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植物常遭受由生物或非生物环境因子所带来的伤害。胁迫因子在抑制植物生长发育的同时，亦触发其系统性防御反应。例如，为适应干旱胁迫，植物在漫长的进化过程中演化出一系列调控水分吸收、关闭气孔降低水分散失量等机制。深入了解植物对外界的防御反应，对提高植物抗性和农业生产具有十分重要的意义。目前，研究者已在不同植物中发现多个响应外界环境胁迫的基因家族，如荔枝Litchi chinensis Dof基因家族[1]、黄瓜 Cucumis sativus DnaJ基因家族[2]、水稻Oryza sativa ABC1基因家族[3]及MIP基因家族等。其中MIP家族的各种蛋白质成员具有独特和特定的运输功能，是近年来的研究热点。水通道蛋白(AQP)家族属于跨膜通道蛋白MIP超家族[4]。大量研究表明：AQP参与水分子跨膜、调节植物细胞渗透势及响应多种逆境胁迫。AQP已知分类主要为PIPs (plasma membrane intrinsic proteins)、TIPs (tonoplast intrinsic proteins)、NIPs (noduLin 26-like intrinsic proteins)、SIPs (small and basic intrinsic proteins)、XIPs (uncharacterized intrinsic proteins)以及HIPs (hybrid intrinsic proteins)、GIPs (glycerolfacilitato) [5]。 POU等[6]研究发现：拟南芥Arabidopsis thaliana中ATPIP2;7在盐胁迫后，表达丰度降低；烟草Nicotiana tabacum中NtPIP1;1和NtPIP2;1在植株根系的水分运输中起重要作用[7]; 拟南芥ATPIP2;1在胁迫条件下，其胞吞作用受到不同程度的影响[8]；烟草NtAQP1参与二氧化碳的渗透[9]；拟南芥[10]、玉米Zea mays[11]等植物的TIP亚家族参与植物跨细胞长距离运输水分的过程。随着越来越多物种的测序的完成，在拟南芥、水稻等模式植物上的AQP基因家族信息已比较明确，在番茄Lycopersicon esculentum [12]、龙眼Ferocactus viridescens[13]等植物中也识别出许多AQP基因家族。黄瓜是世界性的重要蔬菜作物，但因其根系分布较浅，因此对水分、盐渍化等胁迫敏感。本研究采用生物信息学方法得到33个CsAQP基因家族的氨基酸序列，在染色体上定位了CsAQP基因家族，对编码的蛋白质理化性质、结构特点等进行分析比较，并建立系统进化树，为CsAQP基因功能研究和响应逆境机制提供理论基础和参考。
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所用各物种AQP基因家族数据及黄瓜基因组数据集均来源于美国国家生物信息中心 (
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ )，并从Pfam数据库中下载种子文件PF00230，于BIO-Linux系统中使用hmmsearch扫描黄瓜蛋白数据库，得到含MIP蛋白保守结构域的基因[14]。运用Perl程序对其进一步筛选(e值为1E−20)，利用hmmbuild构建蛋白质特异保守结构域的隐马可夫模型。基于新隐马可夫模型，使用hmmsearch再次扫描黄瓜蛋白数据库，保留结果。同时，以拟南芥AQP基因家族序列及番茄、马铃薯Solanum tuberosum XIPs序列为检索靶标，BLAST搜索黄瓜基因组数据库(e值为1E−10)。两方面匹配所得的序列取并集(同一基因的不同转录本，仅择其一)当作CsAQP候选。所有候选AQP分别被提交至Interpro数据库及美国国家生物信息中心CDD数据库进行验证，剔除冗余和不匹配的氨基酸序列，最终获得CsAQP基因家族成员。 -
通过ClustalW对黄瓜、模式植物拟南芥和水稻的AQP家族成员以及番茄、马铃薯XIPs序列进行比对[15]，采用MEGA-7的最大似然法(maximum likelihood, ML)，将自展法系数(Booststrap)设置为1 000次，进行重复实验，构建进化树。结合基因注释信息及物种进化结果，参考其他植物水通道蛋白命名法对CsAQP基因家族成员系统命名。
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通过筛选到的CsAQP基因的序列信息，利用MG2C软件将其定位于染色体上。采用ExPASy-ProtParam在线预测CsAQP蛋白的分子量、电荷残基数、分子式、理论等电点、不稳定指数及脂肪系数；利用ExPASy-ProtScale在线分析其亲/疏水性；使用Plant-mPLoc 2.0预测亚细胞定位；使用SignalP-5.0预测其信号肽；采用TMHMM-2.0预测分析其跨膜结构。
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使用SOPMA对其二级结构进行预测分析，并基于SWISS-MODEL进行蛋白质三维结构建模。
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通过GSDS 2.0可视化CsAQP基因家族成员的内含子-外显子的分布，并利用MEME 5.3.3在线工具对CsAQP家族蛋白的保守基序进行分析，限值为15。采用TBtools绘制示意图。
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利用DNAMAN对CsAQP蛋白成员进行多序列比对，并使用weblogo在线软件绘制seqlogo图，其特征高度反映相对的变化频率。
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从黄瓜基因组中提取CsAQP家族成员起始密码子上游1 500 bp的序列，利用Plant CARE数据库分析启动子顺式作用元件；利用TBtools对其结果可视化。
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提取转录本的CDS序列，建立目标序列数据库，多序列比对，构建索引，运行Perl程序，进一步筛选比对结果(筛选标准：序列两两之间的相似性大于75%，且2条序列比对上的长度大于较长序列的75%[16])，最终获得串联重复基因对。采用ClustalW对各对串联重复基因进行全序列比对，并使用KaKs_Calculator 2.0计算其同义替换和非同义替换间的比率。
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使用STRING对黄瓜AQP蛋白成员进行互作预测，选取模式植物拟南芥作为参考，探究CsAQP蛋白之间的作用关系。
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通过黄瓜完备基因集与参考基因集BLAST比对，并利用Domain HMM模型进行HMMRER搜索，两者取并集[15]。筛选鉴定其含有特定结构域的序列，最终获得33个CsAQP基因家族成员。通过 ClustalW对黄瓜、拟南芥和水稻的AQP家族成员以及番茄、马铃薯XIPs序列进行比对并构建系统进化树，结果显示：CsAQP基因家族成员被分成5个亚家族，分别为PIP、NIP、TIP、SIP、XIP。其中，PIP亚族的CsAQP基因家族成员数量最多，有14个成员；NIP与TIP亚族的CsAQP基因家族成员数量等同，均为8个；SIP亚族有2个成员；XIP亚族的数量最少，仅1个成员。黄瓜水通道蛋白的系统进化聚类模式与参考植物相似，大部分CsAQP基因家族成员呈现出与同一亚家族中的其他成员聚集的趋势。根据多物种进化结果和黄瓜单物种进化结果，结合已有的同源基因对CsAQP基因家族成员命名。具体结果见表1。
表 1 CsAQP基因家族的命名及理化性质分析
Table 1. Nomenclature and physicochemical properties analysis of CsAQP gene family
基因名称 编码蛋白数量/个 分子量/kD 电荷残基数/个 分子式 理论等电点 (−) (+) CsNIP1;1 276 29.45 14 20 C1357H2126N346O373S6 9.58 CsNIP2;1 288 30.55 15 22 C1377H2170N368O391S13 9.40 CsNIP2;2 261 27.62 20 17 C1242H1956N324O359S14 6.05 CsNIP3;1 249 26.01 12 15 C1183H1877N311O327S10 8.86 CsNIP4;1 269 28.88 16 17 C1331H2100N326O358S15 7.67 CsNIP5;1 298 30.80 15 18 C1399H2200N366O394S11 8.63 CsNIP6;1 304 31.52 18 20 C1422H2263N369O413S12 8.26 CsNIP7;1 268 28.45 8 8 C1312H2018N320O360S13 6.88 CsPIP1;1 292 31.43 24 25 C1451H2228N370O395S8 7.67 CsPIP1;2 292 31.37 23 24 C1451H2225N367O392S9 7.68 CsPIP1;3 286 30.76 17 24 C1423H2188N364O380S9 9.23 CsPIP1;4 292 31.40 24 25 C1450H2225N369O395S8 7.67 CsPIP2;1 284 29.92 17 17 C1390H2107N347O374S8 7.04 CsPIP2;2 284 30.24 14 18 C1408H2132N354O371S9 8.78 CsPIP2;3 284 29.98 17 18 C1385H2132N348O377S9 7.64 CsPIP2;4 283 30.24 19 20 C1400H2143N353O377S9 7.63 CsPIP2;5 276 29.37 14 21 C1359H2101N351O356S10 9.36 CsPIP2;6 279 29.72 13 18 C1372H2131N351O368S9 8.97 CsPIP2;7 287 30.52 16 22 C1415H2152N362O377S8 9.11 CsPIP2;8 280 29.85 15 21 C1379H2123N357O368S8 9.24 CsPIP2;9 191 20.26 9 16 C939H1436N242O245S7 9.51 CsPIP2;10 290 31.25 15 21 C1439H2226N372O381S13 9.10 CsSIP1;1 243 25.59 7 12 C1206H1865N287O307S9 9.41 CsSIP2;1 238 25.93 11 21 C1213H1901N303O309S8 10.00 CsTIP1;1 250 25.72 12 8 C1202H1836N292O326S4 5.64 CsTIP1;2 253 26.29 11 8 C1248H1908N298O319S3 6.03 CsTIP1;3 254 26.53 14 8 C1238H1856N296O337S8 5.30 CsTIP2;1 248 25.44 10 7 C1195H1813N281O323S5 5.66 CsTIP2;2 250 25.09 10 7 C1177H1815N277O320S4 5.39 CsTIP3;1 289 30.66 18 18 C1425H2155N369O378S5 7.17 CsTIP4;1 247 25.72 12 8 C1206H1858N296O316S5 6.01 CsTIP5;1 255 26.12 9 9 C1193H1847N303O331S12 6.88 CsXIP1;1 319 34.47 20 23 C1581H2487N393O425S21 8.27 -
理化性质分析(表1和表2)发现：CsAQP家族成员编码191~319个氨基酸，分子量为20.26~34.47 kDa，仅CsNIP亚族的氨基酸数目与分子量呈正相关；其电荷残基数差异较大，理论等电点为5.30~10.00，多数CsAQP家族成员富含碱性氨基酸。除CsXIP1;1外，其余CsAQP家族成员蛋白质不稳定指数为23.72~39.31，小于40.00，为稳定蛋白。所有成员具有相对较高的脂肪系数，有利于其在应对环境变化中正常发挥功能。CsAQP家族成员含4~7个跨膜域，多数成员含6个。Plant-mPLoc 2.0预测结果显示：大部分成员主要定位于细胞膜，少数位于液泡，个别为两者皆有。SignalP-5.0和ExPASy-ProtScale在线预测结果表明：上述33个CsAQP家族基因均无信号肽，具疏水性。
表 2 CsAQP基因家族的亚细胞定位及跨膜结构预测
Table 2. Subcellular localization and transmembrane structure prediction of CsAQP gene family
基因名称 不稳定指数 脂肪系数 跨膜结构域 亚细胞定位 基因名称 不稳定指数 脂肪系数 跨膜结构域 亚细胞定位 CsNIP1;1 28.94 106.67 6 细胞膜 CsPIP2;6 33.09 111.61 6 细胞膜 CsNIP2;1 32.02 93.44 6 细胞膜 CsPIP2;7 29.96 94.91 6 细胞膜 CsNIP2;2 37.94 97.59 6 细胞膜 CsPIP2;8 33.56 101.11 6 细胞膜 CsNIP3;1 37.36 108.55 6 细胞膜 CsPIP2;9 26.40 93.04 4 细胞膜 CsNIP4;1 32.33 113.64 5 细胞膜 CsPIP2;10 35.24 103.90 6 细胞膜 CsNIP5;1 35.91 97.92 5 细胞膜 CsSIP1;1 32.96 113.74 6 细胞膜 CsNIP6;1 26.82 99.24 5 细胞膜 CsSIP2;1 26.14 113.91 5 细胞膜/液泡 CsNIP7;1 39.31 101.98 6 细胞膜 CsTIP1;1 24.91 110.52 7 液泡 CsPIP1;1 30.99 94.62 6 细胞膜 CsTIP1;2 25.33 120.36 7 液泡 CsPIP1;2 33.49 95.62 6 细胞膜 CsTIP1;3 27.98 99.13 6 液泡 CsPIP1;3 29.78 96.26 6 细胞膜 CsTIP2;1 31.99 111.33 6 液泡 CsPIP1;4 30.85 94.28 5 细胞膜 CsTIP2;2 30.49 118.32 6 液泡 CsPIP2;1 31.99 97.64 6 细胞膜 CsTIP3;1 29.98 102.39 5 液泡 CsPIP2;2 33.61 97.96 6 细胞膜 CsTIP4;1 23.72 123.24 7 液泡 CsPIP2;3 30.51 103.10 7 细胞膜 CsTIP5;1 34.10 103.37 6 细胞膜/液泡 CsPIP2;4 26.21 102.12 6 细胞膜 CsXIP1;1 46.41 108.15 7 细胞膜 CsPIP2;5 29.51 103.51 6 细胞膜 -
蛋白质的二级结构是有规则重复的构象，预测所得结构单元有4种(图1)，分别为α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲。结果发现：33条氨基酸序列中，CsNIP4;1、CsPIP2;5、CsSIP1;1、CsSIP2;1、CsXIP1;1以α-螺旋为主要组成部分，其余28个成员则以无规则卷曲为主要组成部分，β-转角结构散布于CsAQP蛋白序列中。
图 1 CsAQP的二级结构单元分布
Figure 1. Secondary structure unit distribution of CsAQP
蛋白质三维结构模型由软件SWISS-MODEL建立。通过SWISS-MODEL对黄瓜的33条氨基酸序列进行同源建模。结果表明：绝大多数CsAQP蛋白序列具有十分相似的三维结构，其结构模型如图2所示，各亚家族内成员的相似度较亚家族之间更高。
图 2 CsAQP家族蛋白质的三级结构预测
Figure 2. Prediction of tertiary structure of CsAQP family proteins
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由图3可知：CsAQP基因家族成员映射于1~7号染色体，其中1号染色体上仅含CsTIP3;1；2号、4号、7号染色体各有2个水通道蛋白家族成员；5号染色体所含数量最多，定位到10个CsAQP基因家族成员；6号染色体次之，分布9个CsAQP家族基因。另外，5号染色体上的CsPIP1;1、CsPIP1;2和CsPIP1;4，6号染色体上的CsPIP2;1、CsPIP2;2、CsPIP2;3、CsPIP2;6和CsPIP2;9在各自染色体上形成基因簇，且这些基因之间的同源性较高，推测其功能相对保守。
图 3 CsAQP基因家族成员的染色体位置分布
Figure 3. Chromosomal location distribution of CsAQP gene family members
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为深入探究黄瓜AQP基因结构功能特征及其氨基酸序列的保守基序，对其33个家族成员进行内含子、外显子数目和位置及保守基序进行分析。结果如图4A所示：成员外显子数目为2~5：NIP亚家族中，除了CsNIP3;1和CsNIP5;1外显子数目为4个之外，其余外显子数目均为5个；PIP亚家族成员含3~4个外显子及2~4个内含子；SIP亚家族成员的外显子与内含子数目均为3个，表现出高度的一致性；TIP亚家族中，CsTIP1;1和CsTIP1;2的基因结构呈现“1个外显子+1个内含子+1个外显子”的模式，两者归属于同一亚家族的次级分组，推测这2个成员在功能及进化上有一定的相似性，其余6个亚家族成员均含有3个外显子；CsXIP1;1的基因结构与CsTIP1;1、CsTIP1;2类似。基因结构在不同亚家族之间存在明显差异，同一亚家族内的差异相对较小，反映出不同亚家族具有不同功能。
图 4 CsAQP家族成员的基因结构(A)及保守基序预测分析(B)
Figure 4. Gene structure (A) and conserved motif prediction (B) of CSAQP family members
利用MEME 5.3.3对CsAQP基因家族进行保守基序分析，可视化结果如图4B，相关基序序列如表3。结果表明：Motif 4的保守序最强；除CsSIP亚族无Motif 1，其余成员均有Motif 1分布。有些Motifs为个别亚家族所特有，如Motif 3、Motif 5、Motif 10只分布于CsPIP亚族中，Motif 9仅为CsPIP亚族的分组1所特有；Motif 13仅存在于在CsTIP亚族中。上述结果表明：同一进化分支上的成员间保守结构域相似性更高。这些CsAQP基因家族成员间具有相同或特有的Motif，导致了它们之间相似或具备其特有的功能分化。
表 3 MEME程序识别CsAQP相关基序信息
Table 3. MEME program recognizes CSAQP related base sequence information
基序 基序序列 基序长度/个 Motif 1 GISGGHJNPAVTFGLFLARKISLVRAILYIIAQCLGAICAC 41 Motif 2 KRNARDSHVPVLAPJPIGFAVFLVHLATGPITGTSMNPARS 41 Motif 3 KDYKDPPPAPLIDPEELTKWSFYRAIIAEFVATLLFLYVTVLTVIGYNRQ 50 Motif 4 KAWDDHWIYWVGPFIGAAJAALYYQFILR 29 Motif 5 LVKAFQKAYYNRYGGGANSLADGYSKGTGLAAEIIGTFVLVYTVFSATDP 50 Motif 6 DGNTCGGVGILGIAWAFGGMIFVLVYCTA 29 Motif 7 RFEEATSPSAJRALLAEFISTFJLVFAGVGS 31 Motif 8 FGTAPGVSALQAFVLEIIITFGLVYVVY 28 Motif 9 MEGKEEDVRLGANKFNERQPI 21 Motif 10 AVKALGSFRSS 11 Motif 11 NQKYNGVVTLIGIAAVAGLIVMVMIYSVG 29 Motif 12 FGAAVIFN 8 Motif 13 KLTSDGAATPAGLVVAAIAHAFALFVAVS 29 Motif 14 TAAQSQDD 8 Motif 15 FTLKGVFHPIM 8 -
利用DNAMAN对黄瓜水通道蛋白的氨基酸序列进行多序列比对，对其一致性分析，所有CsAQP成员序列、CsNIP序列、CsPIP序列、CsTIP序列、CsSIP序列一致性分别为35.04%、47.66%、73.38%、58.36%、29.27%。CsAQP蛋白具保守性，且有多个保守位点，总体而言其序列保留相对变异性。CsNIP中序列N-端保留变异性，而近C-端具有高度保守性。CsPIP序列的保守频率高于其他几个亚家族。CsTIP序列的N、C两端均具保守性，但近N-端有部分序列保留变异性。
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为了进一步研究CsAQP基因启动子区的顺式作用元件，本研究使用PlantCARE在线工具分析了CsAQP基因家族转录起始位点的上游1 500 bp区域。鉴定出的元件与激素、光响应及抗逆性相关，大部分CsAQP基因家族含WUN-motif作用元件，且所有成员的转录起始位点上游均含TATA盒以及CAAT-box。其中，BOX 4、G-Box、GT1-motif、LAMP-element、ACE、GATA-motif、I-box、AE-box、TCCC-motif、chs-CMA1a、3-AF1 binding site、sp1、Box Ⅱ、CAG-motif、ACA-motif、GA-motif、L-box、MRE (与光反应相关的MYB结合位点)元件功能涉及调控植物光反应；ABRE为脱落酸应答元件；MBSI为MYB结合位点，参与植物体中类黄酮生物的合成；AUXRE(生长素相关)、AUXRR-CORE(生长素相关)、TGA-element(生长素相关)、GARE-motif(赤霉素相关)、P-box(赤霉素相关)、ERE(乙烯应答相关)、CGTCA(茉莉酸甲酯相关)、TCA-element(水杨酸反应相关)元件功能涉及植物激素调控；TC-rich repeats(参与防御和应激反应)、LTR(响应低温)、MBS(MYB结合位点，与干旱相关)、circadian(参与昼夜节律控制)、MSA-like(参与细胞周期调节)、HD-ZIP Ⅰ(参与栅栏叶肉组织的分化)、CAT-box(与分生组织表达有关)、motif I(调节根特异性)、RY-element(种子特异性调控相关)元件功能涉及植物的应激反应以及生长发育。
从元件类型来看，光响应元件种类最多，于各CsAQP基因启动子区域均有分布。从单个元件的具体分布来看，91%家族成员启动子区分布BOX 4；61%成员启动子区含ABRE元件。从单个基因家族成员来看，CsXIP1;1作为新成员，其基因启动子富含激素调控相关元件，例如ERE、P-box、TGACG元件，且含与胚乳表达相关的GCN4-motif元件；CsNIP2;1、CsNIP5;1、CsNIP6;1、CsNIP7;1、CsPIP1;2、CsPIP1;3、CsPIP2;7、CsPIP2;8、CsSIP1;1、CsTIP3;1含1~3个TC-rich repeats元件，涉及植物防御及应激；CsNIP1;1、CsNIP2;2、CsNIP3;1、CsNIP7;1、CsPIP1;3、CsPIP1;4、CsPIP2;1、CsPIP2;2、CsPIP2;3、CsPIP2;8、CsPIP2;9、CsTIP1;2、CsTIP1;3、CsTIP2;1基因启动子区域都含有MBS元件，表明这些基因有可能与MYB转录因子结合，参与响应干旱胁迫的调控。CsAQP基因启动子区的部分元件展示如图5。
图 5 CsAQP基因家族成员上游顺式元件预测
Figure 5. Prediction of upstream cis elements of CsAQP gene family members
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已有文献表明：串联重复偏向于扩增膜蛋白功能基因以及与生物和非生物胁迫紧密相关的基因[17]。为探究黄瓜AQP基因家族在进化过程中因串联复制之后基因的偏向性保留和选择压力的形式，对33个家族成员进行分析。分析结果显示：黄瓜33个CsAQP基因家族成员之间，5号、6号这2条染色体上共有5对基因具有串联复制关系，分别为CsPIP1;2&CsPIP1;1、CsPIP1;2&CsPIP1;4、CsPIP1;1&CsPIP1;4、CsPIP2;6&CsPIP2;3、CsPIP2;2&CsPIP2;3。Ka/Ks分析(表4)发现：5个基因对的Ka/Ks均小于1，表明这些重复基因对经历纯化选择，消灭群体有害突变，且在进化中较为保守，结构较为稳定，功能具有一致性。
表 4 CsAQP基因扩增关系及Ka/Ks比率
Table 4. Amplification relationship and Ka/Ks ratio of CsAQP gene in Cucumber
串联重复基因对 Ka Ks Ka/Ks 串联重复基因对 Ka Ks Ka/Ks CsPIP1;2&CsPIP1;1 0.040 0.610 0.659 CsPIP2;6&CsPIP2;3 0.135 0.692 0.196 CsPIP1;2&CsPIP1;4 0.360 0.656 0.055 CsPIP2;2&CsPIP2;3 0.073 1.046 0.070 CsPIP1;1&CsPIP1;4 0.005 0.053 0.096 -
为进一步了解CsAQP成员蛋白的互作关系，对33个成员的氨基酸序列进行蛋白质互作预测。结果如图6所示：CsPIP1;1、CsPIP1;2、CsPIP1;3、CsPIP1;4、CsTIP2;2均与CsNIP1;1存在互作关系，且关联性较强。另外，CsSIP2;1与CsTIP、CsPIP、CsNIP亚家族间也有一定的互作关系。上述结果表明：部分成员间存在互作关联性，但各成员间的具体网络机制并不清晰，仍需进一步研究。
图 6 CsAQP家族成员蛋白的互作预测
Figure 6. Prediction of interaction of CsAQP family protein
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本研究鉴定了黄瓜基因组中的33个CsAQP基因，CsAQP基因的数量与水稻及模式植物拟南芥的数量相似。这表明CsAQP基因在植物中有形成多基因家族的可能。基因进化的主要驱动力来源于基因扩增，而串联复制是基因扩增的方式之一。有研究表明：响应多种逆境胁迫的基因扩增与串联复制密切相关[17]。这类基因通常是剂量不敏感基因或位于代谢途径两端。方璐等[18]在白菜Brassica rapa中研究发现：与膜蛋白功能相关以及抗逆相关、新陈代谢相关的基因都发生了串联复制，这些相关基因在诱导防御反应机制中发挥作用。本研究发现：在黄瓜5号和6号染色体中共发现5对串联重复基因，这表明串联复制参与黄瓜CsAQP基因的扩增。
系统进化分析表明：CsAQP基因可以清晰地分为5个亚家族，相对于拟南芥、水稻，多1个新成员(CsXIP1;1)。有研究表明：植物中XIPs序列的分析及其功能方面的鉴定有助于更好地探究AQPs进化过程的分类[19]。同时，外显子与内含子结构的分析也有益于探究植物基因家族内的进化关系[20]。从预测结果中可以看出：基因间结构差别明显，但聚类较近的CsAQP基因其结构存在相似。CsNIP亚家族含有的外显子数量相对多于其他4个亚家族，这与JOHANSON等[21]在拟南芥上的发现一致。基因家族成员在编码氨基酸数量、分子量、理论等电点等生理生化性质也随CsAQP基因编码序列的长短及碱基比例的不同而表现出一定差异。
MEME (multiple EM for motif elicitation)分析发现：基序组成总体保守，例如所有的CsAQP基因都有一个共同的保守基序(KAWDDHWIYWVGPFIGAAJAALYYQFILR)，但不同的亚家族之间也有其独特的保守基序，这为CsAQP基因家族的细分提供一定的依据。分别以限值10、15、20为条件，再次预测CsAQP基因家族的保守基序，在几个重复对之间均能发现某些Motif的得失，与ZHOU等[22]在ClDof基因家族所得出的结论相似。初步分析这些Motif可能与CsAQP基因的功能分化相关。此外，CsAQP基因家族成员基因启动子的顺式调控元件种类丰富，包括黄瓜抗逆相关的元件以及黄瓜生长发育相关的作用元件，如所有CsAQP基因家族成员基因启动子区都含有多种与光响应相关的元件。因此，这33个基因可能参与黄瓜光反应调控。CsPIP1;2、CsNIP2;2、CsNIP3;1、CsTIP2;1、CsTIP3;1中含有HD-ZIP I元件，可能参与叶肉组织分化。
水通道蛋白在低等植物和高等植物中均有所研究[23]，其中高等植物水通道蛋白研究相对较多。拟南芥作为模式植物，其AQP在低温、干旱等逆境下的相关研究已被陆续报道。许多植物AQP成员间的互作关联性也得到了验证，如番茄[24]、水稻和玉米[25]。与这些植物AQP相比，CsAQP基因功能的研究相对缓慢但却取得了一定进展。已有研究显示：CsAQP在胁迫反应中可能发挥重要作用。陈露倩等[26]研究发现：CsPIP2;4于干旱胁迫处理下，其表达量在胁迫后2 h达到相对最高值，而随胁迫时间的延长，CsPIP2;4表达丰度显著下降。然而，目前对CsAQP基因的具体作用机制了解尚浅，尤其是不清楚CsAQP基因对非生物胁迫的调控机制。本研究通过对CsAQP基因结构、理化性质、保守基序、亚细胞定位与系统进化树等分析，将有助于鉴定其生物学功能，为进一步探究其功能特性提供了一定的理论依据。此外，对于CsAQP基因在整个生长发育中的调控网络以及与各种环境胁迫因子的关联性也有待探索。
Identification and bioinformatics analysis of AQP gene family in Cucumis sativus
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摘要:
目的 深入研究黄瓜Cucumis sativus水通道蛋白(aquaporin, AQP)基因家族(CsAQP)的相关功能。 方法 通过全基因组分析技术鉴定其家族成员，对其蛋白质理化性质、系统进化关系、选择压力、基因结构、保守基序、顺式作用元件、蛋白质互作进行分析。 结果 黄瓜基因组共有33个AQP基因，含有2~5个数量不等的外显子，在染色体上不均匀分布；根据物种进化关系将黄瓜AQP基因家族划分为5个亚家族；基因组重复序列分析表明：5号和6号染色体上各有2~3对基因串联重复；计算这些基因的同义替换(synonymous, Ks)和非同义替换(nonSynonymous, Ka)的比率，结果显示均小于1，表明其进化受纯化选择作用；顺式作用调控元件分析发现，大部分基因启动子区所含元件与激素调节、光响应、胁迫密切相关。 结论 通过黄瓜全基因组扫描，获得黄瓜基因组的33个AQP家族成员，分属于5个亚族，映射于7条染色体上。上游启动子区含逆境相关作用元件，且部分基因参与串联复制，历经纯化选择。图6表4参26 Abstract:Objective This study aims to explore the functions of aquaporin (AQP) gene family (CsAQP) in Cucumis sativus. Method The family members were identified by whole genome analysis, and their protein physical and chemical properties, phylogenetic relationships, selection pressure, gene structure, conserved motifs, cis-acting elements and protein interactions were analyzed. Result There were 33 AQP genes in C. sativus genome, which contained 2−5 exons and were unevenly distributed on chromosomes. According to the evolutionary relationship, the AQP gene family was divided into 5 subfamilies. Genome repeat analysis showed that there were 2−3 pairs of gene tandem repeats on chromosome 5 and 6 respectively. The ratios of synonymous substitution (Ks) and nonsynonymous substitution (Ka) of these genes were calculated. The results showed that they were less than 1, indicating that their evolution was affected by purification selection. The analysis of cis-acting regulatory elements showed that most of the elements in the gene promoter region were closely related to hormone regulation, light response, and stress resistance. Conclusion Through the whole genome scanning, 33 AQP family members are obtained from C. sativus genome, which belong to 5 subfamilies and map on 7 chromosomes. The upstream promoter region contains stress-related elements, and some genes participate in tandem replication and undergo purification selection. [Ch, 6 fig. 4 tab. 26 ref.] -
Key words:
- Cucumis sativus /
- aquaporin /
- gene family /
- whole genome identification
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随着环境保护要求的不断提高，环保型木材防腐剂越来越受到重视，此类防腐剂多以高效低毒的有机农药为主成分，配合其他助剂制备成有机型或水基型防腐剂[1-2]。三唑类杀菌剂，如丙环唑、戊唑醇、环丙唑醇、氟环唑和苯醚甲环唑等，既可以单独使用，又可以与铜制剂复配[3-4]，是目前常用的木材防腐剂；这些三唑类杀菌剂杀菌谱不尽相同，作用机制也有所差异，应用较广泛的是丙环唑和戊唑醇[5-6]。常见的木材防霉剂有异噻唑啉酮类如卡松、1,2-苯并异噻唑-3-酮(BIT)、4,5-二氯-2-正辛基-3-异噻唑啉酮(DCOI)等，有机碘类如碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC)，三唑类等[7]，杀菌谱也不尽相同；常用的仓储水果防霉剂如溴菌腈和抑霉唑[8-9]，防霉活性较高，但较少应用于木材防霉。菊酯类杀虫剂是常见的防治白蚁的药剂，具有用量少、成本较低、废弃物易回收、环境相对友好等优点；高效氯氟氰菊酯在菊酯类杀虫剂中活性较高、稳定性较强、耐雨水冲刷性能较好。因含有大量羟基等亲水基团[10]，木材变色、发霉、腐朽、变形等问题频发，品质降低[11-13]，常用亚麻油、桐油、豆油、核桃油等含甘油三脂肪酸酯的植物油[14]和沥青、石蜡等含长链烷烃的矿物油用作木材防水；现代工业多将植物油与动植物蜡等复配成木蜡油[15]，用作木材的表面防水处理剂。如马红霞等[16]使用56号石蜡制备木材防水剂，当石蜡质量浓度为5%时，防水效率可达54%；由此可见，石蜡可作为良好的木材防水剂。液体石蜡是经原油分馏得到的无色无味的液态烃类混合物，室温下为液态，用作防水剂时可省去加热融化环节，节约了能源和时间。木材在使用过程中需要多重保护，如防腐、防霉、防虫和防水等，存在工序繁琐、成本高昂等问题，为满足木材不同生物危害防治需要，本研究拟制备一种同时具有防腐、防霉、防虫和防水多项功能的水基型有机木材保护复合制剂，通过室内抑菌圈法筛选不同杀菌剂的抑菌活性，从中挑选活性较好、杀菌谱互补的防腐成分与防霉成分进行复配，并筛选两者的最佳配比；将其与杀虫成分和防水成分复配，制备成可以兑水自动乳化的乳油制剂。制备的复合制剂稳定性好，兼具防水、防腐、防霉、防白蚁等性能，同时处理工序简单，可达到常规生物危害防治要求的目的，为木材保护提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 杀菌剂、杀虫剂和防水剂
杀菌剂包括氟环唑(FCZ)、戊唑醇(TEB)、丙环唑(PPZ)、苯醚甲环唑(DCZ)、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(IPBC)、溴菌腈(BMN)、抑霉唑(IMZ)。杀虫剂为高效氯氟氰菊酯(CLT)。防水剂为液体石蜡(化妆品级)。以上试剂购自上海麦克林生化科技有限公司。
1.1.2 测试菌种
木材腐朽菌有褐腐菌密粘褶菌Gloeophyllun trabeum、白腐菌彩绒革盖菌Coriolus versicolor。木材混合霉菌有黑曲霉Aspergillus sp.、木霉Trichoderma sp.、青霉Penicillium sp.。木材变色菌可可球二孢Botryodiplodia theobromae。所有菌株均为实验室保存的生物测试标准用菌株。
测试树种为辐射松Pinus radiata。
1.2 试验方法
预实验通过满细胞法确定辐射松边材吸液(水)量为750~850 kg·m−3；根据三唑类药剂防腐有效载药量(200.0~400.0 g·m−3)[17]，换算药剂质量浓度为150.0~300.0 mg·L−1，确定试验用药质量浓度为200.0 mg·L−1。
1.2.1 防腐、防霉成分及配比筛选
通过室内抑菌效果普筛挑选出效果较好且杀菌谱互补的杀菌剂作为防腐和防霉成分。将挑选出的防腐和防霉成分按照不同配比混合进行复配，再次测试室内抑菌效果，确定效果较好的复配比例作为药剂配伍。
1.2.2 室内抑菌圈测试
参照《中华人民共和国药典》的“抗生素微生物检定法”测试抑菌圈。将5种防腐剂(FCZ、TEB、PPZ、DCZ、IPBC)统一配制成质量分数为5.00%的乳油，分别加水稀释到200.0 mg·L−1；防霉剂IMZ配制为400.0 mg·L−1，BMN分别配制为400.0、600.0和800.0 mg·L−1。在各涂满真菌孢子液的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中，分别摆放4个装有0.3 mL待测药液的牛津杯。随着药液的扩散，培养基上的真菌菌丝会受到抑制形成抑菌圈，抑菌圈直径越大，说明药剂抑菌效果越好。
1.2.3 制剂性能测试
乳液稳定性测试。参照GB/T 1603—2001《农药乳液稳定性测定方法》，在100.0 mL室温标准硬水中慢慢加入不同体积样品，边加入边搅拌，加完后继续搅拌30 s；然后在30 ℃恒温水浴中静置1 h，观察不同稀释倍数下样品乳状液分离情况。无浮油、沉淀或沉油则视为乳液稳定性合格。
防水性能测试。将含液体石蜡质量分数为40.00%的复合制剂分别兑水，稀释液体石蜡质量分数为2.00%、4.00%、8.00%，满细胞法处理试块。辐射松边材尺寸为50 mm×20 mm×10 mm，每组8块试块，室温平衡21 d后称质量，然后蒸馏水浸泡30 min，取出试块，称质量，参照GB/T 1934.1—2009《木材吸水性测定方法》计算吸水率；测量弦向尺寸变化，参照GB/T 29901—2013《木材防水剂的防水效率测试方法》计算防水效率。
室内防腐性能测试。参照GB/T 13942.1—2009《木材耐久性能第1部分：天然耐腐性实验室试验方法》进行。将待测制剂分别兑水稀释5、10、20倍备用，辐射松边材尺寸为20 mm×20 mm×10 mm，每组6块试块，经真空−0.09 MPa处理10 min，常压浸渍10 min，参照标准测试防腐性能。试块质量损失率＜10%，属于Ⅰ级强耐腐；质量损失率为11%~24%，属于Ⅱ级耐腐；质量损失率为25%~44%，属于Ⅲ级稍耐腐；质量损失率＞45%，属于Ⅳ级不耐腐。
室内防霉性能测试。参照GB/T 18261—2013《防霉剂对木材霉菌及变色菌防治效力的试验方法》进行。将待测制剂分别兑水稀释5、10、20倍，辐射松边材尺寸为50 mm×20 mm×10 mm，每组8块试块，参照标准方法处理试块，测试防霉性能。试块表面无菌丝、霉点时，定义侵染值为0；试块表面感染面积＜1/4，定义为1；试块表面感染面积1/4~1/2，定义为2；试块表面感染面积1/2~3/4，定义为3；试块表面感染面积＞3/4，定义为4。
室内防白蚁测试。参照GB/T 18260—2015《木材防腐剂对白蚁毒效实验室试验方法》进行。将待测制剂分别兑水稀释5、10、20倍，辐射松边材尺寸为20 mm×20 mm×10 mm，每组5块试块，参照标准方法处理试块，测试室内防白蚁性能。试块蚁蛀程度为完好无损，定义试样完好等级为10；微痕蛀蚀，定义为9.5；轻微蛀蚀，截面面积＜3%的蛀蚀，定义为9；中等蛀蚀，截面面积3%~10%的蛀蚀，定义为8；中等蛀蚀，截面面积10%~30%的蛀蚀，定义为7；严重蛀蚀，截面面积30%~50%的蛀蚀，定义为6；非常严重蛀蚀，截面面积50%~75%的蛀蚀，定义为4；试块几乎完全被蛀毁，定义完好等级为0。
2. 结果与分析
2.1 有效成分筛选
从表1可以看出：5种防腐剂(FCZ、TEB、PPZ、DCZ和 IPBC)对木材腐朽菌(彩绒革盖菌和密粘褶菌)均具有较好的抑制效果，但FCZ、TEB和PPZ对变色菌(可可球二孢)和混合霉菌几乎没有抑制作用，只有DCZ对可可球二孢有抑制效果，因此优选DCZ作为防腐成分。IPBC和IMZ对所测试菌种均有较好的抑制效果，BMN和IMZ虽然对混合霉菌和变色菌有抑制作用，但抑菌圈均小于IPBC。因此，优先IPBC作为防霉成分。
表 1 各杀菌剂的室内抑菌效果Table 1 Result of inhibition zones test by bactericide杀菌剂 质量浓度/
(mg·L−1)抑菌圈大小/mm 彩绒革
盖菌密粘
褶菌可可球
二孢混合
霉菌FCZ 200.0 ＞45.0 ＞45.0 0 0 TEB 200.0 ＞45.0 ＞45.0 0 0 PPZ 200.0 ＞45.0 ＞45.0 0 0 DCZ 200.0 ＞45.0 ＞45.0 11.4 0 IPBC 200.0 ＞45.0 ＞45.0 34.6 21.9 BMN 800.0 37.2 35.4 12.8 10.6 600.0 38.1 29.0 9.0 9.4 400.0 26.8 31.8 8.3 7.1 IMZ 400.0 39.2 41.6 26.9 12.7 将DCZ和IPBC按质量比1∶1、1∶3、3∶1的比例配制混合药剂，测试DCZ+IPBC复配药剂对腐朽菌和霉菌的抑制效果；将其他3种三唑类防腐药剂(FCZ、TEB和PPZ)与IPBC按照质量比1∶1配制复配药剂，作为对照测试抑菌效果。由表2可以看出：DCZ+IPBC复配药剂对木材腐朽菌、变色菌和混合霉菌的抑制效果较好，其中按照1∶1比例复配的药剂效果最高。相其他三唑类与IPBC的复配药剂，抑菌效果亦有所提高。由此确认防腐/防霉复配药剂，DCZ和IPBC按照1∶1进行配制。
表 2 不同三唑类药剂与IPBC复配的抑菌效果Table 2 Result of inhibition zones test by compounded of different preservatives组分 质量浓度/
(mg·L−1)抑菌圈大小/mm 彩绒革
盖菌密粘
褶菌可可球
二孢混合
霉菌DCZ 200.0 ＞45.0 ＞45.0 11.4 0 DCZ+IPBC 150.0+50.0 ＞45.0 ＞45.0 22.4 15.1 DCZ+IPBC 100.0+100.0 ＞45.0 ＞45.0 31.0 23.6 DCZ+IPBC 50.0+150.0 ＞45.0 ＞45.0 29.1 23.7 IPBC 200.0 ＞45.0 ＞45.0 30.6 21.9 FCZ+IPBC 100.0+100.0 ＞45.0 ＞45.0 25.7 21.8 PPZ+IPBC 100.0+100.0 ＞45.0 ＞45.0 25.8 22.5 TEB+IPBC 100.0+100.0 ＞45.0 ＞45.0 24.0 21.0 为探索CLT对白蚁的防治效果，设计含梯度载药量的辐射松边材室内抗白蚁效果测试，拟定辐射松边材载药量分别为5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 g·m−3。由表3可知：试块中CLT载药量达10.9 g·m−3以上时，白蚁蛀蚀完好值＞8.0，质量损失率＜11%，而未添加药剂处理的对照木材，完好值仅4.6，质量损失率＞40%。因此，设计的复合制剂中防虫成分的目标载药量为7.5~30.0 g·m−3。
表 3 不同CLT载药量木材的白蚁蛀蚀结果Table 3 Result of lab anti-termite test of cyhalothrin载药量/
(g·m−3)白蚁蛀蚀
完好值质量损
失率/%载药量/
(g·m−3)白蚁蛀蚀
完好值质量损
失率/%− 4.6 42.9±14.6 15.5 8.0 10.5±1.4 5.3 8.0 11.3±0.7 21.8 9.1 5.2±1.4 10.9 8.6 5.9±1.5 32.1 8.4 5.1±1.9 说明：−表示未添加药剂 综上，本研究设计制备了含苯醚甲环唑、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、高效氯氟氰菊酯、液体石蜡等多种有效成分的木材保护复合制剂，通过调试乳化剂和助溶剂的用量和配比，最终配制出稳定、均相、透明、入水可自乳化的乳油制剂。制剂制备时按比例称取原药和乳化剂，加入助溶剂，充分溶解混匀后加入液体石蜡，搅拌均匀即可。测试使用的制剂为乳油，组成成分质量分数为0.20%苯醚甲环唑、0.20%碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、0.02%高效氯氟氰菊酯和40.00%液体石蜡。
2.2 制剂性能测试
2.2.1 乳液稳定性测试
制剂兑水稀释250倍，制剂呈乳白色，初入水时呈乳白色团雾状，可自动扩散，摇匀后呈均匀的乳状液，静置1 h未见分层、析油和沉淀，稳定性可保持3~4 h；过夜后破乳，药液表面有大量浮油，颠倒摇匀后可恢复乳液状，不影响正常使用。
2.2.2 防水性能测试
参照标准方法用该制剂处理辐射松边材，经水浸泡30 min后测试试块的吸水率和防水效率。由表4可知：未添加药剂处理的木材，吸水率为54.7%；随着制剂中石蜡质量分数升高，木材试块中石蜡含量相应增加，试块吸水率依次降低，从43.5%下降到26.6%，木材防水效率则随之增强，从44.4%提升到了77.8%。
表 4 防水剂处理后试块的防水性能Table 4 Efficiency of waterproof稀释
倍数制剂中液体石
蜡质量分数/%试块中液体石
蜡含量/(kg·m−3)吸水
率/%防水效
率/%5 8 49.1 26.6±7.4 77.8±19.1 10 4 19.4 35.0±17.3 68.9±22.1 20 2 10.5 43.5±15.1 44.4±20.6 − 0 0 54.7±5.8 0 说明：−表示未添加药剂 2.2.3 室内耐腐性能测试
由表5可知：未处理木材受白腐菌侵染后质量损失率达75.7%，受褐腐菌侵染质量损失率为19.4%，而所有处理试块质量损失率均低于6%，达到强耐腐。制剂稀释20倍后处理试块，试块中DCZ和IPBC载药量超过71.1 g·m−3，试块质量损失率可达1%，达到Ⅰ级强耐腐。值得注意的是，稀释20倍的药液处理后，试块质量损失率低于稀释5倍的药液，原因是高质量浓度制剂处理后，试块内含有大量的液体石蜡，在长达3个月的试验期内，液体石蜡自动扩散到培养基，试块质量损失增加。但取样现场也发现：高质量浓度制剂处理的试块无腐朽菌菌丝附着生长，说明添加防水剂实际进一步提升了制剂的防腐性能。
表 5 制剂处理后试块的室内耐腐性能Table 5 Result of lab sand block test on sapwood P. radiate稀释
倍数彩绒革盖菌 密粘褶菌 试块DCZ+IPBC
载药量/(g·m−3)质量损
失率/%试块DCZ+IPBC
载药量/(g·m−3)质量损
失率/%5 311.2+311.2 5.5±0.6 320.6+320.6 3.6±0.3 10 150.9+150.9 2.7±0.2 139.0+139.0 3.4±0.4 20 71.2+71.2 0.6±0.1 71.1+71.1 1.0±0.2 − 0 75.7±4.3 0 19.4±2.1 说明：−表示未添加药剂 2.2.4 室内防霉性能测试
参照标准方法用该制剂处理辐射松边材，测试室内防霉效果。由表6可知：未处理木材的霉菌和变色菌侵染值为4，该制剂稀释5倍时，试块表面的DCZ和IPBC含量均达0.165 g·m−2，处理试块变色菌和混合霉菌侵染值均为0，防治效果优良。在实际使用中可根据木材树种的天然耐腐性及所处环境适当增减制剂的用量，以达到理想的防霉效果。
表 6 室内防霉测试结果Table 6 Result of lab mildew proof test稀释
倍数可可球二孢 混合霉菌 DCZ+IPBC载药
量/(g·m−2)侵染值 DCZ+IPBC载药
量/(g·m−2)侵染值 5 0.165+0.165 0 0.202+0.202 0 10 0.106+0.106 1.5 0.148+0.148 0.5 20 0.045+0.045 4.0 0.048+0.048 3.3 − 0 4.0 0 4.0 说明：−表示未添加药剂 2.2.5 室内抗白蚁测试
由表7可知：不同稀释倍数的制剂处理后，试块质量损失率均＜3%，而未添加抗虫剂的对照试块，质量损失率为42.9%；制剂稀释5倍时，试块载药量达29.1 g·m−3，试块白蚁蛀蚀完好值为9.6；稀释20倍时，试块载药量为7.6 g·m−3， 试块白蚁蛀蚀完好值为8.9，而未处理木材的白蚁蛀蚀后完好值仅为4.7，质量损失率达42.9%，显示该制剂的防治白蚁效果优良。结合表3可知：相比单用高效氯氟氰菊酯时，复合制剂处理材在同等载药量下对白蚁的防治效果要好得多；当高效氯氟氰菊酯质量浓度为15.0、30.0 g·m−3时，该复合制剂防治白蚁的效果远远优于单剂，由此可知其他组分的加入起到了增效作用。
表 7 室内抗白蚁测试结果Table 7 Result of lab anti-termite test稀释
倍数木材中高效氯氟氰菊酯
载药量/(g·m−3)质量损
失率/%白蚁蛀蚀
完好值5 29.1 2.8±0.5 9.6 10 14.7 2.6±0.3 9.2 20 7.6 2.5±0.7 8.9 − 0 42.9±14.6 4.7 说明：−表示未添加药剂 3. 讨论
针对不同的木材败坏防治需求，本研究制备了一种具有防腐、防霉、防虫、防水多功能的复合制剂，类型为乳油，有效成分为苯醚甲环唑、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、高效氯氟氰菊酯和液体石蜡。
该制剂兑水稀释后呈乳液状，稳定性可保持3~4 h，符合GB/T 1603—2001 《农药乳液稳定性测定方法》的规定。石蜡作为常见的防水剂被广泛应用，多数所使用的时熔点较高的固体石蜡[18]，而该制剂以液体石蜡为防水组分，优点是室温下即为液体，无需加热融化，缺点是液体石蜡密度较小，相较常规药剂，兑水稀释后稳定性差，药液兑水约 4 h 后就会分层破乳；不过，稍微搅拌即可恢复乳状，基本不影响正常使用。该制剂防水性能较好，然而应注意的是防水剂含量很大，大剂量液体石蜡的使用，存在一定的消防隐患，后期应配合表面阻燃处理。石蜡基防水剂的主要防水机制是通过石蜡的疏水作用[19]，石蜡的使用同时增强了木材的尺寸稳定性[20]，石蜡分子量较大，不易进入木材内部，因此需要将其乳化成细小的乳状液，然而，乳化剂的过量使用可能会有石蜡的疏水性降低的风险，需要在以后的开发中引起重视。结合室内耐腐试验菌丝生长状况可以发现：防水剂液体石蜡的加入，可以明显增加药剂的防腐性能，而木材中石蜡的含量很高，当木材与环境中土壤或者水体接触时，石蜡会从木材中自由扩散到环境中，可能会增加药剂流失的风险。
室内防霉测试结果来看，将制剂稀释 5 倍使用，即辐射松试块苯醚甲环唑和碘丙炔醇丁基氨甲酸酯载药量均为 0.165 g·m −2 时，混合霉菌的生长才能被完全抑制，这与李晓文等[21]的IPBC防霉效果结论一致。室内防霉测试所选的温湿度条件适合霉菌生长，且霉菌的孢子液人为接种，因此，通常可以通过室内防霉测试的药剂，在实际生产中的防霉效果也会很好。
室内防白蚁测试结果可知：制剂稀释 20 倍后，试块受白蚁蛀蚀程度仍较低，质量损失率较小，防蚁性能优异。同时，比较单独使用高效氯氟氰菊酯和添加防水剂后的防白蚁效果可以看出：防水剂的添加明显增加了药剂的防白蚁效果。分析原因可能是石蜡是一种化石能源，白蚁不喜食。
4. 结论
为满足木材不同生物危害防治需要，本研究制备出一种含石蜡水基型有机多功能木材防腐剂，可以一次处理基本满足木材常规保护的要求。该木材保护复合制剂同时具有防腐、防霉、防虫、防水多功能，剂型为乳油，质量分数分别为0.20%的苯醚甲环唑和碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、0.02%的高效氯氟氰菊酯和40.00%的液体石蜡。
当环境中生物危害较轻时，可将该复合制剂稀释20倍使用，当生物危害较重时，可将复合制剂稀释5倍甚至直接使用。将制剂稀释5到10倍处理木材，即木材中液体石蜡为25.0~50.0 kg·m−3，苯醚甲环唑和碘丙炔醇丁基氨甲酸酯为150.0~300.0 g·m−3，高效氯氟氰菊酯载药量为15.0~30.0 g·m−3，可满足多大多数生物危害的防治需求。
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图 2 CsAQP家族蛋白质的三级结构预测
Figure 2 Prediction of tertiary structure of CsAQP family proteins
图 3 CsAQP基因家族成员的染色体位置分布
Figure 3 Chromosomal location distribution of CsAQP gene family members
图 4 CsAQP家族成员的基因结构(A)及保守基序预测分析(B)
Figure 4 Gene structure (A) and conserved motif prediction (B) of CSAQP family members
图 5 CsAQP基因家族成员上游顺式元件预测
Figure 5 Prediction of upstream cis elements of CsAQP gene family members
表 1 CsAQP基因家族的命名及理化性质分析
Table 1. Nomenclature and physicochemical properties analysis of CsAQP gene family
基因名称 编码蛋白数量/个 分子量/kD 电荷残基数/个 分子式 理论等电点 (−) (+) CsNIP1;1 276 29.45 14 20 C1357H2126N346O373S6 9.58 CsNIP2;1 288 30.55 15 22 C1377H2170N368O391S13 9.40 CsNIP2;2 261 27.62 20 17 C1242H1956N324O359S14 6.05 CsNIP3;1 249 26.01 12 15 C1183H1877N311O327S10 8.86 CsNIP4;1 269 28.88 16 17 C1331H2100N326O358S15 7.67 CsNIP5;1 298 30.80 15 18 C1399H2200N366O394S11 8.63 CsNIP6;1 304 31.52 18 20 C1422H2263N369O413S12 8.26 CsNIP7;1 268 28.45 8 8 C1312H2018N320O360S13 6.88 CsPIP1;1 292 31.43 24 25 C1451H2228N370O395S8 7.67 CsPIP1;2 292 31.37 23 24 C1451H2225N367O392S9 7.68 CsPIP1;3 286 30.76 17 24 C1423H2188N364O380S9 9.23 CsPIP1;4 292 31.40 24 25 C1450H2225N369O395S8 7.67 CsPIP2;1 284 29.92 17 17 C1390H2107N347O374S8 7.04 CsPIP2;2 284 30.24 14 18 C1408H2132N354O371S9 8.78 CsPIP2;3 284 29.98 17 18 C1385H2132N348O377S9 7.64 CsPIP2;4 283 30.24 19 20 C1400H2143N353O377S9 7.63 CsPIP2;5 276 29.37 14 21 C1359H2101N351O356S10 9.36 CsPIP2;6 279 29.72 13 18 C1372H2131N351O368S9 8.97 CsPIP2;7 287 30.52 16 22 C1415H2152N362O377S8 9.11 CsPIP2;8 280 29.85 15 21 C1379H2123N357O368S8 9.24 CsPIP2;9 191 20.26 9 16 C939H1436N242O245S7 9.51 CsPIP2;10 290 31.25 15 21 C1439H2226N372O381S13 9.10 CsSIP1;1 243 25.59 7 12 C1206H1865N287O307S9 9.41 CsSIP2;1 238 25.93 11 21 C1213H1901N303O309S8 10.00 CsTIP1;1 250 25.72 12 8 C1202H1836N292O326S4 5.64 CsTIP1;2 253 26.29 11 8 C1248H1908N298O319S3 6.03 CsTIP1;3 254 26.53 14 8 C1238H1856N296O337S8 5.30 CsTIP2;1 248 25.44 10 7 C1195H1813N281O323S5 5.66 CsTIP2;2 250 25.09 10 7 C1177H1815N277O320S4 5.39 CsTIP3;1 289 30.66 18 18 C1425H2155N369O378S5 7.17 CsTIP4;1 247 25.72 12 8 C1206H1858N296O316S5 6.01 CsTIP5;1 255 26.12 9 9 C1193H1847N303O331S12 6.88 CsXIP1;1 319 34.47 20 23 C1581H2487N393O425S21 8.27 
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表 2 CsAQP基因家族的亚细胞定位及跨膜结构预测
Table 2. Subcellular localization and transmembrane structure prediction of CsAQP gene family
基因名称 不稳定指数 脂肪系数 跨膜结构域 亚细胞定位 基因名称 不稳定指数 脂肪系数 跨膜结构域 亚细胞定位 CsNIP1;1 28.94 106.67 6 细胞膜 CsPIP2;6 33.09 111.61 6 细胞膜 CsNIP2;1 32.02 93.44 6 细胞膜 CsPIP2;7 29.96 94.91 6 细胞膜 CsNIP2;2 37.94 97.59 6 细胞膜 CsPIP2;8 33.56 101.11 6 细胞膜 CsNIP3;1 37.36 108.55 6 细胞膜 CsPIP2;9 26.40 93.04 4 细胞膜 CsNIP4;1 32.33 113.64 5 细胞膜 CsPIP2;10 35.24 103.90 6 细胞膜 CsNIP5;1 35.91 97.92 5 细胞膜 CsSIP1;1 32.96 113.74 6 细胞膜 CsNIP6;1 26.82 99.24 5 细胞膜 CsSIP2;1 26.14 113.91 5 细胞膜/液泡 CsNIP7;1 39.31 101.98 6 细胞膜 CsTIP1;1 24.91 110.52 7 液泡 CsPIP1;1 30.99 94.62 6 细胞膜 CsTIP1;2 25.33 120.36 7 液泡 CsPIP1;2 33.49 95.62 6 细胞膜 CsTIP1;3 27.98 99.13 6 液泡 CsPIP1;3 29.78 96.26 6 细胞膜 CsTIP2;1 31.99 111.33 6 液泡 CsPIP1;4 30.85 94.28 5 细胞膜 CsTIP2;2 30.49 118.32 6 液泡 CsPIP2;1 31.99 97.64 6 细胞膜 CsTIP3;1 29.98 102.39 5 液泡 CsPIP2;2 33.61 97.96 6 细胞膜 CsTIP4;1 23.72 123.24 7 液泡 CsPIP2;3 30.51 103.10 7 细胞膜 CsTIP5;1 34.10 103.37 6 细胞膜/液泡 CsPIP2;4 26.21 102.12 6 细胞膜 CsXIP1;1 46.41 108.15 7 细胞膜 CsPIP2;5 29.51 103.51 6 细胞膜
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表 3 MEME程序识别CsAQP相关基序信息
Table 3. MEME program recognizes CSAQP related base sequence information
基序 基序序列 基序长度/个 Motif 1 GISGGHJNPAVTFGLFLARKISLVRAILYIIAQCLGAICAC 41 Motif 2 KRNARDSHVPVLAPJPIGFAVFLVHLATGPITGTSMNPARS 41 Motif 3 KDYKDPPPAPLIDPEELTKWSFYRAIIAEFVATLLFLYVTVLTVIGYNRQ 50 Motif 4 KAWDDHWIYWVGPFIGAAJAALYYQFILR 29 Motif 5 LVKAFQKAYYNRYGGGANSLADGYSKGTGLAAEIIGTFVLVYTVFSATDP 50 Motif 6 DGNTCGGVGILGIAWAFGGMIFVLVYCTA 29 Motif 7 RFEEATSPSAJRALLAEFISTFJLVFAGVGS 31 Motif 8 FGTAPGVSALQAFVLEIIITFGLVYVVY 28 Motif 9 MEGKEEDVRLGANKFNERQPI 21 Motif 10 AVKALGSFRSS 11 Motif 11 NQKYNGVVTLIGIAAVAGLIVMVMIYSVG 29 Motif 12 FGAAVIFN 8 Motif 13 KLTSDGAATPAGLVVAAIAHAFALFVAVS 29 Motif 14 TAAQSQDD 8 Motif 15 FTLKGVFHPIM 8
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表 4 CsAQP基因扩增关系及Ka/Ks比率
Table 4. Amplification relationship and Ka/Ks ratio of CsAQP gene in Cucumber
串联重复基因对 Ka Ks Ka/Ks 串联重复基因对 Ka Ks Ka/Ks CsPIP1;2&CsPIP1;1 0.040 0.610 0.659 CsPIP2;6&CsPIP2;3 0.135 0.692 0.196 CsPIP1;2&CsPIP1;4 0.360 0.656 0.055 CsPIP2;2&CsPIP2;3 0.073 1.046 0.070 CsPIP1;1&CsPIP1;4 0.005 0.053 0.096
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