下载:
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无机磷酸盐(inorganic phosphates, Pi)的消耗是影响全球植物生长的严重问题[1]。所有生物体的生命都依赖于脂质双层细胞膜的存在，该膜将细胞内部与环境分开，单乳糖基和二乳糖基二酰基甘油(分别为MGDG和DGDG)构成植物叶绿体中膜脂质的大部分[2]。膜脂质重塑是植物用来在Pi耗尽条件下生存的防御机制[3]。在Pi饥饿期间，磷脂被降解为Pi提供其他必需的生物过程，而质体中的半乳糖脂合成通过单半乳糖基二酰基甘油合酶3(MGD3)的转录激活上调[4]。在拟南芥Arabidopsis thaliana中，已经鉴定出3种功能性MGD合成酶(MGD1，MGD2和MGD3)，并根据其氨基酸身份将其分为A型(MGD1)和B型(MGD2和MGD3)酶[5−6]。A型和B型酶在特异性、亚细胞定位和基因表达谱方面存在一些差异，A型酶定位于质体的内膜，而B型酶定位于质体外膜。在这三者中，MGD1是叶绿体中最丰富的亚型。MGD1的表达在光合组织中广泛存在，而MGD2和MGD3的表达在根等非光合组织中特异性检测到，在绿色组织中很少检测到[7]。2种类型的MGD酶对于植物在低磷酸盐条件下的生存至关重要，但尚未报道对MGD基因分歧的详细分析。这些基因对于植物适应磷素缺乏症可能是必不可少的。
棉花Gossypium是一种油籽和纤维作物，在全球70多个国家种植，在全球经济中发挥着重要作用[8-10]。然而，棉花的生长和生产力受到非生物和生物胁迫[11]。磷是核酸的主要组成部分，在植物生长发育和代谢过程中极为重要，是细胞分裂和根系生长不可缺少的，低磷胁迫不利于作物生长发育[12-16]。因此，研究低磷胁迫的分子适应机制和加强抗逆性对棉花生产至关重要。张学昕等[17]通过田间试验对不同施磷处理下的棉花各时期取样进行养分和产量分析表明：当其他条件一定时，随着施磷量的递增，棉株的单株铃数以及单铃质量也会随之增加，从而实现增产的目标。王刚等[18]研究发现：棉株地上和地下两部分的干物质都随有效磷含量的增加而增加，根冠比则随其增加而降低。通过有效磷含量影响糖类物质的合成转化以及棉株叶绿素含量，进而作用于整个棉株的生长。刘耘华等[19]研究表明：施用有机肥能够增加土壤有效磷含量，除了有机肥中有一部分磷素之外，还可以促进有效磷的转化。磷素与有机肥混合施用对土壤磷库、棉花产量和磷素吸收量都会产生积极影响。
本研究以前期研究筛选出的磷高效棉花品种陆地棉‘新陆早19’Gossypium hirsutum‘Xinluzao 19’为材料，克隆了GhMGD3基因，采用生物信息学工具分析其编码蛋白理化性质，并对其进行表达特性分析，旨在为深入解析棉花GhMGD3基因的生物学功能提供科学参考，并为培育磷高效利用的棉花新品种提供基因资源。
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陆地棉‘新陆早19’种植在河南科技大学农学院大田，不施加磷肥。选取长势一致的植株，采集根、茎、叶、花，用于分析GhMGD3基因在植株4个组织中的表达状况。
将‘新陆早19’种子播种于含干净湿润细沙的塑料盆内，28 ℃恒温培养箱，光照14 h/黑暗10 h，培养至棉苗三叶期，选择长势良好且一致的幼苗移至水培盆中，用1/2 Hoagland 营养液培养1周后分为2个处理水平，即适磷处理(SP，1.00 mmol·L−1)和低磷处理(LP，0.01 mmol·L−1)，磷源采用KH2PO4，为保证K+的浓度一致，以1.0 mmol·L−1为标准，低磷营养液中以KCl补齐K+，其他营养成分含有2 mmol·L−1 Ca(NO3)2·4H2O、2.5 mmol·L−1 KNO3、0.5 mmol·L−1 NH4NO3、1.4 mmol·L−1 MgSO4·7H2O、1.0×10−3 mmol·L−1ZnSO4·7H2O、1.0×10−3 mmol·L−1 MnSO4·H2O、0.1×10−3 mmol·L−1 CuSO4·5H2O、0.01 mmol·L−1 H3BO3、0.05×10−4 mmol·L−1 (NH4)6MO7O24·4H2O、0.1 mmol·L−1 EDTA-FeNa[20]。分别处理0、4、12、24、72 h后，选取3株生长一致的棉花植株，并混合取其根部组织，然后迅速置于液氮中，−80 ℃保存备用。每日调节营养液pH 6.5，3 d更换1次营养液。
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根据前期陆地棉根部低磷胁迫基因表达谱芯片差异表达基因序列进行分析，在美国国家生物信息中心(NCBI)网站的EST数据库中检索差异表达基因序列，得到该基因的相似序列，将所得相似性序列(覆盖率＞50%，相似度＞90%)使用DNASTAR的Seqman进行拼接得到重叠群，将所得序列继续检索与拼接直至没有新的相似序列出现，所得即为结果序列conting，利用ORFfinder在线平台查找开放阅读框，进行目标基因GhMGD3的克隆与分析。根据ORFfinder在线平台查找的开放阅读框，使用Primer 5.0设计引物，由生工生物工程有限公司合成，见表1。
表 1 引物信息
Table 1. Primers used in the study
引物名称 引物序列(5′→3′) 上游引物 GGGTTCTTTGTCTTTCTTG 下游引物 ACCTGGATTTGGGACTCTT M13F TGTAAAACGACGGCCAGT M13R CAGGAAACAGCTATGACC GhACTIN-F ATCCTCCGTCTTGACCTTG GhACTIN-R TGTCCGTCAGGCAACTCAT GhMGD3-F CTTGTTTTCTTTTCTTCTTGGTGGA GhMGD3-R TGATAATAATAGCCGTTGTTGTTGA -
取液氮速冻整株植株后在研钵中迅速研磨成粉末转移至离心管，利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取基因组DNA，向其中添加200 μL的TE缓冲液溶解后置于−20 ℃保存备用。
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以基因组DNA为模板设计PCR扩增反应体系(20 μL)，冰上操作：2×M5 蓝色染料高保真Taq酶10.0 μL，上游引物(10 μmol·L−1) 0.5 μL，下游引物(10 μmol·L−1) 0.5 μL，模板 DNA 0.5 μL，无核酸酶ddH2O 8.5 μL。反应程序为：95 ℃ 3 min；94 ℃ 25 s，53 ℃ 25 s，72 ℃ 40 s，32个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃低温保存。120 V，25 min，质量浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测。将目的DNA片段进行胶回收纯化后连接pTOPO-T载体，具体体系为(10 μL)：M5 HiPer pTOPO-TA Vector 1.0 μL，10×增强剂 1.0 μL，纯化后的PCR产物 3.9 μL，灭菌水 4.1 μL。取5.0 μL连接产物转化50.0 μL大肠埃希菌Escherichia coli DH5ɑ 感受态细胞，将菌液涂布在含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37 ℃培养过夜。随机挑取单菌落，扩大培养4 h。以所得菌液作模板进行菌液PCR反应，体系如下(20 μL)：2×M5 蓝色染料高保真Taq酶10.0 μL，通用引物M13F 0.5 μL，通用引物M13R 0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，无核酸酶ddH2O 8.5 μL。反应程序与以基因组DNA为模板PCR扩增反应体系相同。检测符合后送至生工生物工程有限公司测序。
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取液氮速冻整株‘新陆早19’植株后在研钵中迅速充分研磨成粉末，后续步骤依照RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书提取RNA，150 V，15 min，质量浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测。参考HiScript® cDNA一链合成试剂盒说明书完成cDNA一链的合成，−20 ℃保存备用。
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以‘新陆早19’的cDNA为模板设计PCR扩增反应体系(20 μL)，冰上操作：2×M5蓝色染料高保真Taq酶10.0 μL，上游引物(10 μmol·L−1) 0.5 μL，下游引物(10 μmol·L−1) 0.5 μL，cDNA 1.0 μL，无核酸酶 ddH2O 8.0 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 3 min；94 ℃ 25 s，56 ℃ 25 s，72 ℃ 35 s，35个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃低温保存。120 V，25 min，质量浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测。将目的DNA片段进行胶回收纯化后连接pTOPO-T载体，体系(5 μL)如下：M5 HiPer pTOPO-TA Vector 0.5 μL，10×增强剂 0.5 μL，纯化后的PCR产物1.5 μL，灭菌水2.5 μL。取5 μL连接产物转化50 μL大肠埃希菌DH5ɑ感受态细胞，培养后随机挑取单菌落扩大培养后进行菌液PCR反应，电泳检测符合后送至生工生物工程有限公司进行测序。
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使用在线平台及软件对基因进行生物信息学分析，预测分析基因的结构、性质等。
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利用半定量RT-PCR技术，分析GhMGD3基因在根、茎、叶、花中的表达状况。以各组织的cDNA为模板，GhACTIN作内参基因，所用引物见表1。设计PCR扩增反应体系(20 μL)，冰上操作：2×M5蓝色染料高保真Taq酶10.0 μL，GhMGD3-F(10 μmol·L−1) 0.5 μL，GhMGD3-R(10 μmol·L−1) 0.5 μL，cDNA 1.0 μL，无核酸酶ddH2O 8.0 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 3 min；94 ℃ 25 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 10 s，35个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃低温保存。120 V，25 min，质量浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测。
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采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)技术检测GhMGD3基因在不同组织中及低磷胁迫处理下的表达模式。以GhACTIN作为内参基因，所用引物见表1。采用SYBR® Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒进行荧光定量，使用的荧光定量PCR仪器型号是CFX96，数据分析采用
$2^{{-\Delta \Delta C}_{t}}$ 法，用Origin 9.0对数据进行统计分析并作图。 -
利用前期低磷胁迫差异表达序列为探针，共检索发现并下载了8条相似序列，利用DNASTAR将所得序列全部进行拼接，得到了一个新的conting重叠群，序列长度为1 276 bp。
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根据GhMGD3基因的编码序列(coding sequence，CDS)设计特异性引物，以植株的DNA和cDNA为模板，克隆得到GhMGD3基因的CDS (图1)，其条带符合目的条带大小。通过无缝克隆连接到pTOPO-T载体上，挑选阳性克隆测序。获得DNA序列1 040 bp左右(泳道1)与conting序列的一致性较高，为93.14%。获得cDNA序列780 bp左右(泳道2)与conting序列比对一致性为99.43%。开放阅读框为长度为681 bp，共编码226个氨基酸。该基因GhMGD3是MGD家族成员。
图 1 GhMGD3基因编码序列的克隆
Figure 1. Cloning of GhMGD3 CDS
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将DNA测序结果序列与cDNA测序结果的最大开放阅读框序列导入Gene Structure Display Server 2.0对该基因组序列与编码序列进行分析，表明该基因编码序列包含5′与3′端非编码序列，含有3个内含子，4个外显子(图2)。
图 2 GhMGD3基因结构分析
Figure 2. GhMGD3 gene structure analysis
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将基因编码蛋白导入ExPASy-ProtParam tool在线软件，分析可知GhMGD3共编码了226个氨基酸，编码蛋白的分子式是C1201H1832N328O333S13，脂肪族氨基酸指数是76.28，分子量是26 610.54 Da，等电点为8.74，属于碱性蛋白。其中缬氨酸的质量分数占比最大，为8.4%，共19个。在该蛋白中带正电荷的氨基酸有30个，另外有26个带负电荷。氨基酸组分会直接影响蛋白的亲疏水性，总亲水性平均系数为−0.471，不稳定系数是37.83，是亲水性稳定蛋白。ProtScale analysis在线软件显示此蛋白中精氨酸亲水性最强，亲水指数为−4.500，异亮氨酸疏水性最强，亲水指数为+4.500。
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在NPS@:SOPMA secondary structure prediction网站预测该蛋白二级结构，其中占比最大的无规则卷曲占39.38%，包含89个氨基酸，其次是α-螺旋，占比为34.96%，包含79个氨基酸；此外此蛋白还含有延伸链(extended strand)和β-转角(beta turn)，其中延伸链占比相比较多，占比21.24%，有48个氨基酸，β-转角仅有10个氨基酸，占比4.42%，是最少的。表明此蛋白的二级结构由α-螺旋和无规则卷曲占据主体地位所组成。由于无规则卷曲占比较多，预测其结构比较复杂。运用TMHMM-2.0分析该基因所编码蛋白不含有跨膜结构域，属于非跨膜蛋白，226个氨基酸并未形成跨膜螺旋区。通过SignalP-5.0进行信号肽分析可知：此基因编码蛋白有信号肽的概率是0.001 6，其他的可能性则高达0.998 4。226位氨基酸中并未出现典型的信号肽趋势，即该蛋白不存在信号肽。在线网站内输入基因编码序列进行基因编码蛋白的亚细胞定位预测，预测定位在叶绿体，该蛋白可能在叶绿体发挥作用。
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通过SWISS-MODEL Interactive Workspace进行同源建模，预测蛋白三级结构。如图3所示：QMEAN值为0.60，GMQE值为0.12，预测其结构与单半乳糖基二酰基甘油合酶相似，与拟南芥半乳糖脂合酶MGD1的结构类似。蛋白的三级结构与二级结构分析结果一致，均以α螺旋和无规则卷曲为主体。
图 3 GhMGD3蛋白的三级结构预测分析结果
Figure 3. Predicted three-dimension structure of GhMGD3 protein
将获得的基因编码序列提交到STRING 11.0在线网站预测该基因可能的互作网络，分析结果显示：此基因编码蛋白能够预测到蛋白的相互作用网络，因此预测该基因可能是通过多个蛋白互作进行调控。糖基化对蛋白稳定及功用均会产生极其重要的影响。将获得的基因编码序列提交到NetNGlyc 1.0在线软件可知：该蛋白不存在N-糖基化位点。磷酸化位点与蛋白的功能、结构都有很大的关系，通过NetPhos 3.1在线网站分析：此蛋白中占比最大的是丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点，而酪氨酸占比较少。它除了可以调控蛋白的活性以外，在细胞的信号转导中也占据了重要的位置。
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使用NCBI的保守结构域数据库(CDD-search)查找此氨基酸序列的保守结构域，结果显示：该基因所编码蛋白匹配所属的超家族是PLN02605，是一类包含多个结构域的模型。经与其他物种MGD家族同源蛋白进行多序列比对(图4)，该基因存在1个MGD家族特有的保守结构域(图4红框所示)，说明该基因属于陆地棉MGD家族成员。在NCBI数据库利用BLASTp检索氨基酸序列的同源序列，下载了11条不同物种的蛋白序列：雷公藤Tripterygium wilfordii、拟南芥、可可树Theobroma cacao、芒果Mangifera indica、千金榆Carpinus fangiana、木槿Hibiscus syriacus、榴莲Durio zibethinues、核桃Juglans regia、橡胶树Hevea brasiliensis、开心果Pistacia vera、杨梅Morella rubra。通过软件MEGA5构建系统进化树(图5)，棉花蛋白序列与木槿亲缘关系最近，其次是榴莲、可可树，与其余物种的亲缘关系较远。
图 4 GhMGD3与其他物种MGD家族同源蛋白的多序列比对分析结果
Figure 4. Multi-alignment of GhMGD3 amino acid sequence with other MGD family in different plants
图 5 GhMGD3基因系统进化树分析
Figure 5. GhMGD3 Phylogenetic tree analysis
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以棉花的GhACTIN为内参基因，通过半定量RT-PCR技术对GhMGD3基因在‘新陆早19’的4个组织中的表达情况进行分析。从图6可知：该基因高表达于根，微量表达于叶和花，中量表达于茎。利用qPCR检测GhMGD3基因在陆地棉‘新陆早19’植株的根、茎、叶、花等4个组织中的表达结果(图7A)同半定量RT-PCR一致。由图7B可以看出：在低磷胁迫下4~24 h，表达量逐渐下调，但是与适磷处理相比，其表达量都相对较高，且在低磷处理72 h时表达量达到最高，其中12和72 h时低磷处理比适磷处理显著表达(P＜0.05)，说明该基因在受到低磷胁迫的刺激后，能够对低磷胁迫作出应答反应。
图 6 半定量RT-PCR分析GhMGD3在棉花不同组织中的表达
Figure 6. Expression of GhMGD3 in different tissues of cotton by semi-quantitative RT-PCR
图 7 GhMGD3基因在不同组织(A)及低磷胁迫处理下(B)的表达模式
Figure 7. Expression analysis of GhMGD3 in different tissues (A) and low phosphorus stress (B)
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大部分脂质由非磷且不带电荷的半乳糖甘油脂类单半乳糖基二酰基甘油(MGDG)和二半乳糖基二酰基甘油(DGDG)组成，它们占总脂质的80%。单半乳糖基二酰基甘油是质体的生物活动以及光合活性所需的主要和必需的植物脂质，这需要富含半乳糖脂的环境。MGDG也是二半乳糖基二酰基甘油(DGDG)的关键前体，它在磷酸盐胁迫下转移到质体膜外。因此，MGDG的合成对植物至关重要。大部分MGDG是由位于质体膜上的MGDG合酶合成的[21]。尽管植物组织中磷含量之间的平衡可能对植物生长很重要，但细节仍然未知。
拟南芥mgd3和mgd2mgd3突变体在磷胁迫下植物会出现严重的生长迟缓和DGDG含量降低，清楚地表明MGD3介导的MGDG合成在磷稀缺时对生存具有重要作用[22]。史中惠等[23]将OsMGD基因转入烟草Nicotiana tobacum植株得到了超表达OsMGD基因烟草植株，通过低磷胁迫下各生理生化指标变化情况的分析表明：该基因可以提高磷脂与半乳糖脂的含量，进一步增强植株耐低磷的特性。MGDG仅存在于质体中，但DGDG可以存在于非质体膜中，在特定条件下，例如磷胁迫下，它可以替代磷脂[24]。半乳糖脂被认为在种子萌发过程中原层体向类囊体膜的光依赖性转化以及响应光变化的高度堆叠的颗粒膜和光合机制的动态组织中发挥重要作用[25]。MGDG和DGDG还可以稳定叶绿体中的光系统蛋白复合物[26-27]。在磷胁迫的条件下，植物激活体内相关的机制，以应对细胞对环境条件变化的需求。
本研究所得基因序列与拟南芥中的MGD家族中的单半乳糖基二酰基甘油合酶同源性较高，从陆地棉‘新陆早19’中克隆得到了1个MGD3类似基因，并将其命名为GhMGD3，该基因属于MGD超家族成员。该基因存在3个内含子，GhMGD3蛋白相对分子质量为26 610.54 Da，等电点为8.74，是碱性蛋白，具备稳定性与亲水性。此蛋白的二级结构由α-螺旋和无规则卷曲占据主体地位所组成，通过同源建模可知该基因三级结构预测其结构与拟南芥半乳糖脂合酶MGD1结构相似。该基因编码蛋白不存在信号肽和跨膜结构域。该蛋白不存在潜在的N-糖基化位点，但含有多个酸化位点。亚细胞定位结果显示该基因编码蛋白在叶绿体中，预测其能够通过蛋白质的相互作用参与调控。基因表达分析结果表明：该基因在棉花根中的表达量是最大的，中量表达于茎，微量表达于叶和花，在低磷胁迫72 h时其相对表达量达到最高值。GhMGD3基因可能在根系发挥作用，在棉花的磷高效利用信号调控过程中具有重要的作用。
Cloning and expression of phosphorus efficient gene GhMGD3 in Gossypium hirsutum
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摘要:
目的 基于前期陆地棉Gossypium hirsutum根部低磷胁迫基因表达谱芯片差异表达序列数据分析，挖掘相关基因，并对其克隆与表达分析。 方法 克隆GhMGD3基因并进行基因组DNA与cDNA测序分析，借助生物信息学方法分析GhMGD3的基因结构和进化关系；采用半定量RT-PCR技术与实时荧光定量PCR (RT-qPCR)的方法检测该基因在根、茎、叶、花4个组织中的基因表达量的变化以及低磷胁迫下的表达模式。 结果 成功克隆了陆地棉GhMGD3基因。GhMGD3基因的编码序列全长为681 bp，共编码226个氨基酸，存在3个内含子，分子量是26 610.54 Da，等电点为8.74，是稳定的亲水碱性蛋白。二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。该蛋白不存在信号肽、跨膜结构域、N-糖基化位点，但含有多个磷酸化位点。亚细胞定位结果显示：该基因编码的蛋白定位于叶绿体。GhMGD3蛋白与木槿Hibiscus syriacus氨基酸序列相似性较高，其亲缘关系最近。半定量RT-PCR和RT-qPCR试验结果均表示：GhMGD3基因主要表达于根，中量表达于茎，微量表达于叶和花，在低磷胁迫72 h时其相对表达量达到最高值。 结论 首次成功克隆到了陆地棉GhMGD3基因，获得了GhMGD3基因的组织表达以及低磷胁迫下的表达模式，GhMGD3基因在棉花磷高效利用信号调控中具有重要作用。图7表1参27 Abstract:Objective Based on the genome-wide expression profile of cotton seedlings under low phosphorus stress in the early stage of our research group, related genes were excavated and their preliminary expression analysis was conducted. Method Genomic DNA and cDNA sequence of the gene were cloned and analyzed by bioinformatics method. Semi-quantitative RT-PCR and fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) were used to detect the changes of gene expression in root, stem, leaf and flower tissues. The expression patterns of GhMGD3 under low phosphorus stress were analyzed by RT-qPCR technology. Result GhMGD3 gene was cloned. The coding sequence of GhMGD3 was 681 bp, encoding 226 amino acids and containing 3 introns. The molecular weight is 26 610.54 Da, isoelectric point is 8.74, it is a stable hydrophilic alkaline protein. The secondary structure is dominated by α-helix and random crimp. The protein does not have signal peptide, transmembrane domain and N-glycosylation site, but contains multiple acidification sites. Subcellular localization showed that the gene encoded a protein in chloroplast. GhMGD3 protein and Hibiscus syriacus protein amino acid sequence similarity is high, the most recent genetic relationship. The results of semi-quantitative RT-PCR and RT-qPCR showed that GhMGD3 gene was mainly expressed in root, medium expression in stem, and trace expression in leaf and flower, and its expression level reached the highest value at 72 h of low phosphorus stress. Conclusion The GhMGD3 gene was preliminarily obtained. The expression patterns of GhMGD3 in different tissues and under low phosphorus stress were analyzed. GhMGD3 gene has an important function in regulation of the efficient utilization of phosphorus in cotton. [Ch, 7 fig. 1 tab. 27 ref.] -
Key words:
- Gossypium hirsutum /
- low phosphorus stress /
- gene cloning /
- expression analysis
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无距虾脊兰Calanthe tsoongiana为兰科Orchidaceae虾脊兰属Calanthe地生草本，花朵娇艳，造型独特，受到人们的喜爱。近些年来，由于人为破坏，以及自身繁殖困难，导致野生无距虾脊兰种群数量锐减，现已被列为极度濒危等级[1]。
植物和真菌之间的互惠共生是自然界中普遍存在的现象[2]。兰科菌根真菌是一类与兰科植物形成共生关系并生成菌丝团的真菌，隶属于根系内生真菌，对兰科植物生长起促进作用[3]。研究表明：兰科植物的整个生命活动都需要菌根真菌的参与，菌根真菌不仅可以帮助兰花种子萌发[4−5]，也在其生长发育过程中扮演着重要的角色。它可以吸收土壤中的矿质元素、有机物等，在侵染兰科植物后被宿主细胞分解并向其传输营养物质[6−7]，若缺乏菌根真菌，兰科植物将无法长期存活。除了菌根真菌，兰科植物中非菌根真菌的数量也十分庞大，远远超过了菌根真菌。镰孢属Fusarium、木霉属Trichoderma和青霉属Penicillinum是兰科植物中常见的内生真菌，在适当的条件下不仅能促进兰科植物种子的萌发和生长发育，还可以有效抑制病原菌的生长[8−10]。由此可见，非菌根真菌的作用也不容忽视。兰科菌根真菌不仅广泛存在于根系内，也存在于植株周围土壤中，且距离植株越远，其相对丰度越低[11−12]，但也有研究表明：菌根真菌少量或者不存在于土壤中[13−14]。蒋玉玲等[15]研究表明：通过对周围土壤中真菌类群的分析，可推断兰科植物能否长期在此生存。因此，研究根际土壤真菌类群对兰科植物保育十分重要。
目前，虾脊兰属植物的研究集中在分类鉴别、育种和繁殖等方面，具体有资源调查、遗传多样性研究、化学与药用价值研究、快速繁育以及引种驯化等等[16−17]。国内外对虾脊兰属根系内生真菌多样性研究较少，尚处于初步阶段，未得到系统且全面的数据，尤其是无距虾脊兰还未见相关报道。鉴于此，本研究以浙江省天目山野生无距虾脊兰为材料，通过分析无距虾脊兰不同时期根际土壤真菌与根系内生真菌多样性，明确其优势真菌和共有真菌类群，以期为无距虾脊兰资源有效保护提供科学参考。
1. 材料与方法
1.1 研究地点与样品采集
所用材料采自浙江天目山国家级自然保护区内无距虾脊兰野生居群(海拔550 m，30°21′47″N，119°25′30″E)。该研究区属亚热带季风气候，雨水充沛，年降水量达1 870 mm，相对湿度较大，自然条件优越。
无距虾脊兰生长在海拔450~1 450 m的阔叶混交林下，生长周期可分为萌芽期、花期、果期和衰亡期[18]。选择未遭到破坏、分布集中且长势一致的植株，分别于2、5、7和11月进行根段采集。每次选取9株植株，每株取3~4个长约4~5 cm的根段，用根围土包裹装入采样袋，做好标记并放入4 ℃冰箱保存。
1.2 研究方法
1.2.1 样品处理
取出根系并用流水冲洗干净，无菌水冲泡，用体积分数为70%的乙醇洗涤2 min，质量分数为2.5%的次氯酸钠浸泡5 min，体积分数为70%的乙醇洗涤30 s，再经无菌水冲洗2~3次，用无菌滤纸吸去多余水分后转入液氮中紧急速冻。初步处理完成，置于−80 ℃超低温冰箱保存。
1.2.2 根际土提取
在超净台上抖掉根围土，保留附着在根系1 mm左右的根际土。用无菌镊子将根系转移至装有磷酸缓冲盐溶液(PBS)的离心管中，全温摇床下震荡20 min，挑出根系，将剩余悬浮液6 000 r·min−1高速离心20 min，弃上清液得到根际土。做好标签记录，将离心管放入液氮，待其彻底急速冷冻后，放入−80 ℃超低温冰箱保存。
1.2.3 DNA提取及PCR扩增
使用DNA提取试剂盒提取无距虾脊兰根系与根际土壤DNA，提取后利用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度，引物合成和测序由上海美吉生物医药科技有限公司进行。
PCR 仪采用ABI Gene Amp® 9700型，每个样本3个重复，20.0 μL PCR反应体系为10.0 μL 2× ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix，0.8 μL上游引物，0.8 μL下游引物，0.4 μL 50 × ROX Reference Dye 1，2.0 μL DNA模板，ddH2O补至20.0 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，35个循环；72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。同一样本的PCR产物混合后用质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，纯化后的PCR产物使用Illumina MiSeq平台进行测序。
1.2.4 序列分析与处理
首先根据overlap关系利用FLASH (v1.2.11)软件对Illumina测序得到的原始数据进行拼接，并通过FASTP (v.0.19.6)软件对序列质量进行质控、过滤和优化。区分样本后，在97%相似度水平下使用UPARSE (v11.0)软件对优化序列进行分类操作单元(OTU)聚类分析。为了得到每个OTU对应的物种分类信息，基于97%相似水平下采用RDP classifier贝叶斯算法对OTU代表序列与UNITE (v.8.0)数据库进行分类学比对。
基于OTU聚类分析结果，通过Mothur (v1.30.2)软件进行多样性指数分析，从而得到所有样本群落中物种的丰富度、覆盖度和多样性等信息。根据分类学分析结果，通过Qiime (v1.9.1)软件生成各分类学水平丰度表，进行Beta多样性距离计算，找出各样本在某一分类学水平上的优势物种、样本中各优势物种的相对丰度以及不同样本中物种的组成相似性，并利用R语言(version 3.3.1)工具统计和作图，将差异和距离通过二维坐标图呈现出来，从总体上反映各组样本之间的差异和组内样本之间的变异度大小。基于Kruskal-Wallis秩和检验(Kruskal-Wallis H test)，通过R (version 3.3.1)的stats包和python的scipy包运用DP的方法计算影响大小(effect size)，从而找出多组样本的物种进行差异显著性分析。
2. 结果与分析
2.1 无距虾脊兰根系内生真菌多样性分析
无距虾脊兰萌芽期根系测序共获得31 987条优化序列。由图1可知：在门水平上担子菌门Basidiomycota和被孢霉门Mortierellomycota占比较大，属于萌芽期根系内生真菌优势门；在属水平上，被孢霉属Mortierella和红菇属Russula真菌序列占比相差不大，共同作为该时期优势内生真菌。花期根系测序共获得51 913条优化序列。其中，担子菌门为最大优势菌门；在属水平上，粗糙孔菌属Trechispora为该时期优势内生真菌。相较于萌芽期，花期真菌类群中担子菌门和子囊菌门Ascomycota相对丰度分别为萌芽期的1.33和1.97倍，被孢霉门、被孢霉属和红菇属的相对丰度呈现下降趋势，分别减少了67.82%、67.39%和75.70%。
图 1 不同时期无距虾脊兰根系内生真菌在门(A)和属(B)水平上的群落组成Figure 1 Community composition of root endophytic fungi in different periods of C. tsoongiana at phylum (A) and genus (B) level果期根系测序共获得43 793条优化序列。其中担子菌门真菌在数量上占绝对优势；在属水平上，蜡壳耳属Sebacina为该时期优势内生真菌。相较于花期，担子菌门、子囊菌门、被孢霉门和红菇属相对丰度变化不大，但Saitozyma、锁瑚菌属Clavulina相对丰度有所增加，由原来占比不足3.00%增长到13.09%和10.29%，蜡壳耳属增加了67.30%。衰亡期根系测序共获得30 000条优化序列。该时期，子囊菌门属于优势菌门，镰孢属为优势内生真菌，相较于其他3个时期，衰亡期根系内生真菌多样性整体出现骤降现象。
2.2 无距虾脊兰根际土壤真菌多样性分析
在萌芽期，无距虾脊兰根际土壤测序共获得31 673条优化序列。由图2可知：萌芽期根际土壤与根系在门水平上真菌类群一致，但相对丰度稍有变化；在属水平上，红菇属相对丰度明显下降，占比仅为3.55%，其余真菌相对丰度较小，被孢霉属为该时期根际土壤优势真菌。
图 2 不同时期无距虾脊兰根际土壤真菌在门(A)和属(B)水平上的群落组成Figure 2 Community composition of rhizosphere soil fungi in different periods of C. tsoongiana at phylum (A) and genus (B) level在花期，根际土壤测序共获得41 062条优化序列。与同时期根系内生真菌相比，担子菌门相对丰度减少，子囊菌门相对丰度增加。在属水平上，根际土壤和根系真菌类群相对丰度明显不同，其中青霉属Penicillium为该时期根际土壤优势真菌。相较于萌芽期根际土壤真菌，花期子囊菌门和罗兹菌门Rozellomycota相对丰度分别为萌芽期的1.34和4.74倍，担子菌门、被孢霉门真菌相对丰度分别减少了31.93%和67.82%。
在果期，根际土壤测序共获得47 863条优化序列。与根系内生真菌相比，门水平上子囊菌门和担子菌门变化最大，在属水平上，Paraboeremia仅存在于根际土壤真菌中，且占比较大，为该时期根际土壤优势真菌。相较于花期根际土壤真菌，果期子囊菌门、被孢霉门、Paraboeremia和Saitozyma相对丰度分别为花期的1.34、1.61、4.03和1.07倍，担子菌门和罗兹菌门相对丰度分别降低到花期的89.45%和42.21%。
在衰亡期，根际土壤测序共获得28 997条优化序列。在门水平上，担子菌门为根系内生真菌的5.61倍，根系内生真菌无被孢霉门，而在根际土壤中其真菌序列占7.29%。在属水平上，各真菌相对丰度差别较大，其中Paraboeremia为该时期根际土壤优势真菌。相较于果期根际土壤真菌，蜡壳耳属仅存在于衰亡期根际土壤中，担子菌门和被孢霉属真菌相对丰度分别为果期的1.53和1.31倍，Saitozyma相对丰度降低到果期的32.32%。
2.3 不同时期真菌群落差异性分析
通过对无距虾脊兰根际土壤与根系测序分析，发现不同生长发育时期物种注释结果存在较大差别，具体差异见表1。其中萌芽期根际土壤和根系优势真菌分别为被孢霉属和红菇属，花期优势真菌分别为青霉属和粗糙孔菌属，果期优势真菌分别为Paraboeremia和蜡壳耳属，衰亡期优势真菌分别为Paraboeremia和镰孢属，不同生长发育时期优势真菌不同。
表 1 物种注释结果统计Table 1 Species annotation results statistics生长
时期优化序
列/条门/个 纲/个 目/个 科/个 属/个 萌芽期 63 660 11 41 91 193 359 花期 92 975 13 46 101 217 367 果期 91 656 12 48 108 224 377 衰亡期 58 997 8 33 75 162 264 在门水平上，子囊菌门真菌在萌芽期、花期和果期的根际土壤与根系中存在显著差异；而被孢霉门真菌则在萌芽期与衰亡期的根际土壤和根系中存在显著差异(图3A，P＜0.05)。在属水平上，被孢霉属、红菇属、罗兹菌门未分类属以及青霉属在萌芽期的根际土壤与根系真菌上差异较为明显。由图4可知：有虫草菌属Cordyceps等321个属为4个时期共有真菌；裸盖菇属Psilocybe等29个属为萌芽期和花期共有真菌，复膜孢酵母属Saccharomycopsis等43个属为花期和果期共有真菌，Melanopsamma等36个属为果期和衰亡期共有真菌，Stenella等23个属为衰亡期和萌芽期共有真菌。
图 3 根际土壤真菌与根系内生真菌在门(A)、属(B)水平下差异显著的类群Figure 3 The endophytic fungi in rhizosphere soil and root were different at phylum (A) and genus (B) level
图 4 属水平不同时期根际土壤真菌与根系内生真菌分布韦恩图Figure 4 Venn diagram of endophytic fungi distribution in rhizosphere soil and root at genus level at different periods从表2可见：果期根系内生真菌的ACE指数、Chao指数、Shannon指数和Sobs指数最高，其次是花期，然后是萌芽期，衰亡期Alpha指数最低。意味着果期根系内生真菌多样性和丰富度最高，衰亡期根系内生真菌多样性和丰富度最低。在无距虾脊兰根际土壤真菌中，花期Alpha多样性指数高于其他3个时期，果期ACE指数、Chao指数和Sobs指数高于萌芽期和衰亡期，萌芽期和衰亡期Alpha多样性指数相对一致。综合来讲，花期的根际土壤真菌多样性和丰富度最高，果期次之。
表 2 Alpha多样性指数Table 2 Alpha diversity indexes样本 Alpha多样性指数 ACE指数 Chao指数 Shannon指数 Sobs指数 Coverage指数 MG 1 983±26 c 1 379±81 ab 3.734±0.522 b 680±104 cd 0.964±0.004 a HG 4 078±3 043 bc 2 337±50 ab 3.724±1.606 b 987±423 bcd 0.968±0.009 a GG 8 681±439 ab 4 499±351 ab 4.221±0.501 b 1 342±161 abc 0.926±0.006 b SG 817±292 c 630±308 b 3.298±0.788 b 210±31 d 0.990±0.005 a MT 4 642±3 043 bc 3 057±1 539 a 5.042±0.191 a 1 243±322 abc 0.926±0.017 b HT 12 860±9 858 a 7 178±4 937 a 5.423±0.221 b 1 926±847 a 0.891±0.027 c GT 6 559±1 695 abc 4 109±826 ab 4.713±1.078 b 1 580±398 ab 0.931±0.017 b ST 5 182±642 abc 3 323±465 ab 4.713±0.684 b 1 198±229 abc 0.908±0.014 bc 说明：数据均为平均值±标准差。同列不同字母表示同一指数在不同样本间差异显著(P＜0.05)。MG. 萌芽期根系；HG. 花期根系；GG. 果期根系；SG. 衰亡期根系；MT. 萌芽期根际土壤；HT. 花期根际土壤；GT. 果期根际土壤；ST. 衰亡期根际土壤。 在同一时期中，萌芽期、花期和衰亡期根际土壤真菌的Alpha多样性指数均高于根系内生真菌，说明在该时期根际土壤真菌多样性和丰富度高于根系内生真菌。果期根系内生真菌ACE指数、Chao指数高于根际土壤真菌，但是根际土壤真菌Shannon指数和Sobs指数高于根系内生真菌。
为了进一步明确无距虾脊兰不同时期根际土壤真菌和根系内生真菌群落结构的差异，本研究采用主成分分析(PCA)分析其真菌群落的相似性和差异性。PCA结果显示：无距虾脊兰在花期、果期、萌芽期、衰亡期有明显的聚类区分(图5A)，主成分1解释了差异的12.92%，主成分2解释了差异的7.73%。其中在主成分1轴上花期区分较为明显，主成分2轴上果期区分较为明显，萌芽期和衰亡期距离较近，意味着衰亡期和萌芽期根际土壤真菌、根系内生真菌类群相似度高，进一步说明无距虾脊兰根际土壤真菌和根系内生真菌群落在整个生长发育时期存在阶段性差异。由图5B可知：4个时期根系内生真菌相较于根际土壤真菌，距离较近，意味着根际土壤真菌彼此间真菌类群差异较大，其中花期和果期尤为明显。另外，在每个时期中根际土壤与根系之间彼此分开较远，相较于各自内部样品之间两者真菌类群差别较为明显，其中根系样品之间内生真菌类群差别小于根际土壤。
图 5 根际土壤真菌与根系内生真菌群落主成分分析Figure 5 Principal component analysis of rhizosphere soil fungi and root endophytic fungi3. 讨论
本研究表明：无距虾脊兰根际土壤真菌和根系内生真菌优势菌门均为担子菌门和子囊菌门。根际土壤真菌类群与根系内生真菌类群相互重叠存在一定相似性，说明有一部分根系内生真菌来自根际土壤真菌。推测由于根系与根际土壤长期互相接触，彼此真菌类群相互影响[19]，且根系对根际土壤真菌具有一定的选择性等原因造成的[20]。从另一方面来讲，彼此之间也相互独立具有一定差异性，根际土壤真菌群落的丰富度、均匀度以及多样性均高于根系内生真菌。在根际处根系经常与其他根系、土壤微生物互作，从而导致了根际土壤真菌多样性高于根内真菌。
在根系内生真菌中，真菌多样性和丰富度从萌芽期到果期依次递增，并在果期达到顶峰，衰亡期又急剧下降。而根际土壤真菌类群变化情况却与之相差较大，从萌芽期到花期逐渐增加，在花期达到顶峰后逐渐下降，衰亡期与萌芽期真菌多样性和丰富度变化相对平稳。这与吕立新等[21]的观点相吻合，夏季真菌多样性高于春季和秋季，随着季节变化，温度、土壤含水量等环境因子相继发生变化，真菌群落结构也随之发生变化。YOKOYA等[22]在研究兰花时也发现了在雨季分离出的真菌，在旱季不一定出现，而同一类真菌的相对丰度也不尽相同。花期为无距虾脊兰生长初期，此时温度适宜、光线充足，周围伴生植物数量增加，土壤和根际土壤真菌丰富度也相应增加。无距虾脊兰果期为每年的7—9月，此时温度高，周围植物数量相较于花期会有所减少，所以果期根际土壤真菌丰富度少于花期。而根系内生真菌出现上述差异情况可能是从萌芽期到果期，无距虾脊兰生长发育需要大量营养物质持续输入，且夏季温度高，需要增加自身抗逆性，因此根系内生真菌种类和丰富度显著增加并在果期达到顶峰。随着冬季的到来，周围植物逐渐进入休眠期，植被凋落物、土壤微生物的分解等都会使土壤有机质增加，从而促进微生物的生长，造成衰亡期真菌群落丰富度的降低[23]。
兰科植物在自然状态下无法自主萌发，内生真菌通过向兰科植物传输营养物质，从而促进种子萌发和原球茎的分化[24]。李孟凯等[25]用镰孢属菌液处理过的铁皮石斛Dendrobium officinale种子胚膨大，种皮有被假根冲破的迹象。内生真菌对兰科植物的促生作用在生长期也有体现。王亚妮[26]研究发现：接种了内生真菌的铁皮石斛，其鲜质量、移栽成活率相比对照均有所增加；此外，张霞[27]研究表明：接种内生真菌的铁皮石斛，其抗旱性明显增强。由此可见，内生真菌在兰科植物生长发育过程中的作用不可忽视。本研究显示：无距虾脊兰不同时期优势真菌及相对丰度不同，推测兰科植物在相应生长期会选择对自己生长益处最大的真菌共生。有研究表明：在碳的需求方面，果期需求是花期的2倍[28]，而花期的优势真菌不能满足果期对生长素等方面的需求，所以不同时期优势真菌的相对丰度会随之发生变化，也进一步证实了内生真菌极易受周围环境和生长阶段影响[29]。
镰孢属和青霉属是兰科植物中常见的内生真菌，在适当的条件下不仅能促进兰科植物种子的萌发和生长发育，还可以有效抑制病原菌的生长。这2种真菌类群在花期和衰亡期属于优势真菌，由此可以推测：镰孢属和青霉属在无距虾脊兰中同样可以促进其生长，并提高其抗病性。庄鑫等[30]研究不同地点朝鲜淫羊藿Epimedium brevicornu生长时期内生真菌表明：蜡壳耳属真菌与淫羊藿中黄酮类化学成分含量成正比，证明蜡壳耳属真菌可以促进植物对磷元素的吸收，促进植物生长，同时增强植株抗灰霉病的能力。被孢霉属真菌被证实在生物分解以及土壤养分转化的过程中发挥重要作用[31]。红菇属曾被认定为菌根真菌，并与多种兰科植物存在共生关系[32]。上述几类真菌均为无距虾脊兰不同时期的优势真菌，但是这几类优势真菌是否与无距虾脊兰菌根真菌存在共生关系，是否对无距虾脊兰生长发育过程中起促进作用，还需采用石蜡切片观察是否在根细胞中形成菌丝结，并结合共生培养视植株的生长状况而定。然而，另外一些公认的菌根真菌，如胶膜菌科Tulasnellaceae在本研究中尚未见到，有研究表明可能与DNA测序区域有关[33]，在后续实验进行高通量测序时可以采取不同的引物。除此之外，可能与植物种类有关，有些真菌广泛存在于多种植物体内，而有些真菌却只与某种特定植物产生共生关系[34]。
4. 结论
本研究表明：在不同生长发育时期，无距虾脊兰真菌群落多样性和丰富度存在较大差异。根际土壤真菌多样性高于根系内生真菌，花期根际土壤真菌多样性最高，果期根系内生真菌最丰富。不同时期优势真菌差别较大，萌芽期根际土壤和根系内生优势真菌分别为被孢霉属、红菇属，花期优势真菌分别为青霉属、粗糙孔菌属，果期分别为Paraboeremia、蜡壳耳属，衰亡期分别为Paraboeremia、镰孢属。
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图 3 GhMGD3蛋白的三级结构预测分析结果
Figure 3 Predicted three-dimension structure of GhMGD3 protein
图 4 GhMGD3与其他物种MGD家族同源蛋白的多序列比对分析结果
Figure 4 Multi-alignment of GhMGD3 amino acid sequence with other MGD family in different plants
图 6 半定量RT-PCR分析GhMGD3在棉花不同组织中的表达
Figure 6 Expression of GhMGD3 in different tissues of cotton by semi-quantitative RT-PCR
图 7 GhMGD3基因在不同组织(A)及低磷胁迫处理下(B)的表达模式
Figure 7 Expression analysis of GhMGD3 in different tissues (A) and low phosphorus stress (B)
表 1 引物信息
Table 1. Primers used in the study
引物名称 引物序列(5′→3′) 上游引物 GGGTTCTTTGTCTTTCTTG 下游引物 ACCTGGATTTGGGACTCTT M13F TGTAAAACGACGGCCAGT M13R CAGGAAACAGCTATGACC GhACTIN-F ATCCTCCGTCTTGACCTTG GhACTIN-R TGTCCGTCAGGCAACTCAT GhMGD3-F CTTGTTTTCTTTTCTTCTTGGTGGA GhMGD3-R TGATAATAATAGCCGTTGTTGTTGA 
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