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黄瓜AQP基因家族的鉴定与生物信息学分析

赖梦霞 杜长霞 樊怀福

杜燚, 杨卫诚, 何琴琴, 等. 绿带妒尺蛾对寄主的趋性选择及寄主植物叶片的化学成分分析[J]. 浙江农林大学学报, 2023, 40(1): 89-96. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220168
引用本文: 赖梦霞, 杜长霞, 樊怀福. 黄瓜AQP基因家族的鉴定与生物信息学分析[J]. 浙江农林大学学报, 2022, 39(2): 318-328. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210361
DU Yi, YANG Weicheng, HE Qinqin, et al. Host selection of Phthonoloba viridifasciata and analysis of chemical compounds in leaves of host plants[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2023, 40(1): 89-96. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220168
Citation: LAI Mengxia, DU Changxia, FAN Huaifu. Identification and bioinformatics analysis of AQP gene family in Cucumis sativus[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2022, 39(2): 318-328. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210361

黄瓜AQP基因家族的鉴定与生物信息学分析

DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210361
基金项目: 浙江省自然科学基金资助项目(LY18C150004, LY18C150003)
详细信息
    作者简介: 赖梦霞(ORCID: 0000-0002-5622-2724),从事蔬菜分子生物学研究。E-mail: 2295803738@qq.com。通信作者:;樊怀福(ORCID: 0000-0002-7308-0094),教授,从事蔬菜逆境生物学研究。E-mail: fanhf@zafu.edu.cn
  • 中图分类号: S642.2

Identification and bioinformatics analysis of AQP gene family in Cucumis sativus

  • 摘要:   目的  深入研究黄瓜Cucumis sativus水通道蛋白(aquaporin, AQP)基因家族(CsAQP)的相关功能。  方法  通过全基因组分析技术鉴定其家族成员,对其蛋白质理化性质、系统进化关系、选择压力、基因结构、保守基序、顺式作用元件、蛋白质互作进行分析。  结果  黄瓜基因组共有33个AQP基因,含有2~5个数量不等的外显子,在染色体上不均匀分布;根据物种进化关系将黄瓜AQP基因家族划分为5个亚家族;基因组重复序列分析表明:5号和6号染色体上各有2~3对基因串联重复;计算这些基因的同义替换(synonymous, Ks)和非同义替换(nonSynonymous, Ka)的比率,结果显示均小于1,表明其进化受纯化选择作用;顺式作用调控元件分析发现,大部分基因启动子区所含元件与激素调节、光响应、胁迫密切相关。  结论  通过黄瓜全基因组扫描,获得黄瓜基因组的33个AQP家族成员,分属于5个亚族,映射于7条染色体上。上游启动子区含逆境相关作用元件,且部分基因参与串联复制,历经纯化选择。图6表4参26
  • 在昆虫与植物的关系中,植物化学成分、形态特征和各种环境因子等影响着昆虫对寄主选择,其中寄主植物释放的挥发性物质起着关键的作用[1]。植物的特异性化学物质诱导昆虫产生多种行为,如寄主定向、产卵行为、取食行为等[2]。研究植食性昆虫对寄主植物气味的趋性有助于了解植食性昆虫寄主选择的机制[3],探索新的害虫防控措施,在利用天然活性物质、抗虫育种和生物防治中具有积极意义[4]。大量文献报道:昆虫利用植物所释放的化学信号物质进行寄主定向。如马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata依靠马铃薯Solanum tuberosum叶片气味产生定向选择[5],十字花科Brassicaceae所释放的芥子油对小菜蛾Plutella xylostella具有吸引作用[6],寄主白菜Brassica pekinensis气味对桃蚜Myzus persicae有明显的引诱作用[7],烟草甲Lasioderma serricorne对不同辣椒Capsicum annuum挥发物表现出极显著的趋向作用[8]。根据缨翅目Thysanoptera蓟马科Thripidae昆虫借助植物气味寻找寄主的特性,将烟碱乙酸酯和苯甲醛混合在一起制成诱芯在田间使用,能够准确预测花蓟马的发生及为害时期,并且能大量诱杀蓟马成虫[9]。天牛科Cerambycidae、郭公甲科Cleroidea、象甲科Curculionidae和小蠹虫科Scolytidae的昆虫能被松针叶的挥发物α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和莰烯所引诱[10]。但有关寄主植物气味是否对绿带妒尺蛾Phthonoloba viridifasciata存在引诱作用还未见报道。

    绿带妒尺蛾隶属于鳞翅目Lepidoptera尺蛾科Geometridae,是桫椤Alsophila spinulosa和小黑桫椤Alsophila metteniana的食叶昆虫之一[11]。在贵州赤水桫椤国家级自然保护区内1 a发生4~5代,幼虫以取食嫩叶为主,虫害暴发期,可将嫩叶和成叶取食殆尽,严重影响了桫椤的正常发育和繁殖[12]。桫椤和小黑桫椤隶属于桫椤科Cyatheaceae桫椤属Alsophila蕨类植物,其中桫椤是世界濒危植物[13-14]、中国二级珍惜保护植物[15]。目前桫椤和小黑桫椤对绿带妒尺蛾有效防治研究较少。避免使用化学农药带来的问题,寻找绿色的防控措施对促进有害生物的可持续控制意义重大[16]。研究绿带妒尺蛾幼虫对桫椤和小黑桫椤的趋向行为和寄主植物叶片的化学成分,能为桫椤和小黑桫椤的虫害防控筛选合适的引诱剂提供依据。

    绿带妒尺蛾幼虫采自贵州赤水桫椤国家级自然保护区。将野外在桫椤上采集到的初孵幼虫放置于SPX型智能生化培养箱(SPX-280, 宁波江南仪器厂)内饲喂成2龄幼虫,饲养条件:温度(26±1) ℃,相对湿度为(70±10)%,光周期为14 h 光照/10 h黑暗(7:00—20:00为光照期,20:00—7:00为黑暗期)。预实验表明:初孵幼虫活动能力弱,而幼虫虫龄越大,由于取食经历会形成记忆对饲养植物偏爱,故选择2龄幼虫进行饥饿处理(24 h)作为待测幼虫。

    直径12.0 cm的培养皿、直径1.5 cm的打孔器、绿色滤纸、镊子、圆形滤纸、养虫盒(长14.3 cm×宽8.5 cm×高4.0 cm)、黑色塑料薄膜、正己烷有机溶剂(天津市科密欧化学试剂有限公司)、HP6890/5975C气质联用仪GC/MS(美国安捷伦公司)、150 mL锥形瓶、胶头滴管等。

    采样点位于贵州赤水桫椤国家级自然保护区内大水沟(28°25′10.69″N,106°01′14.85″E),海拔为614 m。供试植物为桫椤、小黑桫椤、中华复叶耳蕨Arachniodes chinensis和肾蕨Nephrolepis auriculata。将野外采集到的当年生新鲜叶片带回室内低温保存,测定前将4种蕨类植物嫩叶用蒸馏水冲洗干净后,打孔器制作成1.5 cm大小的植物叶碟。对照为非寄主植物中华复叶耳蕨和肾蕨,以及绿色叶碟(外形与桫椤和小黑桫椤叶碟大小相同的绿色滤纸)。

    1.4.1   绿带妒尺蛾幼虫对植物叶碟与绿色叶碟的趋性选择

    光照和黑暗条件下,桫椤和小黑桫椤叶碟分别与绿色叶碟组合,各取2片叶碟共4个处理,1次1头,每处理重复测定60头。

    1.4.2   绿带妒尺蛾幼虫对不同蕨类植物的趋性选择

    黑暗条件下,桫椤和小黑桫椤分别与肾蕨和中华复叶耳蕨组合,共4个处理,1次1头,每处理重复测定50头;桫椤和小黑桫椤配对,各取2片叶碟,1次1头,重复测定65头。

    1.4.3   绿带妒尺蛾幼虫在4种蕨类植物共存时的趋性选择

    黑暗条件下,4种蕨类植物共存时,各取2片叶碟,“十字”交叉等距离放置于培养皿底部边缘,共1个处理,1次1头,重复测定120头。

    利用培养皿[17]测定绿带妒尺蛾幼虫对不同叶碟的选择频次。选用直径为12.0 cm的培养皿,在底部铺垫相同直径的圆形滤纸,测定前在滤纸上均匀喷洒少量蒸馏水保湿。将制作好的叶碟(图1)放置,以“十”字交叉排列等距离放在培养皿的底部边缘。放置完成后,在培养皿中央接入1头已饥饿的绿带妒尺蛾幼虫,以幼虫接触叶碟并停留(3 min)作为选择的标准(一直停留在待选择区域的幼虫则记为无效选择,不计数),每头观察15 min,记录观察幼虫对不同叶碟的趋向选择情况,每次测定结束后更换新的试虫,并清理培养皿中的实验材料,蒸馏水清洗干燥后用于下次测定[18]

    图 1  绿带妒尺蛾幼虫趋向选择装置
    Figure 1  Selection device for larvae of P. viridifasciata

    整个实验在室内进行,测定时间为13:00—17:00。黑暗条件将培养皿用黑色塑料薄膜遮盖。

    1.6.1   样品制定

    称取5 g桫椤和小黑桫椤新鲜嫩叶,分别放置于150 mL锥形瓶中。用胶头滴管提取10 mL的正己烷加入瓶中浸湿叶片,同时每间隔5 min振荡1次,30 min后加入2 mL的正己烷(分3次润洗)经无水硫酸钠过滤,获得粗提物。重复3次。放入−20 ℃的冰箱内密封低温保存。进样前,用99.99%的高纯氮气浓缩至1 mL。

    1.6.2   气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析

    使用HP6890/5975C气质联用仪 GC/MS(美国安捷伦公司)对2种桫椤植物嫩叶粗提物样品进行化学成分分析。色谱柱为Agilent HP-5MS(60 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱,初始温度70 ℃(保留2 min),以5 ℃·min−1升温至110 ℃,再以10 ℃·min−1升温至310 ℃,运行时间为45 min;汽化室温度为250 ℃;载气为高纯氦气(99.999%);柱前压为0.127 5 MPa,载气流量为1.0 mL·min−1,不分流,溶剂延迟时间为6 min。离子源为电子轰击离子源(EI),离子源温度为230 ℃;四极杆温度为150 ℃;电子能量为70 eV;发射电流为34.6 μA;倍增器电压为1 729V;接口温度为280 ℃;质量范围为29~500。

    用Excel统计数据,用R语言进行数据分析,使用卡方检验比较绿带妒尺蛾幼虫对不同处理的趋性选择,用Origin 2021作图。对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对Nist17和Wiley275标准质谱数据,用峰面积归一化法测定了各化学成分的相对含量。选择率=(选择虫数/测试虫总数)×100%[10]

    表1所示:无论在光照或黑暗条件下,绿带妒尺蛾幼虫对2种蕨类植物叶碟的选择频次均极显著大于对绿色叶碟的选择频次(P<0.01),说明寄主植物气味可对绿带妒尺蛾幼虫产生引诱作用。光照环境下对桫椤和小黑桫椤的选择率略低于黑暗环境下的选择率,可能是在视觉作用下,绿带妒尺蛾幼虫被外形相似的绿色叶碟所“蒙骗”,导致光照条件下选择绿色叶碟的频次略大于在黑暗下的选择频次,视觉可能在寄主选择中也发挥着一定得作用。

    表 1  绿带妒尺蛾幼虫对桫椤和小黑桫椤叶碟的趋性选择
    Table 1  Selection frequencies of P. viridifasciata larvae towards A. spinulosa and A. metteniana leaf discs respectively
    组合条件选择
    频次
    选择
    率/%
    χ2P显著性
    桫椤/绿色叶碟  光照4168.78.070.004 5**
    黑暗4981.724.079.306E−07**
    小黑桫椤/绿色叶碟光照4678.317.073.609E−05**
    黑暗4880.021.603.359E−06**
      说明:组合为实验组/对照组,绿色叶碟为对照,n=60;     **表示差异极显著(P<0.01)
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    表2显示:黑暗条件下,绿带妒尺蛾幼虫对桫椤分别与中华复叶耳蕨、肾蕨组合,小黑桫椤分别与中华复叶耳蕨、肾蕨组合的趋性选择均差异极显著(P<0.01),说明绿带妒尺蛾幼虫能依靠寄主植物气味信息准确识别寄主。绿带妒尺蛾幼虫对桫椤和小黑桫椤的选择频次无显著差异(P>0.05),说明2种植物的气味都可以对绿带妒尺蛾幼虫产生一定的吸引作用。

    表 2  绿带妒尺蛾幼虫在不同蕨类植物比较时的选择频次
    Table 2  Selection frequencies of P. viridifasciata larvae towards combinations of different ferns
    组合选择频次χ2P显著性
    实验组对照组
    桫椤/中华复叶耳蕨 41920.486.026E−06**
    桫椤/肾蕨     371311.520.000 6**
    小黑桫/中华复叶耳蕨391115.687.501E−05**
    小黑桫椤/肾蕨   371311.520.000 6**
    桫椤/小黑桫椤   36290.750.385 3ns
      说明:组合为实验组/对照组,n=50;**表示差异极显著      (P<0.01);ns表示差异不显著(P>0.05)
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    表3所示:黑暗条件下,在4种蕨类叶碟共存时,绿带妒尺蛾幼虫对不同蕨类叶碟的选择频次差异显著(P<0.05),其中对桫椤的选择频次最高,占总频次的38.3%。这说明在多植物环境下,绿带妒尺蛾幼虫可以准确判断最适宜的寄主植物,桫椤叶片所释放的挥发物对绿带妒尺蛾幼虫的定向选择具有更强烈的引诱作用。

    表 3  绿带妒尺蛾幼虫在4种蕨类植物共存条件下的选择反应
    Table 3  Selection responses of P. viridifasciata larvae towards different ferns presented together
    植物选择频次选择率/%χ2P显著性
    桫椤 46 38.3 15.8 0.001 2 **
    小黑桫椤 34 28.3
    中华复叶耳蕨 21 17.6
    肾蕨 19 15.8
      说明:n=120;*表示差异极显著(P<0.01)
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    通过GC-MS分析得到桫椤和小黑桫椤嫩叶浸提物的总离子流图TIC(图2)。初步确定2种桫椤的化学组分主要是烃类、醇类、醛类等,共检测出34种化合物。其中桫椤的化合物成分有23种,小黑桫椤的化合物成分有19种,同时2种桫椤共有物质有8种。由表4可知:2种桫椤的主要成分为烃类,桫椤中相对含量最高的是二十五烷(7.75%),小黑桫椤相对含量最高的是正二十七烷(8.84%)。其次是醇类,桫椤有5种,小黑桫椤2种,桫椤和小黑桫椤共有 γ-谷甾醇、豆甾烷醇,γ-谷甾醇(5.25%)和豆甾烷醇(8.21%)在小黑桫椤的挥发性成分中所占比例要高于桫椤,而叶醇(3.04%)仅在桫椤中存在。醛类、有机酸类、脂类、胺类在桫椤和小黑桫椤中的相对含量均相对较低,对甲氧基肉桂酸辛酯在桫椤中的相对含量仅有0.35%,庚醛在小黑桫椤中的相对含量仅为0.1%。说明在化合物组成上,桫椤和小黑桫椤既存在相似性,同时也具有一定的差异性。

    图 2  桫椤和小黑桫椤嫩叶浸提物总离子流图
    Figure 2  Total ion current diagram of the young leaves of A. spinulosa and A. metteniana
    表 4  寄主植物叶片浸提物成分分析
    Table 4  Analysis of chemical compounds of leaf extractive substances from host plants
    化合物CAS号相对含量/%化合物CAS号相对含量/%
    桫椤小黑桫椤桫椤小黑桫椤
    十二烷 dodecane 112-40-3 0.95±0.14 正三十二烷 dotriacontane 544-85-4 1.58±0.18 2.74±0.05
    二十二烷 docosane 629-97-0 0.63±0.08 叶醇 3-hexen-1-ol, (Z)- 928-96-1 3.04±1.52
    二十四烷 tetracosane 646-31-1 3.90±0.01 1-辛烯-3-醇 1-octen-3-ol 3391-86-4 0.43±0.13
    二十五烷 pentacosane 629-99-2 7.75±1.10 8.71±1.72 麦角甾烷醇 ergostanol 1694036 0.78±0.38
    二十六烷 hexacosane 630-01-3 5.76±0.35 γ-谷甾醇 gamma.-sitosterol 83-47-6 4.40±0.99 5.25±0.56
    二十七烷 heptacosane 593-49-7 6.08±0.35 豆甾烷醇 stigmastanol 19466-47-8 4.39±0.70 8.21±0.69
    二十八烷 octacosane 630-02-4 6.66±1.14 7.32±0.41 反式-2-己烯醛 2-hexenal, (E)- 6728-26-3 3.93±1.60
    二十九烷 nonacosane 630-03-5 4.21±0.25 壬醛 nonanal 124-19-6 0.70±0.25 1.80±1.00
    三十烷 triacontane 638-68-6 2.50±0.18 庚醛 heptanal 111-71-7 0.10±0.06
    三十一烷 hentriacontane 630-04-6 2.31±0.23 棕榈酸 n-hexadecanoic acid 21096 0.79±0.45
    正二十三烷 tricosane 638-67-5 1.53±0.06 2.15±0.54 α-亚麻酸 9,12,15-octadecatrienoic
    acid, (Z,Z,Z)-
    463-40-1 2.12±1.72
    正二十四烷 tetracosane 646-31-1 5.52±1.22 对甲氧基肉桂酸辛酯 2-propenoic acid,
    3-(4-methoxyphenyl)-, 2-ethylhexyl ester
    5466-77-3 0.35±0.17 0.40±0.29
    正二十六烷 hexacosane 630-01-3 8.06±1.43 对甲氧基肉桂酸异辛酯 2-ethylhexyl
    trans-4-methoxycinnamate
    83834-59-7 0.31±0.14
    正二十七烷 heptacosane 593-49-7 8.84±1.60 油酸酰胺 9-octadecenamide, (Z)- 301-02-0 0.58±0.17
    正二十九烷 nonacosane 630-03-5 6.73±0.39 十六烷基二甲基叔胺 dimethyl palmitamine 112-69-6 0.31±0.01
    正三十烷 triacontane 638-68-6 4.18±0.14 十八烷基二甲基叔胺 dimantine 124-28-7 0.93±0.11
    正三十一烷 hentriacontane 630-04-6 4.15±0.22 4-乙烯基-2-甲氧基苯酚 2-methoxy-
    4-vinylphenol
    7786-61-0 0.34±0.02
      说明:表中数据是平均值±标准差(n=3);若为空白,则说明未检测到或者相对含量很低
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    植物挥发性物质是一类组成复杂、分子量为100~200的混合物质,主要包括烷烃类、醇类、醛类、酸类等,并以一定的比例组成植物独有的化学指纹图谱对植食性昆虫产生嗅觉刺激[19]。本研究发现:桫椤和小黑桫椤叶片具有相似的化学指纹图谱,化合物成分组成都以烃类为主,其次是醇类、醛类、酸类、脂类等。植物挥发物在植食性昆虫寄主选择中发挥着重要作用[20]。植食性昆虫依据植物挥发物对特定植物进行定向选择,最终识别寄主植物进行取食或产卵[21]。本研究发现:在光照和黑暗环境下,桫椤和小黑桫椤分别与绿色叶碟组合时,绿带妒尺蛾幼虫对桫椤和小黑桫椤有明显的趋向选择,可见桫椤和小黑桫椤释放的气味对绿带妒尺蛾幼虫有引诱作用。植食性昆虫在寄主选择时,视觉和嗅觉发挥着重要作用[22]。如苹果实蝇Rhagoletis pomonella寻找寄主植物时,嗅觉会与视觉相互作用[23]。在光照条件下,寄主植物和绿色叶碟共存时,尽管外形相似,绿带妒尺蛾幼虫依然可以准确选择寄主植物。

    植物挥发物作为引导植食性昆虫的一种利他素,为植食性昆虫—植物二级营养关系建立过程中的信息化学物[24]。植食性昆虫凭借植物的化学图谱识别寄主植物和非寄主植物[25]。在一定距离内,昆虫通过嗅觉感官感知浓度达到一定阈值水平的化合物组成所代表的植物信息[26]。本次研究表明:当寄主植物和非寄主植物对比时,绿带妒尺蛾幼虫可以准确识别寄主植物,说明幼虫可被寄主植物所吸引[27]。如曹凤勤等[28]研究B型粉虱Bemisia tabaci对不同植物挥发物的行为反应结果表明:寄主植物挥发物对其有明显引诱作用。黄胸蓟马Thrips hawaiiensis对寄主植物挥发物有特殊偏好[29]。荔枝Litchi chinensis叶片气味对粗胫翠尺蛾Thalassodes immissaria具有导向作用[30]。当2种寄主植物对比时,绿带妒尺蛾幼虫对两者的选择并无差异,可能同为桫椤属蕨类植物,两者在化合物组成和含量上存在相似性。本研究通过GC-MS分析桫椤和小黑桫椤叶片的化合物成分证实,2种桫椤共有8种化合物。

    从进化的角度来看,昆虫面临着强大的选择压力,如在寻找寄主时,往往要面对复杂的气味环境[31]。昆虫的感觉系统和搜索机制已经进化到处理复杂的化学物质,从而有效地定位合适的宿主来最大化自身的适应性[32]。如在6种植物共存时,烟叶蛾初孵幼虫可准确识别最适宜寄主植物烟草Nicotiana tabacum[33]。本研究中,在4种蕨类都存在时,绿带妒尺蛾幼虫可准确识别最适宜寄主植物桫椤,说明对寄主气味存在高度的特异性和敏感性[34]。在桫椤中存在的叶醇具有一定的青草气味,同时也作为昆虫警报、集合利用的信息素,并且还可作为防御、忌避、通信和环境安全的重要工具[35-36],这可能是绿带妒尺蛾幼虫更趋向桫椤的原因之一。同时,在鳞翅目昆虫中,由于幼虫活动能力受限,主要依赖于成虫对寄主植物的产卵选择[37],如产卵假说认为雌性成虫更容易将卵产在有利于后代发育的寄主植物上[38]。田间采集情况发现,幼虫主要集中分布在桫椤叶上,但成虫具体如何产卵选择,还需进一步研究。

    绿带妒尺蛾幼虫鉴别寄主植物和非寄主的能力较强,能被桫椤和小黑桫椤所吸引,同时桫椤释放的挥发物对其具有更强烈的引诱作用。GC-MS结果显示:在桫椤中存在的叶醇和壬醛有望作为绿带妒尺蛾的引诱剂成分。

  • 图  1  CsAQP的二级结构单元分布

    Figure  1  Secondary structure unit distribution of CsAQP

    图  2  CsAQP家族蛋白质的三级结构预测

    Figure  2  Prediction of tertiary structure of CsAQP family proteins

    图  3  CsAQP基因家族成员的染色体位置分布

    Figure  3  Chromosomal location distribution of CsAQP gene family members

    图  4  CsAQP家族成员的基因结构(A)及保守基序预测分析(B)

    Figure  4  Gene structure (A) and conserved motif prediction (B) of CSAQP family members

    图  5  CsAQP基因家族成员上游顺式元件预测

    Figure  5  Prediction of upstream cis elements of CsAQP gene family members

    图  6  CsAQP家族成员蛋白的互作预测

    Figure  6  Prediction of interaction of CsAQP family protein

    表  1  CsAQP基因家族的命名及理化性质分析

    Table  1.   Nomenclature and physicochemical properties analysis of CsAQP gene family

    基因名称编码蛋白数量/个分子量/kD电荷残基数/个分子式理论等电点
    (−)(+)
    CsNIP1;127629.451420C1357H2126N346O373S69.58
    CsNIP2;128830.551522C1377H2170N368O391S139.40
    CsNIP2;226127.622017C1242H1956N324O359S146.05
    CsNIP3;124926.011215C1183H1877N311O327S108.86
    CsNIP4;126928.881617C1331H2100N326O358S157.67
    CsNIP5;129830.801518C1399H2200N366O394S118.63
    CsNIP6;130431.521820C1422H2263N369O413S128.26
    CsNIP7;126828.4588C1312H2018N320O360S136.88
    CsPIP1;129231.432425C1451H2228N370O395S87.67
    CsPIP1;229231.372324C1451H2225N367O392S97.68
    CsPIP1;328630.761724C1423H2188N364O380S99.23
    CsPIP1;429231.402425C1450H2225N369O395S87.67
    CsPIP2;128429.921717C1390H2107N347O374S87.04
    CsPIP2;228430.241418C1408H2132N354O371S98.78
    CsPIP2;328429.981718C1385H2132N348O377S97.64
    CsPIP2;428330.241920C1400H2143N353O377S97.63
    CsPIP2;527629.371421C1359H2101N351O356S109.36
    CsPIP2;627929.721318C1372H2131N351O368S98.97
    CsPIP2;728730.521622C1415H2152N362O377S89.11
    CsPIP2;828029.851521C1379H2123N357O368S89.24
    CsPIP2;919120.26916C939H1436N242O245S79.51
    CsPIP2;1029031.251521C1439H2226N372O381S139.10
    CsSIP1;124325.59712C1206H1865N287O307S99.41
    CsSIP2;123825.931121C1213H1901N303O309S810.00
    CsTIP1;125025.72128C1202H1836N292O326S45.64
    CsTIP1;225326.29118C1248H1908N298O319S36.03
    CsTIP1;325426.53148C1238H1856N296O337S85.30
    CsTIP2;124825.44107C1195H1813N281O323S55.66
    CsTIP2;225025.09107C1177H1815N277O320S45.39
    CsTIP3;128930.661818C1425H2155N369O378S57.17
    CsTIP4;124725.72128C1206H1858N296O316S56.01
    CsTIP5;125526.1299C1193H1847N303O331S126.88
    CsXIP1;131934.472023C1581H2487N393O425S218.27
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    表  2  CsAQP基因家族的亚细胞定位及跨膜结构预测

    Table  2.   Subcellular localization and transmembrane structure prediction of CsAQP gene family

    基因名称不稳定指数脂肪系数跨膜结构域亚细胞定位基因名称不稳定指数脂肪系数跨膜结构域亚细胞定位
    CsNIP1;128.94106.676细胞膜CsPIP2;633.09111.616细胞膜  
    CsNIP2;132.0293.446细胞膜CsPIP2;729.9694.916细胞膜  
    CsNIP2;237.9497.596细胞膜CsPIP2;833.56101.116细胞膜  
    CsNIP3;137.36108.556细胞膜CsPIP2;926.4093.044细胞膜  
    CsNIP4;132.33113.645细胞膜CsPIP2;1035.24103.906细胞膜  
    CsNIP5;135.9197.925细胞膜CsSIP1;132.96113.746细胞膜  
    CsNIP6;126.8299.245细胞膜CsSIP2;126.14113.915细胞膜/液泡
    CsNIP7;139.31101.986细胞膜CsTIP1;124.91110.527液泡   
    CsPIP1;130.9994.626细胞膜CsTIP1;225.33120.367液泡   
    CsPIP1;233.4995.626细胞膜CsTIP1;327.9899.136液泡   
    CsPIP1;329.7896.266细胞膜CsTIP2;131.99111.336液泡   
    CsPIP1;430.8594.285细胞膜CsTIP2;230.49118.326液泡   
    CsPIP2;131.9997.646细胞膜CsTIP3;129.98102.395液泡   
    CsPIP2;233.6197.966细胞膜CsTIP4;123.72123.247液泡   
    CsPIP2;330.51103.107细胞膜CsTIP5;134.10103.376细胞膜/液泡
    CsPIP2;426.21102.126细胞膜CsXIP1;146.41108.157细胞膜  
    CsPIP2;529.51103.516细胞膜
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    表  3  MEME程序识别CsAQP相关基序信息

    Table  3.   MEME program recognizes CSAQP related base sequence information

    基序基序序列基序长度/个
    Motif 1 GISGGHJNPAVTFGLFLARKISLVRAILYIIAQCLGAICAC 41
    Motif 2 KRNARDSHVPVLAPJPIGFAVFLVHLATGPITGTSMNPARS 41
    Motif 3 KDYKDPPPAPLIDPEELTKWSFYRAIIAEFVATLLFLYVTVLTVIGYNRQ 50
    Motif 4 KAWDDHWIYWVGPFIGAAJAALYYQFILR 29
    Motif 5 LVKAFQKAYYNRYGGGANSLADGYSKGTGLAAEIIGTFVLVYTVFSATDP 50
    Motif 6 DGNTCGGVGILGIAWAFGGMIFVLVYCTA 29
    Motif 7 RFEEATSPSAJRALLAEFISTFJLVFAGVGS 31
    Motif 8 FGTAPGVSALQAFVLEIIITFGLVYVVY 28
    Motif 9 MEGKEEDVRLGANKFNERQPI 21
    Motif 10 AVKALGSFRSS 11
    Motif 11 NQKYNGVVTLIGIAAVAGLIVMVMIYSVG 29
    Motif 12 FGAAVIFN 8
    Motif 13 KLTSDGAATPAGLVVAAIAHAFALFVAVS 29
    Motif 14 TAAQSQDD 8
    Motif 15 FTLKGVFHPIM 8
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    表  4  CsAQP基因扩增关系及Ka/Ks比率

    Table  4.   Amplification relationship and Ka/Ks ratio of CsAQP gene in Cucumber

    串联重复基因对KaKsKa/Ks串联重复基因对KaKsKa/Ks
    CsPIP1;2&CsPIP1;10.0400.6100.659CsPIP2;6&CsPIP2;30.1350.6920.196
    CsPIP1;2&CsPIP1;40.3600.6560.055CsPIP2;2&CsPIP2;30.0731.0460.070
    CsPIP1;1&CsPIP1;40.0050.0530.096
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-05-10
  • 修回日期:  2021-10-13
  • 网络出版日期:  2022-03-25
  • 刊出日期:  2022-03-25

黄瓜AQP基因家族的鉴定与生物信息学分析

doi: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210361
    基金项目:  浙江省自然科学基金资助项目(LY18C150004, LY18C150003)
    作者简介:

    赖梦霞(ORCID: 0000-0002-5622-2724),从事蔬菜分子生物学研究。E-mail: 2295803738@qq.com。通信作者:

    樊怀福(ORCID: 0000-0002-7308-0094),教授,从事蔬菜逆境生物学研究。E-mail: fanhf@zafu.edu.cn

  • 中图分类号: S642.2

摘要:   目的  深入研究黄瓜Cucumis sativus水通道蛋白(aquaporin, AQP)基因家族(CsAQP)的相关功能。  方法  通过全基因组分析技术鉴定其家族成员,对其蛋白质理化性质、系统进化关系、选择压力、基因结构、保守基序、顺式作用元件、蛋白质互作进行分析。  结果  黄瓜基因组共有33个AQP基因,含有2~5个数量不等的外显子,在染色体上不均匀分布;根据物种进化关系将黄瓜AQP基因家族划分为5个亚家族;基因组重复序列分析表明:5号和6号染色体上各有2~3对基因串联重复;计算这些基因的同义替换(synonymous, Ks)和非同义替换(nonSynonymous, Ka)的比率,结果显示均小于1,表明其进化受纯化选择作用;顺式作用调控元件分析发现,大部分基因启动子区所含元件与激素调节、光响应、胁迫密切相关。  结论  通过黄瓜全基因组扫描,获得黄瓜基因组的33个AQP家族成员,分属于5个亚族,映射于7条染色体上。上游启动子区含逆境相关作用元件,且部分基因参与串联复制,历经纯化选择。图6表4参26

English Abstract

杜燚, 杨卫诚, 何琴琴, 等. 绿带妒尺蛾对寄主的趋性选择及寄主植物叶片的化学成分分析[J]. 浙江农林大学学报, 2023, 40(1): 89-96. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220168
引用本文: 赖梦霞, 杜长霞, 樊怀福. 黄瓜AQP基因家族的鉴定与生物信息学分析[J]. 浙江农林大学学报, 2022, 39(2): 318-328. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210361
DU Yi, YANG Weicheng, HE Qinqin, et al. Host selection of Phthonoloba viridifasciata and analysis of chemical compounds in leaves of host plants[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2023, 40(1): 89-96. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20220168
Citation: LAI Mengxia, DU Changxia, FAN Huaifu. Identification and bioinformatics analysis of AQP gene family in Cucumis sativus[J]. Journal of Zhejiang A&F University, 2022, 39(2): 318-328. DOI: 10.11833/j.issn.2095-0756.20210361
  • 植物常遭受由生物或非生物环境因子所带来的伤害。胁迫因子在抑制植物生长发育的同时,亦触发其系统性防御反应。例如,为适应干旱胁迫,植物在漫长的进化过程中演化出一系列调控水分吸收、关闭气孔降低水分散失量等机制。深入了解植物对外界的防御反应,对提高植物抗性和农业生产具有十分重要的意义。目前,研究者已在不同植物中发现多个响应外界环境胁迫的基因家族,如荔枝Litchi chinensis Dof基因家族[1]、黄瓜 Cucumis sativus DnaJ基因家族[2]、水稻Oryza sativa ABC1基因家族[3]MIP基因家族等。其中MIP家族的各种蛋白质成员具有独特和特定的运输功能,是近年来的研究热点。水通道蛋白(AQP)家族属于跨膜通道蛋白MIP超家族[4]。大量研究表明:AQP参与水分子跨膜、调节植物细胞渗透势及响应多种逆境胁迫。AQP已知分类主要为PIPs (plasma membrane intrinsic proteins)、TIPs (tonoplast intrinsic proteins)、NIPs (noduLin 26-like intrinsic proteins)、SIPs (small and basic intrinsic proteins)、XIPs (uncharacterized intrinsic proteins)以及HIPs (hybrid intrinsic proteins)、GIPs (glycerolfacilitato) [5]。 POU等[6]研究发现:拟南芥Arabidopsis thalianaATPIP2;7在盐胁迫后,表达丰度降低;烟草Nicotiana tabacumNtPIP1;1和NtPIP2;1在植株根系的水分运输中起重要作用[7]; 拟南芥ATPIP2;1在胁迫条件下,其胞吞作用受到不同程度的影响[8];烟草NtAQP1参与二氧化碳的渗透[9];拟南芥[10]、玉米Zea mays[11]等植物的TIP亚家族参与植物跨细胞长距离运输水分的过程。随着越来越多物种的测序的完成,在拟南芥、水稻等模式植物上的AQP基因家族信息已比较明确,在番茄Lycopersicon esculentum [12]、龙眼Ferocactus viridescens[13]等植物中也识别出许多AQP基因家族。黄瓜是世界性的重要蔬菜作物,但因其根系分布较浅,因此对水分、盐渍化等胁迫敏感。本研究采用生物信息学方法得到33个CsAQP基因家族的氨基酸序列,在染色体上定位了CsAQP基因家族,对编码的蛋白质理化性质、结构特点等进行分析比较,并建立系统进化树,为CsAQP基因功能研究和响应逆境机制提供理论基础和参考。

    • 所用各物种AQP基因家族数据及黄瓜基因组数据集均来源于美国国家生物信息中心 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),并从Pfam数据库中下载种子文件PF00230,于BIO-Linux系统中使用hmmsearch扫描黄瓜蛋白数据库,得到含MIP蛋白保守结构域的基因[14]。运用Perl程序对其进一步筛选(e值为1E−20),利用hmmbuild构建蛋白质特异保守结构域的隐马可夫模型。基于新隐马可夫模型,使用hmmsearch再次扫描黄瓜蛋白数据库,保留结果。同时,以拟南芥AQP基因家族序列及番茄、马铃薯Solanum tuberosum XIPs序列为检索靶标,BLAST搜索黄瓜基因组数据库(e值为1E−10)。两方面匹配所得的序列取并集(同一基因的不同转录本,仅择其一)当作CsAQP候选。所有候选AQP分别被提交至Interpro数据库及美国国家生物信息中心CDD数据库进行验证,剔除冗余和不匹配的氨基酸序列,最终获得CsAQP基因家族成员。

    • 通过ClustalW对黄瓜、模式植物拟南芥和水稻的AQP家族成员以及番茄、马铃薯XIPs序列进行比对[15],采用MEGA-7的最大似然法(maximum likelihood, ML),将自展法系数(Booststrap)设置为1 000次,进行重复实验,构建进化树。结合基因注释信息及物种进化结果,参考其他植物水通道蛋白命名法对CsAQP基因家族成员系统命名。

    • 通过筛选到的CsAQP基因的序列信息,利用MG2C软件将其定位于染色体上。采用ExPASy-ProtParam在线预测CsAQP蛋白的分子量、电荷残基数、分子式、理论等电点、不稳定指数及脂肪系数;利用ExPASy-ProtScale在线分析其亲/疏水性;使用Plant-mPLoc 2.0预测亚细胞定位;使用SignalP-5.0预测其信号肽;采用TMHMM-2.0预测分析其跨膜结构。

    • 使用SOPMA对其二级结构进行预测分析,并基于SWISS-MODEL进行蛋白质三维结构建模。

    • 通过GSDS 2.0可视化CsAQP基因家族成员的内含子-外显子的分布,并利用MEME 5.3.3在线工具对CsAQP家族蛋白的保守基序进行分析,限值为15。采用TBtools绘制示意图。

    • 利用DNAMAN对CsAQP蛋白成员进行多序列比对,并使用weblogo在线软件绘制seqlogo图,其特征高度反映相对的变化频率。

    • 从黄瓜基因组中提取CsAQP家族成员起始密码子上游1 500 bp的序列,利用Plant CARE数据库分析启动子顺式作用元件;利用TBtools对其结果可视化。

    • 提取转录本的CDS序列,建立目标序列数据库,多序列比对,构建索引,运行Perl程序,进一步筛选比对结果(筛选标准:序列两两之间的相似性大于75%,且2条序列比对上的长度大于较长序列的75%[16]),最终获得串联重复基因对。采用ClustalW对各对串联重复基因进行全序列比对,并使用KaKs_Calculator 2.0计算其同义替换和非同义替换间的比率。

    • 使用STRING对黄瓜AQP蛋白成员进行互作预测,选取模式植物拟南芥作为参考,探究CsAQP蛋白之间的作用关系。

    • 通过黄瓜完备基因集与参考基因集BLAST比对,并利用Domain HMM模型进行HMMRER搜索,两者取并集[15]。筛选鉴定其含有特定结构域的序列,最终获得33个CsAQP基因家族成员。通过 ClustalW对黄瓜、拟南芥和水稻的AQP家族成员以及番茄、马铃薯XIPs序列进行比对并构建系统进化树,结果显示:CsAQP基因家族成员被分成5个亚家族,分别为PIP、NIP、TIP、SIP、XIP。其中,PIP亚族的CsAQP基因家族成员数量最多,有14个成员;NIP与TIP亚族的CsAQP基因家族成员数量等同,均为8个;SIP亚族有2个成员;XIP亚族的数量最少,仅1个成员。黄瓜水通道蛋白的系统进化聚类模式与参考植物相似,大部分CsAQP基因家族成员呈现出与同一亚家族中的其他成员聚集的趋势。根据多物种进化结果和黄瓜单物种进化结果,结合已有的同源基因对CsAQP基因家族成员命名。具体结果见表1

      表 1  CsAQP基因家族的命名及理化性质分析

      Table 1.  Nomenclature and physicochemical properties analysis of CsAQP gene family

      基因名称编码蛋白数量/个分子量/kD电荷残基数/个分子式理论等电点
      (−)(+)
      CsNIP1;127629.451420C1357H2126N346O373S69.58
      CsNIP2;128830.551522C1377H2170N368O391S139.40
      CsNIP2;226127.622017C1242H1956N324O359S146.05
      CsNIP3;124926.011215C1183H1877N311O327S108.86
      CsNIP4;126928.881617C1331H2100N326O358S157.67
      CsNIP5;129830.801518C1399H2200N366O394S118.63
      CsNIP6;130431.521820C1422H2263N369O413S128.26
      CsNIP7;126828.4588C1312H2018N320O360S136.88
      CsPIP1;129231.432425C1451H2228N370O395S87.67
      CsPIP1;229231.372324C1451H2225N367O392S97.68
      CsPIP1;328630.761724C1423H2188N364O380S99.23
      CsPIP1;429231.402425C1450H2225N369O395S87.67
      CsPIP2;128429.921717C1390H2107N347O374S87.04
      CsPIP2;228430.241418C1408H2132N354O371S98.78
      CsPIP2;328429.981718C1385H2132N348O377S97.64
      CsPIP2;428330.241920C1400H2143N353O377S97.63
      CsPIP2;527629.371421C1359H2101N351O356S109.36
      CsPIP2;627929.721318C1372H2131N351O368S98.97
      CsPIP2;728730.521622C1415H2152N362O377S89.11
      CsPIP2;828029.851521C1379H2123N357O368S89.24
      CsPIP2;919120.26916C939H1436N242O245S79.51
      CsPIP2;1029031.251521C1439H2226N372O381S139.10
      CsSIP1;124325.59712C1206H1865N287O307S99.41
      CsSIP2;123825.931121C1213H1901N303O309S810.00
      CsTIP1;125025.72128C1202H1836N292O326S45.64
      CsTIP1;225326.29118C1248H1908N298O319S36.03
      CsTIP1;325426.53148C1238H1856N296O337S85.30
      CsTIP2;124825.44107C1195H1813N281O323S55.66
      CsTIP2;225025.09107C1177H1815N277O320S45.39
      CsTIP3;128930.661818C1425H2155N369O378S57.17
      CsTIP4;124725.72128C1206H1858N296O316S56.01
      CsTIP5;125526.1299C1193H1847N303O331S126.88
      CsXIP1;131934.472023C1581H2487N393O425S218.27
    • 理化性质分析(表1表2)发现:CsAQP家族成员编码191~319个氨基酸,分子量为20.26~34.47 kDa,仅CsNIP亚族的氨基酸数目与分子量呈正相关;其电荷残基数差异较大,理论等电点为5.30~10.00,多数CsAQP家族成员富含碱性氨基酸。除CsXIP1;1外,其余CsAQP家族成员蛋白质不稳定指数为23.72~39.31,小于40.00,为稳定蛋白。所有成员具有相对较高的脂肪系数,有利于其在应对环境变化中正常发挥功能。CsAQP家族成员含4~7个跨膜域,多数成员含6个。Plant-mPLoc 2.0预测结果显示:大部分成员主要定位于细胞膜,少数位于液泡,个别为两者皆有。SignalP-5.0和ExPASy-ProtScale在线预测结果表明:上述33个CsAQP家族基因均无信号肽,具疏水性。

      表 2  CsAQP基因家族的亚细胞定位及跨膜结构预测

      Table 2.  Subcellular localization and transmembrane structure prediction of CsAQP gene family

      基因名称不稳定指数脂肪系数跨膜结构域亚细胞定位基因名称不稳定指数脂肪系数跨膜结构域亚细胞定位
      CsNIP1;128.94106.676细胞膜CsPIP2;633.09111.616细胞膜  
      CsNIP2;132.0293.446细胞膜CsPIP2;729.9694.916细胞膜  
      CsNIP2;237.9497.596细胞膜CsPIP2;833.56101.116细胞膜  
      CsNIP3;137.36108.556细胞膜CsPIP2;926.4093.044细胞膜  
      CsNIP4;132.33113.645细胞膜CsPIP2;1035.24103.906细胞膜  
      CsNIP5;135.9197.925细胞膜CsSIP1;132.96113.746细胞膜  
      CsNIP6;126.8299.245细胞膜CsSIP2;126.14113.915细胞膜/液泡
      CsNIP7;139.31101.986细胞膜CsTIP1;124.91110.527液泡   
      CsPIP1;130.9994.626细胞膜CsTIP1;225.33120.367液泡   
      CsPIP1;233.4995.626细胞膜CsTIP1;327.9899.136液泡   
      CsPIP1;329.7896.266细胞膜CsTIP2;131.99111.336液泡   
      CsPIP1;430.8594.285细胞膜CsTIP2;230.49118.326液泡   
      CsPIP2;131.9997.646细胞膜CsTIP3;129.98102.395液泡   
      CsPIP2;233.6197.966细胞膜CsTIP4;123.72123.247液泡   
      CsPIP2;330.51103.107细胞膜CsTIP5;134.10103.376细胞膜/液泡
      CsPIP2;426.21102.126细胞膜CsXIP1;146.41108.157细胞膜  
      CsPIP2;529.51103.516细胞膜
    • 蛋白质的二级结构是有规则重复的构象,预测所得结构单元有4种(图1),分别为α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲。结果发现:33条氨基酸序列中,CsNIP4;1、CsPIP2;5、CsSIP1;1、CsSIP2;1、CsXIP1;1以α-螺旋为主要组成部分,其余28个成员则以无规则卷曲为主要组成部分,β-转角结构散布于CsAQP蛋白序列中。

      图  1  CsAQP的二级结构单元分布

      Figure 1.  Secondary structure unit distribution of CsAQP

      蛋白质三维结构模型由软件SWISS-MODEL建立。通过SWISS-MODEL对黄瓜的33条氨基酸序列进行同源建模。结果表明:绝大多数CsAQP蛋白序列具有十分相似的三维结构,其结构模型如图2所示,各亚家族内成员的相似度较亚家族之间更高。

      图  2  CsAQP家族蛋白质的三级结构预测

      Figure 2.  Prediction of tertiary structure of CsAQP family proteins

    • 图3可知:CsAQP基因家族成员映射于1~7号染色体,其中1号染色体上仅含CsTIP3;1;2号、4号、7号染色体各有2个水通道蛋白家族成员;5号染色体所含数量最多,定位到10个CsAQP基因家族成员;6号染色体次之,分布9个CsAQP家族基因。另外,5号染色体上的CsPIP1;1、CsPIP1;2和CsPIP1;4,6号染色体上的CsPIP2;1、CsPIP2;2、CsPIP2;3、CsPIP2;6和CsPIP2;9在各自染色体上形成基因簇,且这些基因之间的同源性较高,推测其功能相对保守。

      图  3  CsAQP基因家族成员的染色体位置分布

      Figure 3.  Chromosomal location distribution of CsAQP gene family members

    • 为深入探究黄瓜AQP基因结构功能特征及其氨基酸序列的保守基序,对其33个家族成员进行内含子、外显子数目和位置及保守基序进行分析。结果如图4A所示:成员外显子数目为2~5:NIP亚家族中,除了CsNIP3;1和CsNIP5;1外显子数目为4个之外,其余外显子数目均为5个;PIP亚家族成员含3~4个外显子及2~4个内含子;SIP亚家族成员的外显子与内含子数目均为3个,表现出高度的一致性;TIP亚家族中,CsTIP1;1和CsTIP1;2的基因结构呈现“1个外显子+1个内含子+1个外显子”的模式,两者归属于同一亚家族的次级分组,推测这2个成员在功能及进化上有一定的相似性,其余6个亚家族成员均含有3个外显子;CsXIP1;1的基因结构与CsTIP1;1、CsTIP1;2类似基因结构在不同亚家族之间存在明显差异,同一亚家族内的差异相对较小,反映出不同亚家族具有不同功能。

      图  4  CsAQP家族成员的基因结构(A)及保守基序预测分析(B)

      Figure 4.  Gene structure (A) and conserved motif prediction (B) of CSAQP family members

      利用MEME 5.3.3对CsAQP基因家族进行保守基序分析,可视化结果如图4B,相关基序序列如表3。结果表明:Motif 4的保守序最强;除CsSIP亚族无Motif 1,其余成员均有Motif 1分布。有些Motifs为个别亚家族所特有,如Motif 3、Motif 5、Motif 10只分布于CsPIP亚族中,Motif 9仅为CsPIP亚族的分组1所特有;Motif 13仅存在于在CsTIP亚族中。上述结果表明:同一进化分支上的成员间保守结构域相似性更高。这些CsAQP基因家族成员间具有相同或特有的Motif,导致了它们之间相似或具备其特有的功能分化。

      表 3  MEME程序识别CsAQP相关基序信息

      Table 3.  MEME program recognizes CSAQP related base sequence information

      基序基序序列基序长度/个
      Motif 1 GISGGHJNPAVTFGLFLARKISLVRAILYIIAQCLGAICAC 41
      Motif 2 KRNARDSHVPVLAPJPIGFAVFLVHLATGPITGTSMNPARS 41
      Motif 3 KDYKDPPPAPLIDPEELTKWSFYRAIIAEFVATLLFLYVTVLTVIGYNRQ 50
      Motif 4 KAWDDHWIYWVGPFIGAAJAALYYQFILR 29
      Motif 5 LVKAFQKAYYNRYGGGANSLADGYSKGTGLAAEIIGTFVLVYTVFSATDP 50
      Motif 6 DGNTCGGVGILGIAWAFGGMIFVLVYCTA 29
      Motif 7 RFEEATSPSAJRALLAEFISTFJLVFAGVGS 31
      Motif 8 FGTAPGVSALQAFVLEIIITFGLVYVVY 28
      Motif 9 MEGKEEDVRLGANKFNERQPI 21
      Motif 10 AVKALGSFRSS 11
      Motif 11 NQKYNGVVTLIGIAAVAGLIVMVMIYSVG 29
      Motif 12 FGAAVIFN 8
      Motif 13 KLTSDGAATPAGLVVAAIAHAFALFVAVS 29
      Motif 14 TAAQSQDD 8
      Motif 15 FTLKGVFHPIM 8
    • 利用DNAMAN对黄瓜水通道蛋白的氨基酸序列进行多序列比对,对其一致性分析,所有CsAQP成员序列、CsNIP序列、CsPIP序列、CsTIP序列、CsSIP序列一致性分别为35.04%、47.66%、73.38%、58.36%、29.27%。CsAQP蛋白具保守性,且有多个保守位点,总体而言其序列保留相对变异性。CsNIP中序列N-端保留变异性,而近C-端具有高度保守性。CsPIP序列的保守频率高于其他几个亚家族。CsTIP序列的N、C两端均具保守性,但近N-端有部分序列保留变异性。

    • 为了进一步研究CsAQP基因启动子区的顺式作用元件,本研究使用PlantCARE在线工具分析了CsAQP基因家族转录起始位点的上游1 500 bp区域。鉴定出的元件与激素、光响应及抗逆性相关,大部分CsAQP基因家族含WUN-motif作用元件,且所有成员的转录起始位点上游均含TATA盒以及CAAT-box。其中,BOX 4、G-Box、GT1-motif、LAMP-element、ACE、GATA-motif、I-box、AE-box、TCCC-motif、chs-CMA1a、3-AF1 binding site、sp1、Box Ⅱ、CAG-motif、ACA-motif、GA-motif、L-box、MRE (与光反应相关的MYB结合位点)元件功能涉及调控植物光反应;ABRE为脱落酸应答元件;MBSI为MYB结合位点,参与植物体中类黄酮生物的合成;AUXRE(生长素相关)、AUXRR-CORE(生长素相关)、TGA-element(生长素相关)、GARE-motif(赤霉素相关)、P-box(赤霉素相关)、ERE(乙烯应答相关)、CGTCA(茉莉酸甲酯相关)、TCA-element(水杨酸反应相关)元件功能涉及植物激素调控;TC-rich repeats(参与防御和应激反应)、LTR(响应低温)、MBS(MYB结合位点,与干旱相关)、circadian(参与昼夜节律控制)、MSA-like(参与细胞周期调节)、HD-ZIP Ⅰ(参与栅栏叶肉组织的分化)、CAT-box(与分生组织表达有关)、motif I(调节根特异性)、RY-element(种子特异性调控相关)元件功能涉及植物的应激反应以及生长发育。

      从元件类型来看,光响应元件种类最多,于各CsAQP基因启动子区域均有分布。从单个元件的具体分布来看,91%家族成员启动子区分布BOX 4;61%成员启动子区含ABRE元件。从单个基因家族成员来看,CsXIP1;1作为新成员,其基因启动子富含激素调控相关元件,例如ERE、P-box、TGACG元件,且含与胚乳表达相关的GCN4-motif元件;CsNIP2;1、CsNIP5;1、CsNIP6;1、CsNIP7;1、CsPIP1;2、CsPIP1;3、CsPIP2;7、CsPIP2;8、CsSIP1;1、CsTIP3;1含1~3个TC-rich repeats元件,涉及植物防御及应激;CsNIP1;1、CsNIP2;2、CsNIP3;1、CsNIP7;1、CsPIP1;3、CsPIP1;4、CsPIP2;1、CsPIP2;2、CsPIP2;3、CsPIP2;8、CsPIP2;9、CsTIP1;2、CsTIP1;3、CsTIP2;1基因启动子区域都含有MBS元件,表明这些基因有可能与MYB转录因子结合,参与响应干旱胁迫的调控。CsAQP基因启动子区的部分元件展示如图5

      图  5  CsAQP基因家族成员上游顺式元件预测

      Figure 5.  Prediction of upstream cis elements of CsAQP gene family members

    • 已有文献表明:串联重复偏向于扩增膜蛋白功能基因以及与生物和非生物胁迫紧密相关的基因[17]。为探究黄瓜AQP基因家族在进化过程中因串联复制之后基因的偏向性保留和选择压力的形式,对33个家族成员进行分析。分析结果显示:黄瓜33个CsAQP基因家族成员之间,5号、6号这2条染色体上共有5对基因具有串联复制关系,分别为CsPIP1;2&CsPIP1;1、CsPIP1;2&CsPIP1;4、CsPIP1;1&CsPIP1;4、CsPIP2;6&CsPIP2;3、CsPIP2;2&CsPIP2;3。Ka/Ks分析(表4)发现:5个基因对的Ka/Ks均小于1,表明这些重复基因对经历纯化选择,消灭群体有害突变,且在进化中较为保守,结构较为稳定,功能具有一致性。

      表 4  CsAQP基因扩增关系及Ka/Ks比率

      Table 4.  Amplification relationship and Ka/Ks ratio of CsAQP gene in Cucumber

      串联重复基因对KaKsKa/Ks串联重复基因对KaKsKa/Ks
      CsPIP1;2&CsPIP1;10.0400.6100.659CsPIP2;6&CsPIP2;30.1350.6920.196
      CsPIP1;2&CsPIP1;40.3600.6560.055CsPIP2;2&CsPIP2;30.0731.0460.070
      CsPIP1;1&CsPIP1;40.0050.0530.096
    • 为进一步了解CsAQP成员蛋白的互作关系,对33个成员的氨基酸序列进行蛋白质互作预测。结果如图6所示:CsPIP1;1、CsPIP1;2、CsPIP1;3、CsPIP1;4、CsTIP2;2均与CsNIP1;1存在互作关系,且关联性较强。另外,CsSIP2;1与CsTIP、CsPIP、CsNIP亚家族间也有一定的互作关系。上述结果表明:部分成员间存在互作关联性,但各成员间的具体网络机制并不清晰,仍需进一步研究。

      图  6  CsAQP家族成员蛋白的互作预测

      Figure 6.  Prediction of interaction of CsAQP family protein

    • 本研究鉴定了黄瓜基因组中的33个CsAQP基因,CsAQP基因的数量与水稻及模式植物拟南芥的数量相似。这表明CsAQP基因在植物中有形成多基因家族的可能。基因进化的主要驱动力来源于基因扩增,而串联复制是基因扩增的方式之一。有研究表明:响应多种逆境胁迫的基因扩增与串联复制密切相关[17]。这类基因通常是剂量不敏感基因或位于代谢途径两端。方璐等[18]在白菜Brassica rapa中研究发现:与膜蛋白功能相关以及抗逆相关、新陈代谢相关的基因都发生了串联复制,这些相关基因在诱导防御反应机制中发挥作用。本研究发现:在黄瓜5号和6号染色体中共发现5对串联重复基因,这表明串联复制参与黄瓜CsAQP基因的扩增。

      系统进化分析表明:CsAQP基因可以清晰地分为5个亚家族,相对于拟南芥、水稻,多1个新成员(CsXIP1;1)。有研究表明:植物中XIPs序列的分析及其功能方面的鉴定有助于更好地探究AQPs进化过程的分类[19]。同时,外显子与内含子结构的分析也有益于探究植物基因家族内的进化关系[20]。从预测结果中可以看出:基因间结构差别明显,但聚类较近的CsAQP基因其结构存在相似。CsNIP亚家族含有的外显子数量相对多于其他4个亚家族,这与JOHANSON等[21]在拟南芥上的发现一致。基因家族成员在编码氨基酸数量、分子量、理论等电点等生理生化性质也随CsAQP基因编码序列的长短及碱基比例的不同而表现出一定差异。

      MEME (multiple EM for motif elicitation)分析发现:基序组成总体保守,例如所有的CsAQP基因都有一个共同的保守基序(KAWDDHWIYWVGPFIGAAJAALYYQFILR),但不同的亚家族之间也有其独特的保守基序,这为CsAQP基因家族的细分提供一定的依据。分别以限值10、15、20为条件,再次预测CsAQP基因家族的保守基序,在几个重复对之间均能发现某些Motif的得失,与ZHOU等[22]ClDof基因家族所得出的结论相似。初步分析这些Motif可能与CsAQP基因的功能分化相关。此外,CsAQP基因家族成员基因启动子的顺式调控元件种类丰富,包括黄瓜抗逆相关的元件以及黄瓜生长发育相关的作用元件,如所有CsAQP基因家族成员基因启动子区都含有多种与光响应相关的元件。因此,这33个基因可能参与黄瓜光反应调控。CsPIP1;2、CsNIP2;2、CsNIP3;1、CsTIP2;1、CsTIP3;1中含有HD-ZIP I元件,可能参与叶肉组织分化。

      水通道蛋白在低等植物和高等植物中均有所研究[23],其中高等植物水通道蛋白研究相对较多。拟南芥作为模式植物,其AQP在低温、干旱等逆境下的相关研究已被陆续报道。许多植物AQP成员间的互作关联性也得到了验证,如番茄[24]、水稻和玉米[25]。与这些植物AQP相比,CsAQP基因功能的研究相对缓慢但却取得了一定进展。已有研究显示:CsAQP在胁迫反应中可能发挥重要作用。陈露倩等[26]研究发现:CsPIP2;4于干旱胁迫处理下,其表达量在胁迫后2 h达到相对最高值,而随胁迫时间的延长,CsPIP2;4表达丰度显著下降。然而,目前对CsAQP基因的具体作用机制了解尚浅,尤其是不清楚CsAQP基因对非生物胁迫的调控机制。本研究通过对CsAQP基因结构、理化性质、保守基序、亚细胞定位与系统进化树等分析,将有助于鉴定其生物学功能,为进一步探究其功能特性提供了一定的理论依据。此外,对于CsAQP基因在整个生长发育中的调控网络以及与各种环境胁迫因子的关联性也有待探索。

参考文献 (26)

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