下载:
-
CONSTANS-like是植物中保守的一类锌指蛋白转录因子，N端含有1个或2个由2个半胱氨酸组成C-X2-C-X16-C-X2-C(C为半胱氨酸，X为可变氨基酸)介导蛋白互作的B-box结构域[1]，C端包含1个由43个氨基酸组成参与蛋白核定位的CCT(CONSTANS、CONSTANS-like、TOC1)结构域[2-3]。CO/CO-like(COL)基因家族已在多个物种中进行了报道，拟南芥Arabidopsis thaliana中鉴定到17个CONSTANS-like成员[2]，水稻Oryza sativa中有17个[4]，甜菜Beta vulgaris中有13个[5]，大麦Hordeum vulgare中有9个[4]，甘蓝型油菜Brassica napus中有4个[6]，小麦Triticum aestivum中有3个[7]，挪威云杉Picea abies中含有2个COL成员[8]。
研究表明：COL基因具有功能多样性，特别是在光响应介导的开花和生长调控方面[2, 4-5, 9] 。CO基因的表达和蛋白稳定受生物钟和光周期调节；长日照条件下，CO与FLOWERING LOCUS T (FT)启动子结合，诱导FT基因表达，促进拟南芥提前开花[10-11]，CO通过调节TERMINAL FLOWER 1 (TFL1)的表达，抑制FT诱导开花[12]。AtCOL9通过抑制CO基因表达，减缓FT转录，延迟开花[13]。在水稻中，超表达OsCOL15通过上调开花抑制因子Ghd7 (grain number, plant height and heading date 7)，下调激活因子RID1 (rice indeterminate 1)、Ehd1 (early heading date 1)、Hd3a (heading date 3a)、FLT1 (FLOWERING LOCUS T1)，导致开花延迟[14]。在长日照条件下，过表达甘菊Chrysanthemum lavandulifolium 的 ClCOL5诱导转基因拟南芥提前开花[15]。大部分PheCOLs在毛竹Phyllostachys edulis叶片中表达量最高，具有显著的光周期响应模式[16]；在早竹Ph. violascens中，PvCO1和PvCO2主要在叶片中表达[17]。毛果杨Populus trichocarpa的PtCOLs优先在叶片中表达[18]；银杏Ginkgo biloba中GbCO基因主要在叶片和茎尖表达[19]。超表达PhCOL16提高转基因矮牵牛Petunia corollas叶绿素含量，正调控叶绿素生物合成[20]。COL不仅参与开花调控，在植物发育和逆境胁迫中也发挥重要作用。AtCOL4提高转基因植株盐和脱落酸 (abscisic acid, ABA)耐受性[21]，AtCOL7促进拟南芥侧枝形成和下胚轴伸长[22]。
杜仲Eucommia ulmoides是单科、单属、单种植物，雌雄异株，广泛分布于陕西、河南、四川、贵州、云南等地，是中国特有的经济树种。因杜仲树皮、根、叶、花和果实中均含有大量的白色丝状杜仲橡胶，被誉为优质的天然橡胶树种[23]。COL蛋白在植物生长发育的多个方面发挥重要作用，具有重要的药用价值和橡胶用价值。杜仲COL基因家族系统进化及其在杜仲叶片生长发育和杜仲胶形成中的表达模式尚未报道。本研究以杜仲基因组数据为基础，利用生物信息学分析方法，对杜仲CONSTANS-like基因家族进行全基因组鉴定、理化性质和系统进化分析，初步鉴定EuCOLs基因在杜仲叶片生长发育及杜仲胶生物合成中的功能，为进一步探索EuCOLs基因的功能提供理论依据。
-
杜仲种植于西北农林科技大学苗圃(陕西杨凌)。取生长正常，长势一致的2年生‘秦仲1号’‘Qinzhong 1’杜仲幼苗的叶芽(茎尖)、生长叶(3 cm长叶片)、幼叶(完全展开的新叶)、老叶(完全展开60 d叶片)；取同一生长条件，与‘秦仲1号’相同发育时期的‘紫叶’杜仲E. ulmoides ‘Ziye’叶片，经液氮处理后冻存于−80 ℃冰箱，用于RNA提取。
-
从杜仲基因组数据库Genome Warehouse (
https://bigd.big.ac./gwh/Assembly/13/show )中下载COL蛋白候选序列，利用美国国家生物信息中心(NCBI)保守结构域搜索服务(CD Search)分析蛋白结构域，保留含有完整B-box和CCT结构域序列。通过在线软件ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/ )分析蛋白理化性质，使用Plant-mPLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/ )预测EuCOLs蛋白亚细胞定位，利用在线工具ExPASY (https://www.expasy.org/tools )分析EuCOLs氨基酸数量、分子量、理论等电点，通过Expasy (https://web.expasy.org/protscale/ )软件分析蛋白的亲疏水性，利用SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html )软件预测蛋白的二级结构。 -
通过杜仲基因组数据库，查找EuCOLs基因在scaffolds上的位置以及scaffolds长度，使用DNAMAN软件进行EuCOLs蛋白序列比对，通过Clustal X1.83软件对杜仲、水稻、拟南芥、毛果杨和玉米Zea mays的COLs蛋白进行多序列比对，利用MEGA 6.0的邻接法(neighbor-joining)，重复次数设置为1 000次[24]，构建系统发育树。
-
利用GSDS (
http://gsds.gao-lab.org/index.php )软件分析EuCOLs基因结构，通过MEME (http://meme-suite.org/ )对EuCOLs进行基序分析(参数是：any number of Repetitions (anr)，maximum number of Motifs= 20，minimum width≥6，and maximum width≤50)。通过Clustal X 1.83比对和DNAsp5软件分析EuCOLs同源基因对，并计算非同义替换率(non-synonymous substitution rate, Ka)和同义替换率(synonymous substitution rate, Ks)。杜仲同源基因复制和分离的时间(t)由公式t=Ks/1.3×10−8计算[16]。利用Plant CARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htmL/ )软件对EuCOLs基因启动子(ATG)上游2 000 bp序列进行查找分离，进行启动子顺式作用元件分析。 -
从NCBI的Short Read Arshive (SRA)数据库中下载‘秦仲1号’不同发育时期叶片(叶芽、初生叶、幼叶、老叶，版本号：SRP218063)[25]及不同胶含量杜仲品种(高产胶杜仲品种‘秦仲2号’‘Qinzhong 2’、低产胶杜仲品种‘小叶’‘Xiaoye’含量，版本号：SRP158357)[26]的转录组数据，利用1百万个映射上的碱基中映射到外显子的1千个碱基上的碱基个数(fragments per kilobase million，FPKM)值表示EuCOLs基因相对表达丰度(A)，对该数值取对数(Log2A)进行统计分析，通过TBtools工具绘制基因表达图谱[27]。
利用Trizol (天根DP424)试剂提取‘紫叶’杜仲的叶芽(茎尖)、生长叶(3 cm长叶片)、嫩叶(完全展开的新叶)总RNA，反转录合成cDNA，利用Quant Studio 6 (Life Technologies公司，新加坡)，All-in-One SYBR Premix EX TaqTM kit (Gene Copoeia公司，美国)进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)反应，10.0 μL反应体系: 2×mix 5.0 μL、正向引物/反向引物各0.25 μL、cDNA 2.0 μL、ddH2O 2.5 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，45个循环。内参基因为UBC E2[28]，使用
$2^{-\Delta\Delta{{C}}_{\rm{t}}} $ 法对3次生物学重复的数据进行分析。 -
利用STRING软件(
https://string-db.org/ )，选择拟南芥数据库进行序列比对，根据已知拟南芥COLs蛋白互作关系，预测EuCOL7互作蛋白，通过Cytoscape 3.7.0软件进行评估和预测[16]。 -
通过Genome Warehouse数据库，从杜仲基因组中共查找到8个EuCOLs基因，利用Pfam和NCBI的Conserved Domain Search软件，验证EuCOLs蛋白保守结构域。结果显示：8个EuCOLs蛋白均含有B-box和CCT结构域，分别命名为EuCOL1~EuCOL8。通过ExPASy工具，对EuCOL家族成员进行理化性质分析，EuCOL3蛋白序列最长，编码469个氨基酸，EuCOL7序列最短，编码315个氨基酸，分子量分布区域为35.21~52.65 kDa，等电点范围是5.10 (EuCOL1)~6.47 (EuCOL6)，亚细胞定位预测结果显示：EuCOLs均定位在细胞核中(表1)，属于疏水性蛋白，8个EuCOLs分布于8条scaffolds。
表 1 杜仲CO-like蛋白序列特征及亚细胞定位预测
Table 1. Sequence characteristics and predicted subcellular location of E. ulmoides CO-like proteins
基因ID 基因名 染色体定位 位置/bp CDS长度/bp 蛋白质序列/个 分子量/kDa 等电点 亚细胞定位 EUC17024-RA EuCOL1 Super-Scaffold_183 1 758 965~1 761 661 1 128 375 41.70 5.10 细胞核 EUC14665-RA EuCOL2 Super-Scaffold_127 1 395 219~1 398 047 1 287 428 47.26 5.25 细胞核 EUC14912-RA EuCOL3 Super-Scaffold_121 1 876 239~1 890 694 1 410 469 52.65 5.95 细胞核 EUC04726-RA EuCOL4 Super-Scaffold_3 2 229 604~2 240 203 1 155 384 42.06 5.85 细胞核 EUC01228-RA EuCOL5 scaffold416_obj 336 319~340 482 1 038 345 39.01 6.47 细胞核 EUC13984-RA EuCOL6 scaffold20_obj 133 259~134 581 972 323 35.50 5.52 细胞核 EUC15205-RA EuCOL7 Super-Scaffold_275 13 124~15 540 948 315 35.21 5.59 细胞核 EUC06371-RA EuCOL8 Super-Scaffold_162 322 024~324 298 1 347 448 49.49 5.71 细胞核 -
为了分析杜仲EuCOL基因家族的进化关系，将8个EuCOLs蛋白与17个拟南芥AtCOLs、水稻OsCOLs、ZmCOLs和14个毛果杨PtCOLs[18]导入MEGA 6.0软件，通过邻接法构建系统发育树，73个COLs蛋白分为3个亚家族(分别是群组 Ⅰ、群组 Ⅱ和群组 Ⅲ)(图1)。群组Ⅰ亚家族包含2个B-box和1个CCT结构域，由28个COLs蛋白组成，包含2个EuCOLs蛋白(EuCOL6和EuCOL7)；群组Ⅱ亚家族含有1个B-box、1个CCT和1个分化的锌指结构域，所含COLs蛋白数量最少，有15个COLs蛋白，分别含有4个AtCOLs，3个PtCOLs蛋白和OsCOLs蛋白，5个ZmCOLs蛋白，不含EuCOLs蛋白；群组Ⅲ亚家族由1个B-box和1个CCT结构域组成，所含蛋白数量最多，包含30个COLs蛋白，有6个EuCOLs蛋白，进化关系显示杜仲与毛果杨亲缘关系最近。
图 1 杜仲、水稻、拟南芥、毛果杨和玉米CO-likes蛋白系统进化树
Figure 1. Phylogenetic tree of CO-like proteins from E. ulmoides, O. sativa, A. thaliana, P. trichocarpa and Z. mays
-
为了进一步分析EuCOLs基因的保守性和多样性，对EuCOLs基因结构及蛋白基序进行了分析，结果显示：EuCOLs基因结构较为简单(图2)，EuCOL1和EuCOL6分别含有2个和3个外显子，4个EuCOLs基因含有4个外显子，EuCOL2和EuCOL3外显子数目最多，含有6个外显子。
图 2 杜仲COLs基因结构分析
Figure 2. Structural analysis of COLs in E. ulmoides
利用MEME在线软件，对EuCOLs家族进行保守基序分析，基序鉴定个数设置为20，分别命名为motif 1~motif 20。结果如图3所示：motif 1和motif 2为EuCOLs蛋白的特征性结构域，存在于所有EuCOLs蛋白中。只有EuCOL7含有1个B-box结构域，其余EuCOLs蛋白均由2个B-box组成，这与图2蛋白序列比对结果一致。同一亚家族EuCOLs基序具有高度相似性，其中motif 1包含1个典型的由C-X2-C-X16-C-X2-C编码的GATA锌指结构域。不同亚家族基序存在显著差异，例如：motif 7和motif 14只存在于群组Ⅲ亚家族，motif 12只在群组Ⅱ亚家族中存在。EuCOLs蛋白之间基序也有差异，只有EuCOL1和EuCOL4含有motif 5、motif 7和motif 9，motif 10仅存在于EuCOL2，推测基因功能差异可能与基序有关。
图 3 EuCOLs蛋白保守基序分析
Figure 3. Conservative motif analysis of EuCOL proteins
-
利用Plant CARE软件对EuCOLs起始密码子(ATG)上游2 000 bp序列进行顺式作用元件分析(图4)。EuCOLs启动子中不仅包含基本顺式作用元件，还存在3种类型元件。①胁迫响应元件，如干旱胁迫响应元件MBS；低温响应元件LTR；厌氧胁迫相关元件ARE等。②光响应元件，如Box 4、G-box、G-Box、GT1-motif、I-box、GATA-motif、TCCC-motif等。③激素响应元件，如赤霉素响应元件ABRE；生长素响应元件AuxRR-core；水杨酸响应元件CGTCA-motif等。推测EuCOLs可能参与杜仲生长发育、胁迫响应以及光周期调控。EuCOLs基因中光响应元件数量最多，共79个，包含18个Box 4，G-box和GT1-motif均有12个，暗示EuCOLs基因的转录可能受光周期调控。EuCOLs启动子区域含有16个ABRE和14个ARE元件(图4B)，推测EuCOLs可能参与ABA调节和厌氧调控。
图 4 EuCOLs启动子顺式作用元件分布
Figure 4. Cis-elements distributed in the promoters of EuCOLs
-
为了探索EuCOLs基因在杜仲叶片发育中的功能，利用杜仲叶片不同发育时期的转录组数据，进行表达模式分析。图5显示：EuCOLs在杜仲叶片发育中转录水平较低，大部分基因FPKM值小于1，EuCOL6在杜仲叶片中不表达，暗示EuCOLs在杜仲叶片中发挥作用较小，EuCOL5在叶片中的转录水平相对较高，并且随着叶片发育，转录水平逐渐升高，推测EuCOL5在杜仲叶片中可能发挥正调控作用。
图 5 EuCOLs基因在杜仲叶片不同发育时期表达模式
Figure 5. Expression patterns of EuCOLs genes at different development stages of E. ulmoides leaves
利用高产胶杜仲品种‘秦仲2号’和低产胶杜仲品种‘小叶’成熟叶片转录组数据，检测EuCOLs基因的表达水平，结果如图6所示。大部分EuCOLs转录水平较低，只有EuCOL5和EuCOL7的表达量较高，EuCOL7在各样品中的FPKM值大于150，并且高胶含量叶片中的转录水平高于低胶含量叶片，推测EuCOL7在杜仲胶形成过程中发挥正调控作用，相反EuCOL5在‘小叶’中的转录水平高于‘秦仲2号’，暗示EuCOL5在杜仲胶形成中可能发挥负调控作用。
图 6 EuCOLs基因在杜仲胶形成中的表达模式
Figure 6. Expression pattern of EuCOL genes in the formation of eu-rubber
为了验证EuCOLs基因在杜仲叶片发育中的表达模式 ，以‘紫叶’杜仲不同发育阶段的叶片为材料，通过qRT-PCR检测EuCOLs基因的表达水平。结果显示：EuCOLs在杜仲叶片中差异表达(图7)，EuCOL1和EuCOL4在叶芽中表达量最高，随着叶片发育，表达水平逐渐降低，嫩叶中降为最低，暗示EuCOL1和EuCOL4在杜仲叶片发育的起始阶段发挥重要作用；相反EuCOL7随着叶片发育转录水平逐渐升高，嫩叶中的表达量是叶芽中的5.8倍，推测EuCOL7在杜仲成熟叶片中扮演重要角色。5个EuCOLs基因(EuCOL2、EuCOL3、EuCOL5、EuCOL6和EuCOL8)在幼叶中表达量最高，在叶片发育中，呈现先升高后降低的表达趋势。
图 7 杜仲COL家族基因在叶片发育中的表达模式
Figure 7. Expression patterns of E. ulmoides COL family genes during leaf development
-
表达模式分析显示：EuCOL7在杜仲叶片发育和杜仲胶形成中均具有较高表达量，暗示EuCOL7在叶片发育和杜仲胶形成中发挥重要作用。利用STRING软件，预测EuCOL7与其他蛋白质的互作关系。结果显示：EuCOL7可以与10个蛋白质发生相互作用(图8)，其中3个属于BBX蛋白质家族，LHY、CCA和JAC家族各有1个，7个蛋白质(LNK2、LHY、CCA、RVE、COL、BBX25和BBX19)参与光周期响应。
图 8 EuCOL7蛋白互作网络预测
Figure 8. Prediction of interaction network between EuCOL7
-
杜仲具有重要的经济价值、药用价值和生态价值，广泛分布于中国27个省(市、自治区)[29]。COL(CONSTANS-like)基因是植物光周期途径重要的调控基因。在营养生长阶段，COL基因在叶片中表达；光周期途径中，COL可将光信号和生物钟信号转变为开花信号，诱导成花基因FT、LFY表达，促进植株开花[30-31]。本研究以杜仲基因组数据为基础，通过生物信息学方法，搜索杜仲CONSTANS-Like基因家族，共鉴定到8个EuCOLs基因，根据基因组注释位置，8个EuCOLs基因分别映射到8条特定的染色体上，表明EuCOLs基因在染色体上均匀分布。
系统进化结果显示：EuCOLs分为2个亚家族(群组Ⅰ和群组Ⅲ)，分别包含2和6个EuCOLs蛋白。在拟南芥中，AtCO、AtCOL1~AtCOL5属于群组Ⅰ亚家族，含有2个B-box和1个CCT结构域，超表达AtCOL3延长转基因拟南芥开花时间[32]，在短日照条件下，超表达AtCOL5可以促进FT和SOC1基因表达，诱导拟南芥提前开花[33]。大麦HvCO1和Hd1基因与CO亲缘关系最近，可以通过激活HvFT1 诱导大麦开花[4]，拟南芥co突变体过表达牵牛花Pharbitis nil的PnCO基因可促进植物开花[34]。黑麦草Lolium perenne的LpCO可以互补拟南芥co突变体晚花表型[35]，毛果杨PtCO促使植株提前开花，也可调控植株的生长和芽的分化[36]。群组Ⅲ亚家族含有1个B-box和1个CCT结构域。在拟南芥中，AtCOL6~AtCOL8和AtCOL16属于群组Ⅲ亚家族，AtCOL7和AtCOL8在开花调控中是转录抑制因子，超表达AtCOL7和AtCOL8导致转基因拟南芥开花延迟[22, 37-38]，推测EuCOLs可能也参与杜仲开花调控。
蛋白序列比对结果显示：EuCOLs与拟南芥、毛果杨COLs蛋白结构域具有高度的相似性，N末端含有1~2个典型的B-box结构域，C端包含1个CCT结构域。B-box1和B-box2结构域保守氨基酸残基分布相似，B-box1结构域中的5个Cys残基和2个His残基比其他氨基酸残基更保守，B-box2结构域中的第1个组氨酸(His)残基被苏氨酸(Thr)取代或者丢失(EuCOL2和EuCOL7)。在葡萄Vitis vinifera中，VviBBX9和VviBBX10蛋白B-box2结构域中的第1个His残基被天冬酰胺(Asn)取代[39]，暗示EuCOL2和EuCOL7可能具有特异的功能。
外显子-内含子结构与基因系统进化存在密切关系，外显子-内含子的增加或减少有助于基因家族的扩展和多样化[40]。结构分析显示：EuCOLs基因含有2~6个外显子，EuCOL2含有6个外显子，其同源基因EuCOL8含有4个外显子，EuCOL3和EuCOL6分别含有6和3个外显子，而EuCOL5和EuCOL7分别含有4和2个外显子，推测EuCOLs在进化过程中可能存在外显子丢失现象，这与葡萄VviBBXs蛋白情况类似[39]。基序分析发现：motif 1和motif 2分别编码B-box和CCT结构域，存在于所有EuCOLs转录因子，同一亚家族EuCOLs蛋白motifs分布较为相似，不同亚族之间有差异。
EuCOLs启动子中含有多个胁迫、激素和光周期响应元件，其中光响应元件数量最多，共有79个，暗示EuCOLs可能参与杜仲光周期调节。研究表明：COLs基因参与多种植物光周期开花调控，在矮牵牛中，PnCO和PnCOL1具有显著的昼夜振荡节律，PnCO可以恢复拟南芥co突变体晚开花表型[41-42]；大部分香蕉Musa acuminate的MaCOLs基因表达量在白天达到峰值，夜晚降为最低[43]。杨树PttCO1和PttCO2黄昏时表达水平开始增加，黎明时达到峰值[44]。短日照条件下，OsCOL3通过抑制Hd3a和RFT基因表达，导致水稻延迟开花[45]，OsCOL13和OsCOL10在开花中发挥负调控作用[46-47]；超表达HvCO1和ClCOL3促进开花[15, 48]。EuCOLs在杜仲雄花芽苞叶原基分化中期和雄蕊原基分化初期差异表达，EuCOL7在雄蕊原基分化初期上调表达，EuCOL1下调表达[49]，表明EuCOLs参与杜仲开花调控。
大量研究表明：COLs不仅调控植物开花，还参与非生物胁迫以及生长发育等生物学过程[22, 50]。拟南芥STO与CONSTNS结构相似，超表达STO提高转基因植株的耐盐性[51]。在菊花Chrysanthemum morifolium中，Cm-BBX24-RNAi转基因株系开花提前，冷冻和干旱胁迫耐受性降低，光周期和赤霉素生物合成相关基因上调表达，表明Cm-BBX24在菊花开花时间和非生物胁迫中发挥多重作用[52]。低温诱导葡萄叶片、茎和花中VvZFPL基因上调表达，超表达VvZFPL导致转基因拟南芥下胚轴伸长，莲座叶变小，叶绿素含量降低[53]，提高转基因拟南芥低温、干旱和盐胁迫耐受性[54]。AtCOL4基因表达受ABA、高盐和渗透胁迫的诱导，在种子萌发和子叶绿化过程中，atcol4突变体增加ABA和盐胁迫的敏感性[21]。表达模式分析显示：大部分EuCOLs在杜仲叶片发育中表达水平较低，各发育阶段转录水平无显著差异。EuCOL5转录水平相对较高，尤其在老叶中；EuCOL7在幼叶中表达量最高。在杜仲胶形成中，EuCOL5在‘小叶’中高量表达，EuCOL7在‘秦仲2号’中表达水平最高。qRT-PCR结果显示：EuCOL1和EuCOL4在叶片发育起始阶段表达量最高，EuCOL7随着叶片发育，转录水平逐渐增加，EuCOL2、EuCOL3、EuCOL5、EuCOL6和EuCOL8在叶片发育中，呈现先升高后降低的表达趋势，表明EuCOLs在杜仲叶片发育中具有功能差异性。
蛋白互作网络结果显示：EuCOL7可以与10个蛋白质互作，10个蛋白质中有7个(LNK2、LHY、CCA、RVE、COL、BBX25和BBX19)参与光周期调控，推测EuCOL7参与杜仲光周期响应，具体互作蛋白还需实验验证。在毛竹中，PheCOLs具有显著的昼夜振荡表达模式，光照抑制大部分PheCOLs基因表达，黑暗诱导。酵母单杂交结果显示：PheCOL14可以与PheCOL3启动子结合[16]。在拟南芥中，LHY属于同源域蛋白超家族，参与昼夜调控，与APRR1/TOC1和TCP21/CHE的启动子结合，抑制其转录，并抑制CCA1基因表达[55-56]。AtCOL5在维管组织中表达，超表达AtCOL5导致开花提前，然而AtCOL5缺失突变体并不影响开花时间，暗示AtCOL5可能与其他开花调控因子存在功能冗余现象[33]。
Genome-wide identification, system evolution and expression pattern analysis of CONSTANS-like in Eucommia ulmoides
-
摘要:
目的 揭示CONSTANS-like在杜仲Eucommia ulmoides基因组中的分布、结构特征及表达模式。 方法 利用生物信息学方法，对杜仲CONSTANS-like基因家族进行鉴定及理化性质、进化关系、基因结构、启动子元件和表达模式分析。 结果 杜仲基因组中共鉴定到8个EuCOLs基因，分别命名为EuCOL1~EuCOL8，氨基酸数目为315~469，理论等电点分布范围为5.10~6.47，分子量为35.21~52.65 kDa。亚细胞定位预测均定位在细胞核中，为亲水性蛋白，分布于8条染色体。系统进化分为2个亚家族(群组Ⅰ和群组 Ⅲ)，分别包含2和6个EuCOLs蛋白，同一亚家族基序具有相似性。EuCOLs基因结构简单，启动子中含有多个光周期响应元件。表达模式分析显示：EuCOLs在杜仲叶片发育中表达水平相对较低，EuCOL7在杜仲胶形成中表达量最高，各家族成员表达特征存在差异。蛋白互作预测显示：EuCOL7可与多个光周期响应蛋白互作。 结论 杜仲CONSTANS-like基因家族含有典型的CCT和B-box结构域，可能参与叶片发育及杜仲胶的形成。图8表1参56 -
关键词:
- 杜仲 /
- CONSTANS-like /
- 生物信息学 /
- 表达模式分析
Abstract:Objective This study aims to reveal the distribution and expression pattern of CONSTANS-like in Eucommia ulmoides genome. Method Bioinformatics method was used to identify the CONSTANS-like gene family of E. ulmoides and analyze its physicochemical properties, evolutionary relationship, gene structure, promoters and expression patterns. Result A total of 8 EuCOL genes (EuCOL1−EuCOL8) were identified in E. ulmoides genome, composed of 315−469 amino acid residues. Their isoelectric point distribution range was 5.10−6.47 and the molecular weight was 35.21−52.65 kDa. Subcellular localization predicted that they were all located in the nucleus and were hydrophilic proteins, distributed on 8 chromosomes. EuCOL gene family was divided into two subfamilies (Group Ⅰ and Group Ⅲ), containing 2 and 6 EuCOLs proteins, respectively, the motifs of the same subfamily were similar. EuCOL genes were simple in structure and contained multiple photoperiodic response elements in their promoters. Expression pattern analysis showed that the expression level of EuCOLs was relatively low during the development of E. ulmoides leaves, the expression level of EuCOL7 was the highest in gutta-percha formation, and the expression characteristics of family members were different. Protein interaction prediction showed that EuCOL7 could interact with multiple photoperiod responsive proteins. Conclusion The CONSTANS-like gene family of E. ulmoides contains a typical CCT and B-box domain, which may be involved in leaf development and gutta-percha formation. [Ch, 8 fig. 1 tab. 56 ref.] -
Key words:
- Eucommia ulmoides /
- CONSTANS-like /
- bioinformatics /
- expression pattern analysis
-
沙棘Hippophae rhamnoides又名醋柳，是胡颓子科Elaeagnaceae沙棘属Hippophae的落叶性灌木[1]。作为药食同源植物的沙棘不仅在食疗、医药、农林牧渔等领域具有较大的经济价值，在水土保持、恢复生物链及防风固沙中也具有极大的生态价值[2-5]。生长过程中沙棘根部会遭受土壤中放线菌、细菌的侵染形成根瘤。部分菌种会在根瘤中高度富集发挥固氮、促生长、抵御逆境胁迫、防止有害病菌侵染等功能[6-8]。传统的微生物研究方法主要以培养基进行分离纯培养，再进而探究其培养特征、显微结构、生理特性等[9]。而自然界中90%以上的微生物为不可培养微生物，且现有培养基与培养技术不适应未知菌群的生长，或部分菌群生长缓慢、丰度较小等情况都会对菌群的多样性评估产生影响[10]。以二代高通量测序为基础的16S rDNA技术通过对编码原核核糖体小亚基rRNA的DNA序列进行测序，不仅克服了传统方法难以获得不可培养菌株的弊端，还能对样品中的物种相对丰度进行排序，并分析各群组样品中发挥重要作用的优势物种，解析样品中微生物之间的相互作用。该技术对研究沙棘根瘤内生菌微生物多样性与环境关系以及微生物资源的开发利用有重要的理论和现实意义[11-16]。
本研究通过16S rRNA测序技术对沙棘根瘤内生菌进行物种注释、分类学分析、α多样性分析、β多样性分析、组间差异显著性分析，比较高通量测序和纯培养方法的差异与优劣，为发掘具有应用价值的根瘤内生菌资源提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料采集
采样地为内蒙古自治区巴彦淖尔市磴口县中国林业科学研究院沙漠林业实验中心试验林场(40°29′34″N，106°74′06″E)。该研究区海拔为1 054 m，年平均气温为7.4 ℃。2020年7月，选取人为干扰因素较少的沙漠边缘地带采集沙棘根瘤样品。在每个样地10 m×10 m的区域内用网格法定9个点，运用梅花形采样法在边角及中心共5个点分别采集根瘤样品并进行混合，共设计6组重复样，分别命名为M1、M2、M3、M4、M5、M6。
1.2 沙棘根瘤内生菌的分离培养
1.2.1 沙棘根瘤内生菌的分离
依据文献[17-18]的方法进行修改，使其更加适宜沙棘根瘤内生菌的分离。详细步骤如下：选取新鲜饱满的根瘤，冲洗掉土粒泥沙，将根瘤团用解剖刀分割成带有单柄的瘤瓣，用纱布包裹，先用体积分数为95%的酒精溶液浸泡30 s，再用体积分数为10%的次氯酸钠溶液表面灭菌5 min，取出后用无菌水冲洗数次。在灭菌滤纸上，用无菌解剖刀先切取根瘤头部，再将其均分成2~3份薄片，置于固体培养基中28 ℃恒温暗处静置培养。根据相关研究，本研究选取BAP[19]、S[20]、JA[19]、高氏一号培养基[19]进行分离培养。
1.2.2 沙棘根瘤内生菌的鉴定
提取纯培养的沙棘根瘤内生菌DNA后，对16S rDNA全长进行PCR扩增。序列引物采用YU等[21]设计的细菌通用引物(引物序列27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)，PCR总反应体系为50 μL，包括10×缓冲液(KOD buffer) 5 μL、2 mmol·L−1三磷酸脱氧核糖核苷酸混合液(dNTPs) 5 μL、基因组DNA (genomic DNA) 1 μL、上游引物(forward primer) (10 μm) 1 μL、下游引物(reverse primer) (10 μm) 1 μL、DNA聚合酶(KOD DNA polymerase) 1 μL、超纯水(ddH2O) 36 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳，确定有特异扩增后，进行PCR产物回收和测序注释，并参考文献[22-25]进行比对校验。
1.3 沙棘根瘤内生菌的高通量测序分析
1.3.1 建库测序
提取沙棘根瘤总DNA后，根据16S rDNA保守区设计引物(引物序列335F：5′-CADACTCCTACGGGAGGC-3′，769R：5′-ATCCTGTTTGMTMCCCVCRC-3′)，在引物末端加上测序接头，便于建库时添加能区分样本的碱基序列的条码/索引(barcode/index)。再进行PCR扩增并对其产物进行紫外分光光度计定量及混样、过柱纯化和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序[26]。高通量测序得到的原始图像数据文件，经碱基识别分析转化为原始测序序列，结果以FASTQ (简称为fq)文件格式存储[27]。
1.3.2 测序数据处理
首先使用 Trimmomatic v.0.33软件[28]，对测序得到的原始测序序列进行过滤；其次使用cutadapt 1.9.1软件进行引物序列的识别与去除，得到不包含引物序列的高质量测序序列；然后使用FLASH v1.2.7软件[29]，按照最小重叠(overlap)长度为10 bp、重叠区允许的最大错配比率为0.2的要求，对每个样品高质量的一小段短的基因测序片段(reads)进行拼接，得到的拼接序列即原始序列质控后的高质量测序序列(clean reads)；最后使用UCHIME v4.2软件[30]，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据。使用Usearch软件对reads在97.0%的相似度水平下进行聚类，获得分类操作单元(OTU)[31]，以测序所有序列数的0.005%作为阈值过滤OTU[32]。以SILVA (
http://www.arb-silva.de/ )为参考数据库使用朴素贝叶斯分类器对特征序列进行分类学注释，可得到每个特征对应的物种分类信息，进而在各水平(门、纲、目、科、属、种)统计样品群落组成，利用QIIME软件生成不同分类水平上的物种丰度表，再利用R语言工具绘制样品分类学水平下的群落结构图[33]。使用QIIME软件对样品α多样性进行评估和t检验(显著性水平为0.01)。利用Mothur v1.30软件和R语言工具包绘制稀释曲线。基于独立OTU，采用加权分析方法和Bray-Curtis算法，使用QIIME软件进行非加权组平均法(UPGMA)分析，比较各组样品间的物种差异。2. 结果与分析
2.1 分类操作单元(OTU)聚类分析
使用Usearch软件对clean reads在97.0%的相似度水平下进行聚类，共计获得651个OTU。各样品OTU个数分布较为均匀，样品M1~M6分别为551、583、579、518、593、589个。如图1所示：6组样品中共有的OTU数为417个。M3、M5、M6中分别有4、2、9个特有的OTU，为样品特有OTU，非单个样品特有或所有样品间共有的OTU在图1未做展示。从整体来看，不同地点的各样品间的OTU差异性远小于共性，说明采样方法设计合理。
图 1 沙棘(M1~M6)根瘤样品分类操作单元(OTU)花瓣图Figure 1 Petal image of operational taxonomic unit (OTU) of H. rhamnoides root nodule sample (M1－M6)2.2 测序深度分析与α多样性指数分析
对6组样品测序共获得 810 039对reads，双端reads质控、拼接后共产生617 188条clean reads。其中质量≥20的碱基占总碱基数的比例(Q20)为98.7%，质量≥30的碱基占总碱基数的比例(Q30)为95.4%，表明测序质量较好。从图2可见：各样品稀释性曲线趋向平缓，表明在持续抽样下新物种出现的速率逐渐趋于平缓，此环境中物种数量不会随测序数量的增加而显著增多[34]，说明取样合理，能较好体现6组样品中根瘤内生菌的多样性，可以进行数据分析。M5的Shannon和Simpson指数最大(表1)，说明物种多样性最高。同理，M4的物种多样性最低。物种丰度方面M5与M6差别不大，均有较高水平。M4根瘤样品的物种丰度最低。样点的Shannon指数平均为4.24，Simpson指数平均为0.70，Ace指数平均为585.79，Chao1指数平均为595.47，样本文库平均覆盖率为99.95%。说明采样地的沙棘根瘤内生菌的物种丰富且多样性较大，各物种分配相对均匀，其微生物物种信息得到了充分体现。
表 1 各组样品的α多样性指数Table 1 Alpha diversity index for each group of samples样品 Shannon
指数Simpson
指数Ace
指数Chao1
指数覆盖
率/%M1 2.53 0.47 568.45 598.57 99.95 M2 4.73 0.79 595.09 600.60 99.95 M3 4.28 0.75 600.58 607.45 99.95 M4 2.52 0.44 542.32 543.52 99.94 M5 6.58 0.95 605.66 610.71 99.94 M6 4.82 0.77 602.63 611.97 99.94 平均 4.24 0.70 585.79 595.47 99.95 2.3 传统纯培养与高通量测序分析沙棘根瘤内生菌的群落结构及其差异
通过传统分离方法从BAP、JA、S、高氏一号培养基中得到纯培养菌株96株。所有菌株均可传代培养，但菌株之间培养周期差异较大，培养周期在1~30 d呈离散型分布。对各菌株进行分子鉴定，共有4门8纲8目13科19属。在门的分类水平分别为变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、厚壁菌门Firmicutes和柔膜菌门Tenericutes。在属的分类水平上，96株菌分属于支原体属Mycoptasma 1株、慢生根瘤菌属Bradyrhizobim 6株、土壤杆菌属Agrobacterium 7株、肠杆菌属Enterobacter 6株、小坂菌属Kosakonia 8株、柠檬酸杆菌属Citrobacter 1株、约克氏菌属Yokenella 1株、欧文氏菌属Erwinia 1株、克罗诺杆菌属Cronobacter 2株、泛菌属Pantoea 1株、莫拉菌属Moraxella 1株、贪噬菌属Variovorax 1株、草螺菌属Herbaspirillum 1株、假单胞菌属Pseudomonas 5株、链霉菌属Streptomyces 14株、小单孢菌属Micromonospora 1株、短杆菌属Brevibacterium 6株、葡萄球菌属Straphylococcus 1株和芽孢杆菌属Bacillus 32株。其中，优势门为变形菌门和厚壁菌门，优势属为芽孢杆菌属和链霉菌属。
高通量测序分析发现：6组样品共有14门34纲89目148科314属。将相对丰度大于0.1%的门与相对丰度前10的属进行汇总(图3、表2、表3)发现：在门的分类水平上，6组样品中相对丰度较高的主要为放线菌门和变形菌门，两者相对丰度之和为87.5%~97.1%。其次为拟杆菌门Bacteroidetes、杆菌门Patescibacteria、厚壁菌门、酸杆菌门Acidobacteria。在属的分类水平上，弗兰克氏菌属Frankia占绝对优势，相对丰度为20.12%~74.81%，平均相对丰度为51.49%。其次为根瘤菌属Rhizobium、类固醇杆菌属Steroidobacter、糖单孢菌属Saccharimonadales、肠杆菌属、泛菌属、欧文氏菌属、假黄色单胞菌属Pseudoxanthomonas、鞘脂单胞菌属Sphingomonas、假单胞菌属、固氮弓菌属Azoarcus、伯克氏菌属Burkholderia、芽单胞菌属Blastomonas、聚集杆菌属Congregibacter、拉恩氏菌属Rahnella、鞘氨醇菌属Chitinophaga、独岛杆菌属Dokdonella、普雷沃氏菌属Prevotella、链霉菌属、Microtrichales属。
表 2 沙棘微生物区系门水平的相对分布Table 2 Relative abundance of microbiota taxa at the level of phylum分类 6组样品在门水平的相对丰度/% M1 M2 M3 M4 M5 M6 放线菌门 73.55 47.56 51.24 76.09 27.73 57.68 变形菌门 22.38 41.91 41.63 21.01 60.35 29.82 拟杆菌门 0.89 1.42 1.30 0.40 2.18 4.42 杆菌门 0.31 5.66 3.89 0.73 1.42 1.72 厚壁菌门 2.18 2.74 1.30 1.21 2.18 4.42 酸杆菌门 0.15 0.26 0.42 0.18 1.16 0.53 其他 0.54 0.45 0.22 0.38 0.75 0.60 表 3 沙棘微生物区系属水平的相对分布Table 3 Relative abundance of microbiota taxa at the level of genus分类 6组样品在属水平的相对丰度/% M1 M2 M3 M4 M5 M6 弗兰克氏菌属 72.62 44.45 49.50 74.81 20.12 47.41 根瘤菌属 1.17 1.97 2.89 2.04 3.13 4.13 类固醇杆菌属 0.73 0.83 1.05 2.20 7.19 2.87 糖单孢菌属 0.28 5.61 3.85 0.71 1.41 1.68 肠杆菌属 6.93 2.19 1.05 0.08 0.22 0.40 泛菌属 0.63 5.19 4.69 0.01 0.05 0.11 欧文氏菌属 0.60 4.66 3.77 0.10 0.18 0.23 假黄色单胞菌属 0.85 1.98 1.67 0.75 3.56 0.68 鞘脂单胞菌属 0.39 1.06 2.10 1.55 2.10 1.64 假单胞菌属 0.51 1.27 5.60 0.03 0.21 0.09 其他 15.29 30.79 23.83 17.72 61.83 40.76 
图 3 6组根瘤样品的非加权组平均法(UPGMA)聚类树与物种分布柱状图Figure 3 UPGMA clustering tree and the species distribution histogram of the six groups of nodule samples are combined drawing在门、纲、目、科、属的各分类单元中，高通量测序的检测灵敏度(高通量测序/纯培养)依次是纯培养方法的3.50、4.25、11.20、11.38和16.53倍。在门水平上，纯培养菌株中占比较高的厚壁菌门在高通量测序中占比并不高。在属水平上，纯培养菌株中占比较高的芽孢杆菌属和链霉菌属皆在高通量测序中占比很低。该对比结果差异性较大，说明高通量测序在微生物多样性分析中占据优势地位，要优于纯培养方法。同时也说明，沙棘根瘤内共生细菌群落结构更为复杂，群落更为稳定。
3. 结论与讨论
3.1 结论
在运用传统方法分离纯培养微生物时，共分离纯培养菌株96株，分属于4门8纲8目13科19属，未获得弗兰克氏菌属的菌株，可能是培养基中弗兰克氏菌属的菌株生长缓慢，易被其他菌群取代，因此仍需探索新的培养基与培养方法以遏制根瘤中其他菌株的繁殖。在微生物多样性分析中，由于环境中的微生物复杂多样，各环境之间组成差异较大，通常采用非加权方法进行分析。该方法简单易操作，主要考虑物种的有无，但未考虑物种的丰度，所以采用非加权的方法难以区别各样品间的差异。
高通量测序分析共检测到14门34纲89目148科314属。在门、纲、目、科、属的各分类单元中，高通量测序的检测灵敏度(高通量测序/纯培养)依次是纯培养方法的3.50、4.25、11.20、11.38和16.53倍。与纯培养获得的菌株相比，高通量测序分析结果更加完整地揭示了沙棘根瘤内生菌的微生物多样性。高通量测序表明：在门的分类水平上，样品中相对丰度较高的主要为放线菌门和变形菌门，两者相对丰度之和为87.5%~97.1%。在属的分类水平上，弗兰克氏菌属占绝对优势，相对丰度为20.12%~74.81%，平均相对丰度为51.49%。
3.2 讨论
张爱梅等[35]和刘志强等[36]分别对甘肃榆中、辽宁通辽、内蒙古赤峰等地沙棘根瘤内生菌微生物多样性做过类似研究，其高通量测序所得的微生物多样性高于本研究结果，说明沙棘根瘤内生菌微生物多样性受地理位置、土壤成分、气候条件、宿主种类及生长环境等多种因素的影响。本研究的沙棘取样于内蒙古乌兰察布沙漠边缘地带，采样地荒漠化土壤与干旱少雨气候对内生菌多样性有特别影响。
属于非豆科Leguminosae植物的沙棘根瘤共生固氮体系是以弗兰克氏菌属为主导的[37]微生物—微生物—植物互作体系。高通量测序分析显示：弗兰克氏菌属所占比例较高，然而本次传统方法分离却未得到纯培养菌株，这可能是由于培养基中缺乏某种信号物质或与其他菌属竞争存在劣势导致的，建议添加制霉菌素、萘啶酮酸和放线菌酮抑制其他菌群的繁殖[18]。非豆科植物结瘤固氮过程，单一属的菌株难以完成此任务。有研究[38]表明：纯培养分离的贪噬菌属是复杂微生物组中维持根生长的核心菌属，并且具有产生和降解生长素的能力，是细菌—细菌—植物通讯网络的关键角色。小单孢菌是植物益生菌，在促进植物生长的同时还可以分泌细胞壁降解酶促进细胞壁的降解，进而便于弗兰克氏菌的侵染[39-40]，但是小单孢菌的快速繁殖也对弗兰克氏菌的生长起到抑制作用。沙棘作为胡颓子科植物，根部结瘤侵染方式为细胞间侵入。研究[41]表明：草螺旋菌属Spirillum、慢生根瘤菌属、肠杆菌属的相关细菌与弗兰克氏菌存在负相关性(即抑制关系)，以上3个菌属均在豆科、禾本科Poaceae植物中发挥固氮相关的重要作用，但在胡颓子科中此类细菌与弗兰克氏菌属相互作用的机制尚未明确。
-
图 1 杜仲、水稻、拟南芥、毛果杨和玉米CO-likes蛋白系统进化树
Figure 1 Phylogenetic tree of CO-like proteins from E. ulmoides, O. sativa, A. thaliana, P. trichocarpa and Z. mays
图 5 EuCOLs基因在杜仲叶片不同发育时期表达模式
Figure 5 Expression patterns of EuCOLs genes at different development stages of E. ulmoides leaves
图 6 EuCOLs基因在杜仲胶形成中的表达模式
Figure 6 Expression pattern of EuCOL genes in the formation of eu-rubber
图 7 杜仲COL家族基因在叶片发育中的表达模式
Figure 7 Expression patterns of E. ulmoides COL family genes during leaf development
表 1 杜仲CO-like蛋白序列特征及亚细胞定位预测
Table 1. Sequence characteristics and predicted subcellular location of E. ulmoides CO-like proteins
基因ID 基因名 染色体定位 位置/bp CDS长度/bp 蛋白质序列/个 分子量/kDa 等电点 亚细胞定位 EUC17024-RA EuCOL1 Super-Scaffold_183 1 758 965~1 761 661 1 128 375 41.70 5.10 细胞核 EUC14665-RA EuCOL2 Super-Scaffold_127 1 395 219~1 398 047 1 287 428 47.26 5.25 细胞核 EUC14912-RA EuCOL3 Super-Scaffold_121 1 876 239~1 890 694 1 410 469 52.65 5.95 细胞核 EUC04726-RA EuCOL4 Super-Scaffold_3 2 229 604~2 240 203 1 155 384 42.06 5.85 细胞核 EUC01228-RA EuCOL5 scaffold416_obj 336 319~340 482 1 038 345 39.01 6.47 细胞核 EUC13984-RA EuCOL6 scaffold20_obj 133 259~134 581 972 323 35.50 5.52 细胞核 EUC15205-RA EuCOL7 Super-Scaffold_275 13 124~15 540 948 315 35.21 5.59 细胞核 EUC06371-RA EuCOL8 Super-Scaffold_162 322 024~324 298 1 347 448 49.49 5.71 细胞核 
下载: 导出CSV
-
[1] TOROK M, ETKIN L D. Two B or not two B? Overview of the rapidly expanding B-box family of proteins [J]. Differentiation, 2001, 67(3): 63 − 71. [2] ROBSON F, COSTA M M, HEPWORTH S R, et al. Functional importance of conserved domains in the flowering-time gene CONSTANS demonstrated by analysis of mutant alleles and transgenic plants [J]. Plant J, 2001, 28(6): 619 − 631. [3] YAMASHINO T, YAMAWAKI S, HAGUI E, et al. Clock-controlled and FLOWERING LOCUS T (FT)-dependent photoperiodic pathway in Lotus japonicus(Ⅰ) verification of the flowering associated function of an FT homolog [J]. Biosci,Biotechnol,Biochem, 2013, 77(6): 747 − 753. [4] GRIFFITHS S, DUNFORD R P, COUPLAND G, et al. The evolution of CONSTANS-Like gene families in barley, rice, and Arabidopsis [J]. Plant Physiol, 2003, 131(4): 1855 − 1867. [5] CHIA T Y, MULLER A, JUNG C, et al. Sugar beet contains a large CONSTANS-LIKE gene family including a CO homologue that is independent of the early-bolting (B) gene locus [J]. J Exp Bot, 2008, 59(10): 2735 − 2748. [6] ROBERT L S, ROBSON F, SHARPE A, et al. Conserved structure and function of the Arabidopsis flowering time gene CONSTANS in Brassica napus [J]. Plant Mol Biol, 1998, 37(5): 763 − 772. [7] NEMOTO Y, KISAKA M, TAKUICHI F, et al. Characterization and functional analysis of three wheat genes with homology to the CONSTANS flowering time gene in transgenic rice [J]. Plant J, 2003, 36(1): 82 − 93. [8] HOLEFORS A, OPSETH L M, ROSNES A K R, et al. Identification of PaCOL1 and PaCOL2, two CONSTANS-like genes showing decreased transcript levels preceding short day induced growth cessation in Norway spruce [J]. Plant Physiol Biochem, 2009, 47(2): 105 − 115. [9] ALMADA R, CABRERA N, CASARETTO J A, et al. VvCO and VvCOL1, two CONSTANS homologous genes, are regulated during flower induction and dormancy in grapevine buds [J]. Plant Cell Rep, 2009, 28(8): 1193 − 1203. [10] SUÁREZ-LÓPEZ P, WHEATLEY K, ROBSON F, et al. CONSTANS mediates between the circadian clock and the control of flowering in Arabidopsis [J]. Nature, 2001, 410(6832): 1116 − 1120. [11] SONG Y H, SMITH R W, TO B J, et al. FKF1 conveys timing information for CONSTANS stabilization in photoperiodic flowering [J]. Science, 2012, 336(6084): 1045 − 1049. [12] LUCCIONI L, KRZYMUSKI M, SÁNCHEZ-LAMAS M, et al. CONSTANS delays Arabidopsis flowering under short days [J]. Plant J, 2019, 97(5): 923 − 932. [13] CHENG Xiaofei, WANG Zengyu. Overexpression of COL9, a CONSTANS-LIKE gene, delays flowering by reducing expression of CO and FT in Arabidopsis thaliana [J]. Plant J, 2005, 43(5): 758 − 768. [14] WU Weixun, ZHANG Yingxin, ZHANG Miao, et al. The rice CONSTANS-like protein OsCOL15 suppresses flowering by promoting Ghd7 and repressing RID1 [J]. Biochem Biophy Res Commun, 2018, 495(1): 1349 − 1355. [15] FU Jianxin, YANG Liwei, DAI Silan. Identification and characterization of the CONSTANS -like gene family in the short-day plant Chrysanthemum lavandulifolium [J]. Mol Genet Genomics, 2015, 290(3): 1039 − 1054. [16] LIU Jun, CHENG Zhanchao, LI Xiangyu, et al. Expression analysis and regulation network identification of the CONSTANS-Like gene family in moso bamboo (Phyllostachys edulis) under photoperiod treatments [J]. DNA Cell Biol, 2019, 38(7): 607 − 626. [17] XIAO Guohui, LI Bingjuan, CHEN Hongjuan, et al. Overexpression of PvCO1, a bamboo CONSTANS-LIKE gene, delays flowering by reducing expression of the FT gene in transgenic Arabidopsis [J]. BMC Plant Biol, 2018, 18(1): 232 − 247. [18] LI Juan, GAO Kai, YANG Xiaoyu, et al. Identification and characterization of the CONSTANS-like gene family and its expression profiling under light treatment in Populus [J]. Int J Biol Macromol, 2020, 161: 999 − 1010. [19] YAN Jiaping, MAO Dun, LIU Xiaomeng, et al. Isolation and functional characterization of a circadian-regulated CONSTANS homolog (GbCO) from Ginkgo biloba [J]. Plant Cell Rep, 2017, 36(9): 1387 − 1399. [20] OHMIYA A, ODA-YAMAMIZO C, KISHIMOTO S. Overexpression of CONSTANS-like 16 enhances chlorophyll accumulation in petunia corollas [J]. Plant Sci, 2019, 280: 90 − 96. [21] MIN J H, CHUNG J S, LEE K H, et al. The CONSTANS-like 4 transcription factor, AtCOL4, positively regulates abiotic stress tolerance through an abscisic acid-dependent manner in Arabidopsis [J]. J Integrative Plant Biol, 2015, 57(3): 313 − 324. [22] WANG Honggui, ZHANG Zenglin, LI Hongyu, et al. CONSTANS-LIKE 7 regulates branching and shade avoidance response in Arabidopsis [J]. J Exp Bot, 2013, 64(4): 1017 − 1024. [23] 王淋. 杜仲橡胶合成相关酶基因的克隆及功能研究[D]. 长沙: 中南林业科技大学, 2014. WANG Lin. Cloning and Function Analysis of Related Genes Involved in Rubber Biosynthesis of Eucommia ulmoides[D]. Changsha: Central South University of Forestry and Technology, 2014. [24] TAMURA K, STECHER G, PETERSON D, et al. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0 [J]. Mol Biol Evol, 2013, 30(12): 2725 − 2729. [25] LI Long, LIU Minhao, SHI Kan. Dynamic changes in metabolite accumulation and the transcriptome during leaf growth and development in Eucommia ulmoides[J/OL]. Int J Mol Sci, 2019, 20(16): 4030[2021-05-20]. doi: 10.3390/ijms20164030. [26] YE Jing, HAN Wenjing, FAN Ruisheng, et al. Integration of transcriptomes, small RNAs, and degradome sequencing to identify putative miRNAs and their targets related to eu-rubber biosynthesis in Eucommia ulmoides[J/OL]. Genes, 2019, 10(8): 623[2021-05-20]. doi: 10.3390/genes10080623. [27] CHEN Chengjie, CHEN Hao, ZHANG Yi, et al. TBtools: An integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data [J]. Mol Plant, 2020, 13(8): 1194 − 1202. [28] YE Jing, JIN Cangfu, LI Nan, et al. Selection of suitable reference genes for qRT-PCR normalization under different experimental conditions in Eucommia ulmoides Oliv[J/OL]. Sci Rep, 2018, 8(1): 15043[2021-05-15]. doi: 10.1038/s41598-018-3342-w. [29] 杜红岩. 中国杜仲图志[M]. 北京: 中国林业出版社, 2014: 24 − 25. DU Hongyan. China Eucommia Pictorial[M]. Beijing: China Forestry Publishing House, 2014: 24 − 25. [30] 付建新, 王翊, 戴思兰. 高等植物CO基因研究进展[J]. 分子植物育种, 2010, 8(5): 1008 − 1016. FU Jianxin, WANG Yi, DAI Silan. Advanced research on CO genes in higher plants [J]. Mol Plant Breed, 2010, 8(5): 1008 − 1016. [31] 帅敏敏, 张启香, 黄有军. 光周期途径成花关键基因CONSTANS的进化机制[J]. 浙江农林大学学报, 2019, 36(1): 7 − 13. SHUAI Minmin, ZHANG Qixiang, HUANG Youjun. Evolution of the flowering time gene CONSTANS in a photoperiod pathway [J]. J Zhejiang A&F Univ, 2019, 36(1): 7 − 13. [32] DATTA S, HETTIARACHCHI G H C M, DENG Xingwang, et al. ArabidopsisCONSTANS-LIKE3 is a positive regulator of red light signaling and root growth [J]. Plant Cell, 2006, 18(1): 70 − 84. [33] HASSIDIM M, HARIR Y, YAKIR E, et al. Over-expression of CONSTANS-LIKE5 can induce flowering in short-day grown Arabidopsis [J]. Planta, 2009, 230(3): 481 − 491. [34] HAYAMA R, AGASHE B, LULEY E, et al. A circadian rhythm set by dusk determines the expression of FT homologs and the short-day photoperiodic flowering response in Pharbitis [J]. Plant Cell, 2007, 19(10): 2988 − 3000. [35] MARTIN J, STORGAARD M, ANDERSEN C H, et al. Photoperiodic regulation of flowering in perennial ryegrass involving a CONSTANS-like homolog [J]. Plant Mol Biol, 2004, 56(2): 159 − 169. [36] BÖHLENIUS H, HUANG Tao, CHARBONNEL-CAMPAA L, et al. CO/FT regulatory module controls timing of flowering and seasonal growth cessation in trees [J]. Science, 2006, 312(5776): 1040 − 1043. [37] TAKASE T, KAKIKUBO Y, NAKASONE A, et al. Characterization and transgenic study of CONSTANS-LIKE8(COL8) gene in Arabidopsis thaliana: expression of 35S∶COL8 delays flowering under long-day conditions [J]. Plant Biotechnol, 2011, 28(5): 439 − 446. [38] ZHANG Zenglin, JI Ronghuan, LI Hongyu, et al. CONSTANS-LIKE7 (COL7) is involved in phytochrome B (phyB)-mediated light-quality regulation of auxin homeostasis [J]. Mol Plant, 2014, 7(9): 1429 − 1440. [39] ZHANG Xiuming, ZHANG Li, JI Miaomiao, et al. Genome-wide identification and expression analysis of the B-box transcription factor gene family in grapevine (Vitis vinifera L. )[J/OL]. BMC Genomics, 2021, 22(1): 22[2021-05-15]. doi: 10.1186/s12864-021-07479-4. [40] XU Guixia, GUO Chunce, SHAN Hongyan, et al. Divergence of duplicate genes in exon-intron structure [J]. Proc Natl Acad Sci, 2012, 109(4): 1187 − 1192. [41] LIU Jiayou, YU Jianping, MCINTOSH L, et al. Isolation of a CONSTANS ortholog from Pharbitis nil and its role in flowering [J]. Plant Physiol, 2001, 125(4): 1821 − 1830. [42] KIM S J, MOON J H, LEE I, et al. Molecular cloning and expression analysis of a CONSTANS homologue, PnCOL1, from Pharbitis nil [J]. J Exp Bot, 2003, 54(389): 1879 − 1887. [43] CHAURASIA A K, PATIL H B, AZEEZ A, et al. Molecular characterization of CONSTANS-Like(COL) genes in banana (Musa acuminata L. AAA Group, cv. Grand Nain) [J]. Physiol Mol Biol Plants, 2016, 22(1): 1 − 15. [44] DING Jihua, BÖHLENIUS H, RÜHL M G, et al. GIGANTEA-like genes control seasonal growth cessation in Populus [J]. New Phytol, 2018, 218(4): 1491 − 1503. [45] KIM S K, YUN C H, LEE J H, et al. OsCO3, a CONSTANS-LIKE gene, controls flowering by negatively regulating the expression of FT-like genes under SD conditions in rice [J]. Planta, 2008, 228(2): 355 − 365. [46] SHENG Peike, WU Fuqing, TAN Junjie, et al. A CONSTANS-like transcriptional activator, OsCOL13, functions as a negative regulator of flowering downstream of OsphyB and upstream of Ehd1 in rice [J]. Plant Mol Biol, 2016, 92(1/2): 209 − 222. [47] TAN Junjie, JIN Mingna, WANG Jiachang, et al. OsCOL10, a CONSTANS-Like gene, functions as a flowering time repressor downstream of Ghd7 in rice [J]. Plant Cell Physiol, 2016, 57(4): 798 − 812. [48] CAMPOLI C, DROSSE B, SEARLE I, et al. Functional characterisation of HvCO1, the barley (Hordeum vulgare) flowering time ortholog of CONSTANS [J]. Plant J, 2012, 69(5): 868 − 880. [49] 朱利利, 杜庆鑫, 何凤, 等. 杜仲雄花芽2个发育时期转录组分析[J]. 植物研究, 2020, 40(2): 284 − 292. ZHU Lili, DU Qingxin, HE Feng. Sequencing analysis of transcriptome of male floral bud at two development stages in Eucommia ulmoides [J]. Plant Res, 2020, 40(2): 284 − 292. [50] MORITA R, SUGINO M, HATANAKA T, et al. CO2-responsive CONSTANS, CONSTANS-like, and time of chlorophyll a/b binding protein expression protein is a positive regulator of starch synthesis in vegetative organs of rice [J]. Plant Physiol, 2015, 167(4): 1321 − 1331. [51] NAGAOKA S, TAKANO T. Salt tolerance-related protein STO binds to a Myb transcription factor homologue and confers salt tolerance in Arabidopsis [J]. J Exp Bot, 2003, 54(391): 2231 − 237. [52] YANG Yingjie, MA Chao, XU Yanjie, et al. A zinc finger protein regulates flowering time and abiotic stress tolerance in Chrysanthemum by modulating gibberellin biosynthesis [J]. Plant Cell, 2014, 26(5): 2038 − 2054. [53] TAKUHARA Y, KOBAYASHI M, SUZUKI S. Low-temperature-induced transcription factors in grapevine enhance cold tolerance in transgenic Arabidopsis plants [J]. J Plant Physiol, 2011, 168(9): 967 − 975. [54] KOBAYASHI M, HORIUCHI H, FUJITA K, et al. Characterization of grape C-repeat-binding factor 2 and B-box-type zinc finger protein in transgenic Arabidopsis plants under stress conditions [J]. Mol Biol Rep, 2012, 39(8): 7933 − 7939. [55] ALABADÍ D, OYAMA T, YANOVSKY M J, et al. Reciprocal regulation between TOC1 and LHY/CCA1 within the Arabidopsis circadian clock [J]. Science, 2001, 293(5531): 880 − 883. [56] GREEN R M, TOBIN E M. The role of CCA1 and LHY in the plant circadian clock [J]. Dev Cell, 2002, 2(5): 516 − 518. 期刊类型引用(5)
1. 高佩，王彬贤，马亚琼，郭思雨，马玉花. 青海野生中国沙棘根际解磷菌的分离、鉴定及其对蕹菜的促生作用. 江苏农业科学. 2024(11): 247-253 . 
百度学术2. 方宇，刘彩玲，林陈强，陈济琛，贾宪波. 不同紫云英品种根瘤内生细菌的类群和多样性分析. 福建农业学报. 2024(06): 730-737 . 百度学术3. 马福林，马秀芳，刘瑞，马玉花. 西藏沙棘AQP基因的扩增及生物信息学分析. 青海科技. 2023(02): 107-111 . 百度学术4. 马福林，王昌玲，仁增卓玛，刘瑞，冶贵生，马玉花. 西藏沙棘根瘤内生菌假单胞菌属的分离与鉴定. 甘肃农业大学学报. 2023(03): 76-81+90 . 百度学术5. 翟柯尧，刘娟，董玥，李亚涛，贺义才，孙海红，马玉超. 沙棘通过自主选择塑造根瘤内生微生物组. 微生物学通报. 2023(09): 3881-3898 . 百度学术其他类型引用(3)
-
-
链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20210385
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 1963
- HTML全文浏览量: 268
- PDF下载量: 114
- 被引次数: 8
