于ck (P＜0.05)。恢复5 a的土壤有机碳显著降低了25.93% (P＜0.05)，但恢复13 a的土壤有机碳质量分数逐渐恢复至未间伐前水平。间伐恢复对土壤含水率和全氮无显著影响。
表 3 不同间伐恢复时间下土壤理化特性状况Table 3 Soil physical and chemical properties under different thinning treatments间伐后恢复时间/a pH 含水率/% 有效氮/(mg·kg−1) 全氮/(g·kg−1) 全磷/(g·kg−1) 碳氮比 ck 5.48±0.10 b 37.28±4.01 a 21.34±1.96 a 4.58±0.86 a 0.60±0.08 b 10.02±1.16 a 5 5.98±0.13 a 35.10±6.81 a 17.19±0.48 ab 3.28±0.68 a 0.52±0.10 b 9.34±1.41 ab 13 5.76±0.17 ab 40.37±1.67 a 16.56±0.58 b 3.93±0.44 a 0.77±0.07 a 8.55±1.32 b 间伐后恢复时间/a 氮磷比 有机碳/(g·kg−1) 微生物量碳/(g·kg−1) 微生物量氮/(g·kg−1) 微生物量碳氮比 ck 7.49±0.71 a 35.94±3.84 a 1.14±0.04 b 0.20±0.01 b 5.97±0.37 ab 5 6.45±0.95 ab 26.62±2.79 b 1.14±0.09 b 0.22±0.01 ab 5.09±0.13 b 13 5.04±0.34 b 33.33±2.27 ab 1.36±0.02 a 0.23±0.01 a 6.11±0.33 a 说明：数据均为平均值±标准误。不同小写字母表示不同处理间差异显著 (P＜0.05)。 2.2 间伐恢复对土壤酶活性及胞外酶计量比的影响
从图1可见：间伐恢复对不同土壤酶活性的影响并不一致。恢复13 a时土壤BX、AcP和NAG+LAP活性显著下降(P＜0.05)，较ck分别降低了25.39%、22.92%和46.25%，同时土壤BG活性还显著提高(P＜0.05)，是ck的1.34倍(P＜0.05)。土壤氧化酶(POX、PER)和CBH活性变化趋势与前4种酶不同，在恢复5 a时活性最低，在恢复13 a时活性最高。
通过矢量分析发现：VA＞45°，且EN/P＜1、EC/N＞1 (图2A)，表明研究区土壤微生物生长代谢主要受碳和磷共同限制。森林土壤EC/P和EN/P显著偏离1，且随间伐后时间的持续而逐渐恢复或显著增大(P＜0.05，图2B)。VA和VL在3个间伐恢复间均有明显差异(图2C~D)。与ck相比，间伐恢复5 a的VA显著降低了4.42%，13 a的VL是ck的1.13倍(P＜0.05)。表明间伐措施在恢复初期能够缓解土壤微生物受磷限制的状况，而后随恢复时间的持续，微生物受碳限制程度显著增加(P＜0.05)。
图 2 间伐恢复对土壤酶化学计量及酶矢量的影响Figure 2 Effects of thinning treatment on soil enzyme stoichiometry and enzyme vector2.3 土壤酶整体变化和土壤理化性质的相关性分析及冗余分析
相关性分析(表4)表明：水解酶活性与有效氮、有机碳和微生物量碳氮比均呈正相关关系。其中土壤碳获取酶(BG、CBH)与土壤全磷、有机碳、微生物量碳呈显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)正相关，BX活性与土壤有效氮、微生物量碳氮比呈显著正相关(P＜0.05)。土壤氮获取酶(NAG+LAP)和磷获取酶(AcP)均与土壤有效氮呈极显著正相关(P＜0.01)。酚氧化物酶(PER)除与pH呈显著负相关外(P＜0.05)，还与有机碳、微生物量碳氮比呈极显著正相关(P＜0.01)。VA仅与pH呈极显著负相关(P＜0.01)。VL与全磷和微生物量碳呈显著正相关外(P＜0.05)，还与氮磷比呈极显著负相关(P＜0.01)。
表 4 土壤酶变化与土壤理化性质的相关性分析Table 4 Correlation analysis between soil enzyme changes and soil physical and chemical properties指标 pH IN TP SOC MBC MBC/MBN N/P POX −0.54 −0.29 −0.04 −0.07 0.26 0.30 −0.04 PER −0.65* 0.19 0.32 0.45* 0.22 0.52** 0.21 BG 0.28 0.35 0.73** 0.55** 0.63** 0.38 −0.25 BX −0.53 0.54** −0.01 0.27 0.10 0.45* 0.56 CBH −0.01 0.24 0.46* 0.43* 0.53** 0.65** 0.17 AcP −0.72* 0.57** −0.38 0.06 −0.13 0.22 0.85** NAG+LAP 0.17 0.66** −0.08 0.14 −0.01 0.00 0.60 VA −0.95** 0.01 −0.30 −0.06 −0.04 0.35 0.43 VL 0.45 −0.28 0.70** 0.31 0.48* 0.15 −0.63* 说明：IN为土壤有效氮，TP为土壤全磷，SOC为土壤有机碳，MBC为微生物量碳，MBN为微生物量氮，N/P为氮磷比。POX为酚氧化物酶，PER为过氧化物酶，BG为β-葡糖苷酶，BX为β-木糖苷酶，CBH为纤维二糖水解酶，AcP为酸性磷酸酶，NAG+LAP为氮获取酶(β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和亮氨酸氨基肽酶总和)，VA为酶矢量角度，VL为酶矢量长度。*表示显著相关(P＜0.05)，**表示极显著相关(P＜0.01)。 冗余分析(图3)表明：剔除存在共线性关系的变量后，pH、有效氮、有机碳和全磷共解释了酶活性和酶矢量变异的73.71%。其中pH和有机碳是对土壤酶整体变化解释度最高的因子，分别解释了变量的48.80%和13.10%，且pH与酶指标变化显著相关(P＜0.05)。
图 3 土壤酶活性与理化性质关系的冗余分析Figure 3 Redundancy analysis of soil enzyme activity and physical and chemical properties3. 讨论
3.1 间伐恢复年限对土壤理化性质及微生物生物量的影响
间伐改变了秦岭松栎混交林表层土壤pH和养分质量分数，但在不同恢复阶段规律不一致。在本研究中，间伐导致pH提高，尤其是间伐恢复5 a后，这与许多学者的研究结果一致。如对云杉Picea crassifolia[22]林和火炬松Pinus taeda[23]林研究表明：间伐减少了针叶凋落物作为有机酸主要输入组分的产生，从而显著提高土壤表层pH。本研究中针叶树种的胸高断面积占比在间伐后有所降低，这在一定程度上能缓解土壤酸化。同时，间伐后土壤含水率、全氮、全磷和有机碳质量分数均呈先减少后逐步恢复的趋势。这可能是因为间伐短期内树冠层郁闭度减小，导致土壤蒸发增强的同时，也促进林下植被的快速生长，加快了土壤水分的消耗[24]。凋落物作为土壤最主要的有机碳源，通过微生物转化为腐殖质的同时也改变了土壤pH，影响凋落物的分解，改变土壤养分水平[25]。相较于ck，间伐恢复5、13 a后，凋落物量分别恢复至81.16%和93.41%，间伐恢复13 a的土壤全氮、全磷和有机碳质量分数有所提高，表明随时间的持续，林分结构及相关生态过程在一定程度上得到恢复。此外，本研究中微生物量碳、氮和土壤有效氮在间伐恢复13 a后的变化趋势不一致，可能因为间伐后林地内出现了栗、桤木和水蜡树等阳性植物，以及毛樱桃、白桦和漆树等阔叶树种，林地内相对多度增加，根系密度和根系分泌物增多，有利于土壤微生物生物量的积累[26]。而林下喜光物种的快速生长[27]，对土壤游离态氮的需求增大，导致土壤有效氮质量分数有所降低。这与周璇等[28]对8年生柳杉Cryptomeria japonica人工林进行间伐后的研究结果一致。
3.2 间伐恢复年限对土壤酶活性的影响
在本研究中，间伐恢复年限导致土壤BX、AcP和NAG+LAP活性显著降低，但对其他土壤酶活性影响趋势不同，如POX、PER、BG和CBH通常在间伐恢复5 a时活性最低，在13 a时恢复到间伐前水平或高于未间伐处理(如BG)。这与其他研究结果相似，但并不完全一致[29−30]。这种结果可能是由于不同的林分环境以及微生物利用资源多寡的差异，导致土壤酶活性对同一干扰方式的不同改变[31]。随着间伐恢复时间的持续，易分解有机物质减少而难降解的碳相对较多[32]，POX、PER和BG、CBH作为土壤中主要的木质素降解酶和纤维素降解酶，其活性得到显著提高，以增强微生物利用顽固性有机碳的能力。这与MEISAM等[33]的研究结果一致。而以分解几丁质和蛋白质、半纤维素等易分解物质为主的NAG+LAP、BX活性的显著降低也映证了SINSABAUGH等[34]的资源分配理论。
土壤胞外酶与土壤养分输入和微生物量等密切相关[35]。通过相关分析发现：BG和CBH活性与微生物量碳、全磷显著正相关，表明土壤微生物数量的变化与碳循环土壤酶活性的变化关系最为密切，而全磷则是磷素限制环境中影响微生物生长的主要因素[7, 16]。有效氮质量分数的减少虽然在一定程度上能促使氮获取酶的产生，但同样也会降低土壤微生物的活性和限制酶促反应底物供应，从而减少部分酶的释放[36]，这与孙鹏跃等[37]的研究结果一致。冗余分析发现：土壤pH也是影响土壤酶活性的主要因素，并与部分酶变化表现出负相关关系，这与多数研究结果是一致的[3]。有研究表明：大多数土壤酶在特定的pH范围(最适值在4.0~5.5)内表现出最大的活性和稳定性，当pH超过这个范围时，酶活性会降低[38]。
3.3 间伐恢复年限对酶化学计量比和微生物养分限制的影响
本研究中所有处理的土壤酶矢量角度均＞45°，符合亚热带地区森林土壤微生物更受磷素限制的理论[39]。同时参与土壤碳、氮和磷循环相关酶计量比偏离了表层土壤中接近1∶1∶1的平均水平[3]，也在一定程度上反映了秦岭区域松栎混交林间伐恢复过程中微生物受碳和磷的共同限制，这与薛悦等[40]对安康市火池塘林区撂荒地恢复过程的研究结果相一致。与未间伐样地相比，间伐后恢复5 a时显著降低的酶矢量角度表征了微生物受到的磷限制减弱，随时间进程减弱效应逐渐消失，林内物种丰富度的提高和凋落物量的增加，促使土壤微生物分泌更多碳获取酶(如BG)来降解有机质，释放磷以供给微生物活动，以缓解磷限制，这些过程都会导致微生物碳限制的进一步增加。相关性分析结果中，酶矢量长度与微生物量碳呈显著正相关，证实了微生物需要更多的碳源来满足代谢活动所耗的能量，这与CUI等[41]的研究结果相似。
4. 结论
间伐改变了松栎混交林区域内的年凋落物总量及针叶与阔叶的凋落量比例，同时改变了林内物种丰富度和林分郁闭度，从而影响了土壤基本理化性质。抚育间伐在一定程度上能够缓解土壤微生物受磷限制的状况，但随恢复时间持续，林内凋落物量逐渐增加使土壤微生物受碳限制更为严重。
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图 2 梅花与其他物种WRKY氨基酸序列的比对
Figure 2 Amino acid sequence of WRKY between P. mume and other species
图 4 PmWRKY2-1和PmWRKY2-2蛋白质的二级结构
Figure 4 Secondary protein structure of PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2
图 5 梅花与其他物种WRKY氨基酸序列系统进化树分析
Figure 5 Phylogenetic tree analysis of the amino acid sequence of P. mume and other species
图 6 非生物和ABA处理下的PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的表达
Figure 6 Expression levels of PmWRKY2-1 and PmWRKY2-2 under abiotic stress and ABA
表 1 基因克隆及表达所用引物序列
Table 1. Primers used in Gene clone and Quantitative real-time PCR
用途 引物名称 序列(5′→3′) 基因克隆 PmWRKY2-1F ATGGCTGGCATCGATGA PmWRKY2-1R CTACATCTGTGGTCCAAG PmWRKY2-2F ATGGGATTTTTAAGAACC PmWRKY2-2R CTAGTACGATTGATGACTGCTTC 实时荧光定量PCR QPmWRKY2-1F GTCCCCTTATCTGACAATACCTC QPmWRKY2-1R AAAGCGAATGAAGTATTTATGTCCT QPmWRKY2-2F TCCGTTGCTTCCTCCCAATGATGAC QPmWRKY2-2R CAAAATCTATTGGTTGTTGCTCC QPmEF1αS CGGATTCAATGTTAAGAATGTTGC QPmEF1αA AGAACTGGAGCATATCCGTTACC 
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