下载:
-
低温是限制植物生长和发育的主要逆境因子。较低的温度会损伤植物细胞的膜结构，抑制酶活性，诱导活性氧产生，破坏代谢平衡等，引起植物生长受阻、早衰甚至死亡[1]。世界上只有三分之一的陆地面积温度在冰点以上，却有42%的陆地会经历−20 ℃以下的低温，因此低温也是限制植物地理分布的重要因素[2]。为了应对低温胁迫，植物在长期进化过程中逐渐形成了低温适应机制，用来提高植物耐受低温逆境的能力，降低低温胁迫伤害。在代谢层面上，植物可以通过提高可溶性糖、游离脯氨酸等小分子渗透调节物，以及抗氧化酶过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)等的活性来增加对低温的耐受力[3]。分子层面上，低温下植物细胞膜的流动性降低，膜蛋白的构象发生改变，进而使膜刚性增加，细胞膜的这些物理变化为膜上低温受体对低温的感受提供了基础。植物细胞的受体感受低温信号后，通过提高细胞质中的钙离子(Ca2+)水平，并与Ca2+结合蛋白结合，作为二级信号激活抗寒相关转录因子，调控耐寒相关基因，实现低温胁迫响应[4]。目前，低温响应的分子调控途径中，ICE1-CBF-COR途经被认为是植物响应耐寒胁迫的主要途径[5]。低温通过Ca2+信号引发蛋白激酶磷酸化脱落酸(ABA)信号调控途径中的蛋白激酶OST1 (open stomata1，气孔开放1)/SnRK2.1 (SNF1-related protein kinase 2.1，SNF1相关蛋白激酶2.1)，磷酸化的OST1与bHLH类转录因子ICE1结合并将其磷酸化，稳定ICE1的活性，使其稳定结合在CBF (C-repeat binding factor，C-重复结合因子)基因上，激活它们的表达。CBF转录因子会进一步启动冷响应相关基因CORs (cold responsive，低温响应)，如编码渗透调节物质合成酶以及低温保护蛋白COR、LT1 (low temperature 1，低温1)和CIN (cold-induced，冷诱导)基因等，提高植物的低温适应性[6-7]。除此之外，植物激素[8]和ROS (reactive oxygen species，活性氧)[9]也参与了植物低温响应的调控。
植物细胞中，低温的响应和调控主要发生在细胞质和细胞核中，但叶绿体在低温响应中也发挥了重要作用。叶绿体不仅是低温响应二级信号分子ROS产生的主要场所[10]，还参与水杨酸(SA)[11]、茉莉酸(JA)[12]、ABA[13]以及脯氨酸[14]等的生物合成。这些物质在植物低温响应中都产生了积极效应。因此，参与叶绿体生物活性的相关基因在低温逆境响应中也发挥了重要的功能。近年来，研究者发现叶绿体产生的ROS等信号分子可以通过逆行性信号传递途径进入细胞核来调控核基因的表达，以实现植物对环境的适应[15]。但叶绿体参与低温胁迫响应的具体分子机制大多不清楚。随着人们对植物逆境生物学研究重视程度的提高，越来越多参与植物非生物逆境响应的基因被挖掘出来，这些基因中有些响应特异逆境，也有些能够响应多种逆境，表明植物响应逆境的分子机制非常复杂的。尽管已经确定了相当数量逆境响应基因的功能，但仍有很多功能未知的基因响应非生物逆境胁迫[16]。
桉Eucalyptus树是世界上生长最快的木本植物之一，作为重要的用材树种广受欢迎，但大部分桉树对低温的耐受程度比较差。以桉树为材料研究它们的耐低温分子机制，深入挖掘低温胁迫响应相关的基因资源，对桉树的栽培和育种都有促进作用[17]。EgrCIN1 (cold induced 1)是一个随低温处理时间延长表达不断增强的基因。亚细胞定位表明其表达的蛋白定位在巨桉Eucalyptus grandis叶绿体中。本研究通过对该基因及其编码蛋白序列特征的分析和在拟南芥Arabidopsis thaliana中异源过表达后转基因株系对低温的响应等实验，分析该基因响应低温胁迫的功能。
-
巨桉为保存于浙江农林大学苗圃的G5扦插无性系材料。拟南芥野生型为哥伦比亚生态型，生长于浙江农林大学智能实验楼拟南芥生长室，生长条件为25 ℃ 16 h光照/22 ℃ 8 h黑暗，相对湿度为65%，光照强度为100 µmol·m−2·s−1。
-
根据EgrCIN1的编号(Eucgr.B02882)在phytozome (
https://phytozome-next.jgi.doe.gov )中获取其基因、蛋白序列。使用ProtParam (http://web.expasy.Org/protparam/ )分析EgrCIN1蛋白的相对分子量、理论等电点；使用PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/?disopred=1 )在线预测其二级结构；使用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ )进行跨膜结构预测；利用Plant-mPLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/ )对EgrCIN1在细胞中的表达位置进行预测；同时截取EgrCIN1基因起始密码子ATG上游1 500 bp的序列作为其启动子，使用在线分析网站Plant Care (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ )分析EgrCIN1基因启动子上的顺式作用元件。 -
取6个月苗龄的巨桉G5无性系幼苗，于低温生长箱(Snijder，荷兰)中进行0.5、2.0、6.0、12.0、24.0、48.0 h的4 ℃低温处理。8 h光照/16 h黑暗，相对湿度为60%，光照强度为150 µmol·m−2·s−1。同时分别以正常温度(白天26 ℃，晚上22 ℃，湿度、光照与处理相同)条件下生长的G5无性系幼苗为对照(ck)。3株幼苗为1个处理组，设置3次重复。处理结束后，取叶片置于液氮速冻。
-
分别取6个月苗龄的巨桉G5无性系幼苗根、茎、嫩叶(顶端新生叶片)以及成熟叶片各100 mg，置于液氮速冻，待测。
-
选取长势一致、6个月苗龄的巨桉G5无性系幼苗，分别进行干旱、高盐、ABA、MeJA等4种胁迫处理。干旱、高盐处理：干旱组不浇水即可；高盐处理组每次浇灌300 mmol·L−1氯化钠(NaCl)溶液200 mL，间隔12 h续浇1次；对照组浇灌等量清水，连续处理1周。ABA、MeJA处理：分别配制浓度为100 μmol·L−1的ABA和MeJA溶液，均匀喷洒在幼苗叶片上，对照组喷施等量清水，12 h处理1次，共处理24 h。每个处理3个植株，重复3次。处理结束后选择相同叶位的成熟叶片取样。
-
使用TIANGEN总RNA提取试剂盒(DP432)，利用PrimerScript TM RT reagent Kit (TaKaRa，日本)试剂盒将RNA反转录为cDNA。设计引物(表1)，以EgrACTIN为内参，用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)试剂盒(TaKaRa，日本)进行EgrCIN1基因表达的实时荧光定量PCR (RT-qPCR)实验，分析EgrCIN1在巨桉不同组织中及不同逆境处理后的表达情况。
表 1 引物列表
Table 1. Primers
用途 引物名称 引物序列(5′→3′) 35S::EgrCIN1载体构建 35S::EgrCIN1-F cgggggtaccATGGCTTCTTCACCTTGCAAAA 35S::EgrCIN1-R gctctagaTCATCGGACATGGGGAATTACA 35S::EgrCIN1::GFP载体构建 EgrCIN1::GFP-F gctctagaATGGCTTCTTCACCTTGCAAAA EgrCIN1::GFP-R cgggggtaccTCGGACATGGGGAATTACA 半定量PCR EgrCIN1-F AGCCTATGCTTGTACTCCACCA EgrCIN1-R TTGCCGCCCTCGGCGCGGATGA AtACTIN-F TAGGCCAAGACATCATGGTGTCAT AtACTIN-R GTTGTACGACCACTGGCGTACAAG RT-qPCR EgrACTIN-F CCCGCTATGTATGTCGC EgrACTIN-R AAGGTCAAGACGGAGGAT qEgrCIN1-F ATGGCTTCTTCACCTTGCAAAA qEgrCIN1-R TCATCGGACATGGGGAATTACA 说明：引物前小写字母为酶切位点及保护碱基 -
以改造过的pCAMbia1300-GFP载体为骨架，在phytozome上获得EgrCIN1的转录本序列，去掉终止密码子后使用Primer Premier 5设计上下游引物并在引物2端分别添加Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位点及保护碱基(表1)，基因克隆后进行EgrCIN1::GFP融合载体构建。重组的阳性克隆提取质粒后，利用电转法转入农杆菌Agrobacterium tumetacie GV3101中。瞬时转化烟草Nicotiana tabacum叶片，共培养2 d后用激光共聚焦显微镜(ZEISS，LSM510，德国)观察并拍照。GFP荧光观察激发光波长设置为488 nm，吸收光波长为500~525 nm；观察叶绿素荧光时激发光波长设置为552 nm，吸收光波长则为620~650 nm。
-
以含35S启动子的pCAMBIA1301为载体骨架，选取多克隆位点处的Xba Ⅰ和Kpn Ⅰ作为酶切位点，设计EgrCIN1带酶切位点的全长基因引物(表1)，PCR扩增，鉴定后进行35S::EgrCIN1载体构建。电击转化农杆菌GV3101，蘸花法侵染拟南芥。种子收获后，在含25 μg·mL−1潮霉素B (Hygromycin B，罗氏，瑞士)的1/2 MS培养基进行阳性株系筛选，获得的阳性株系培养一段时间后，提取叶片基因组DNA，利用EgrCIN1基因特异引物(表1)进行分子鉴定。阳性株系继续繁殖、筛选，直至获得T3代转基因纯合株系。
-
经筛选获得3个超表达EgrCIN1转基因纯合株系，纯合株系植株种植10 d后，提取叶片RNA，反转录为cDNA，设计引物(表1)，以AtACTIN为内参，进行半定量PCR实验。
-
野生型和EgrCIN1过表达株系种子经体积分数为75%乙醇消毒后，播种在1/2 MS培养基上，4 ℃春化处理2 d。低温处理：培养基上培养1周后的野生型和转基因株系幼苗分别移栽至育苗盆中，每盆中野生型和1个转基因株系各移栽4株。生长2周后，在低温培养箱中−6 ℃处理12 h后移至正常生长条件下恢复1周，观察表型并拍照。每个株系处理3盆，重复3次。实验结束后统计野生型(COL)和各株系的存活率。ABA处理：野生型和3个过表达株系分别播于含0.5 μmol·L−1 ABA的培养基上，生长10 d后，观察表型并拍照。
-
定量结果采用2－ΔΔCt[18]方法计算；作图软件为GraphPad Prism ver 6.01；使用SPSS 16.0进行显著性检验，分析方法选择单因素方差分析，默认置信区间95%。
-
课题组前期从巨桉4 ℃低温处理2 h的转录组中筛选到1个表达受到低温强烈诱导的基因，将其命名为EgrCIN1 (cold induced 1)。Phytozome数据库中该基因的序列号为Eucgr.B02882。为进一步了解EgrCIN1对低温的响应，利用RT-qPCR技术对4 ℃不同处理时间(0.5、2.0、6.0、12.0、24.0、48.0 h)的巨桉无性系幼苗进行EgrCIN1表达特性分析。结果表明(图1)：除了处理0.5 h的植株中EgrCIN1基因的表达水平与未处理植株(对照)相比没有显著差异外，随处理时间的延长，EgrCIN1的表达水平逐渐升高，处理48.0 h时，其表达水平已经达到了对照的48.6倍。48.0 h后，叶片萎蔫严重，明显受到低温生理伤害，故未进一步取样分析。可见，EgrCIN1表达明显受低温诱导，且随处理时间的延长表达有增强的趋势。
图 1 4 ℃低温处理不同时间下EgrCIN1的定量表达
Figure 1. Relative expression of EgrCIN1 gene under 4 ℃ low temperature treatment for different time
-
根据巨桉数据库获取信息和相关分析可知：该基因开放阅读框全长579 bp，不含内含子。编码含有192个氨基酸的蛋白，等电点为6.98，相对分子量为20.80 kDa。该基因编码的蛋白既没有旁系同源物，也没有直系同源物，是巨桉中特有且唯一的蛋白。
利用PSIPRED对EgrCIN1编码的蛋白的二级结构预测表明：该蛋白含有2个β转角和7个ɑ螺旋，其余部分则为无规则卷曲(图2A)。利用TMHMM对EgrCIN1蛋白序列跨膜结构的预测则表明：序列中所有氨基酸序列位点的跨膜概率均小于0.02，没有明显跨膜区域(图2B)，说明其不是膜蛋白。亚细胞定位预测结果显示：EgrCIN1编码的蛋白可能在叶绿体、线粒体、细胞质及细胞核中都能表达。
图 2 EgrCIN1蛋白二级结构(A)和跨膜结构(B)预测
Figure 2. Prediction of EgrCIN1 protein secondary structure (A) and transmembrane structure (B)
-
对EgrCIN1的启动子上分布的顺式作用元件进行了分析，发现在EgrCIN1启动子上分布着多个与植物非生物逆境胁迫响应密切相关的顺式作用元件(表2)，其中脱落酸应答元件(ABA response element, ABRE) 2个，乙烯响应元件(ethylene response element, ERE) 1个，低温响应元件(low temperature response element, LTR) 1个，植物转录因子MYB识别序列(MYB recongnition site)、MYC结合序列均为干旱和ABA响应元件，分别有4和6个。表明该基因的表达可能受到逆境胁迫的调控。
表 2 EgrCIN1基因启动子上的顺式作用元件
Table 2. Cis-elemtents in the promoter of EgrCIN1
名称 位置 基序(5′→3′) 数量 功能 ABRE 1 165−、1 165+ GTGCAC 2 ABA响应元件 ERE 706+ ATTTAAA 1 乙烯响应元件 LTR 420− AAAGCC 1 低温响应元件 MYB 1 378+、1 152−、1 330+、1 378+ TAACCA 4 干旱、ABA响应元件 MYC 104−、935−、630−、622+、1 015−、668+ CATTTG 6 干旱、ABA响应元件 W-box 1 012−、1 280−、1 149− TTGACC 3 真菌诱导反应元件 说明：+表示正义链，−表示反义链 -
通过RT-qPCR分析EgrCIN1在不同组织中的表达情况，结果表明：EgrCIN1在嫩叶、成熟叶和茎中都有表达，且在茎中的表达量最高，而在根中却没有表达(图3)。
图 3 EgrCIN1在巨桉不同组织中的定量表达
Figure 3. Quantitative expression of EgrCIN1 in different tissues of E. grandis
-
由于EgrCIN1为巨桉特有的基因，尚无其功能信息的研究，本研究构建了EgrCIN1::GFP表达载体，针对其编码蛋白在细胞中发挥功能的位置进行了亚细胞定位分析。结果表明：EgrCIN1蛋白与烟草叶片中的叶绿体具有共定位效应，表明EgrCIN1是在叶绿体中发挥作用的蛋白(图4)。
图 4 EgrCIN1蛋白在烟草表皮细胞中的表达(标尺为50 μm)
Figure 4. Expression of EgrCIN1 protein in tobacco epidermis cell(the bar is 50 μm)
-
通过遗传转化后，从中筛选获得3个转基因株系：EgrCIN1-OE3、EgrCIN1-OE7和EgrCIN1-OE9。利用RT-qPCR技术对这3个株系中EgrCIN1的基因表达情况进行分析，结果表明：EgrCIN1在3个株系中都有明显的表达(图5)。
图 5 野生型和EgrCIN1过表达转基因株系中EgrCIN1的半定量PCR
Figure 5. Semi-quantitative PCR of EgrCIN1 in wild type and EgrCIN1 overexpression transgenic lines
-
对3个拟南芥过表达转基因株系进行−6 ℃低温处理12 h，随后置于正常生长条件下生长1周。结果发现：−6 ℃低温处理对转基因株系和野生型都会造成低温伤害，但转基因株系的恢复情况明显好于野生型(图6A)。统计不同株系的存活率发现，野生型存活率为30.53%，而EgrCIN1-OE3、EgrCIN1-OE7和EgrCIN1-OE9等3个转基因株系分别达到了77.77%、86.07%和88.83% (图6B)，表明EgrCIN1的超表达在一定程度上可以提高植株的抗寒性。
图 6 野生型和EgrCIN1转基因株系低温处理后的表型(A)和存活率(B)
Figure 6. Phenotype (A) and survival (B) of wild-type and EgrCIN1 transgenic lines after cold treatment
-
植物低温响应分子调控途径有ABA依赖型和ABA非依赖型。针对EgrCIN1参与的抗寒性途径是否有ABA参与的这一问题，对转基因株系进行了ABA处理。结果表明：在0.5 μmol·L−1 ABA处理10 d后，3个转基因株系受到的ABA抑制作用明显强于野生型(图7)，说明ABA也参与了EgrCIN1功能的发挥。
图 7 野生型和EgrCIN1过表达株系0.5 μmol·L−1 ABA处理10 d后的表型
Figure 7. Phenotypes of wild-type and EgrCIN1 overexpression lines treated with 0.5 μmol·L−1 ABA after 10 days
-
由于不同非生物逆境因子之间往往存在相互作用，为了进一步了解其他非生物逆境因子对EgrCIN1的影响，分别分析了EgrCIN1在巨桉幼苗干旱、高盐、ABA和MeJA处理下的表达情况。结果表明：干旱和高盐处理都能诱导EgrCIN1的表达，干旱处理下EgrCIN1的表达量是对照的35.1倍；300 mmol·L−1 NaCl处理下EgrCIN1表达量则上调了16.4倍(图8A)。但EgrCIN1的拟南芥过表达转基因株系在干旱和高盐处理下与野生型相比没有显著的表型差异。此外，外源喷施ABA也能促进EgrCIN1的表达，而100 μmol·L−1 MeJA处理下，和对照相比EgrCIN1的表达并未发生显著变化(图8B)。
图 8 巨桉幼苗高盐、干旱(A)和ABA、MeJA(B)处理下EgrCIN1的定量表达
Figure 8. Quantitative expression of EgrCIN1 in E. grandis seedlings under high salt, drought (A) and ABA, MeJA (B) treatments
-
EgrCIN1是巨桉中一个受低温诱导的未知功能的基因，本研究表明：它随着低温处理时间的延长，表达水平不断提高，显示其参与了巨桉的低温胁迫响应。基因、蛋白质序列的结构特征分析，以及多序列比对和可能功能域的搜索结果都表明该基因是巨桉中一个特有的新基因。启动子上顺式作用元件的预测也表明其表达可能受低温相关因素和信号的影响。组织特异性表达分析则表明该基因主要在巨桉茎和叶中表达，而根中没有表达。显示其可能主要在植株地上部分发挥作用。对于EgrCIN1功能的进一步研究有可能为揭示桉树低温适应性新机制提供基础。
叶绿体在植物低温响应过程中处于中心枢纽的位置，一方面植物抵抗低温的能力取决于低温下的叶片光合活性。另一方面，叶绿体中参与光合作用的光反应中心酶活性受到抑制，进而引发PSⅡ的光能溢出效应，导致ROS积累，产生控制核基因表达的逆行性信号，调控低温响应基因表达，提高植株适应性[19]。在一定程度上，叶绿体的抗低温程度与整体植株的抗寒性密切相关。因此，叶绿体冷诱导相关的基因受到了极大的关注和重视。很多冷诱导基因在叶绿体中表达，并参与植物的低温逆境响应。针叶福禄考Phlox subulata中PsCor413im1蛋白在叶绿体膜上表达，超表达PsCor413im1的拟南芥株系在低温和冷冻逆境下，存活率和种子发芽率都有较大程度的提高[20]。拟南芥中的NAC102在叶绿体中作为抑制因子参与叶绿体基因的表达，并介导ROS对低温响应基因ZAT6、ZAT10和ZAT12等的调控[21-22]；冷调控蛋白COR15A和COR15B在低温条件下也可以通过结构的改变稳定叶绿体的膜结构，实现拟南芥对低温的适应性[23]。这些结果表明：叶绿体中表达的低温诱导基因有可能成为植物低温驯化的重要靶标。尽管利用生物信息学软件预测EgrCIN1编码蛋白在叶绿体、线粒体、细胞质以及细胞核中都可能存在，但亚细胞定位结果表明其可能仅在叶绿体中表达。因此被低温强烈诱导的EgrCIN1基因表达的蛋白也定位在叶绿体中，表明其在桉树中同样有可能是叶绿体中参与低温耐受性提高的重要候选基因。拟南芥中过表达EgrCIN1株系低温处理下的结果说明了该基因的确参与了植物的低温胁迫响应，能够提高植株对低温的耐受程度。另外，该基因在不同叶绿体中表达的强度有所差异，同时并非所有叶绿体中都有该基因的表达。这可能与瞬时表达过程中该基因在不同叶绿体中表达的强度不同有关，也可能是该基因在叶绿体不同发育阶段表达模式不同。
ABA在植物低温响应中也发挥了重要作用[24-25]，包含叶绿体在内的质体是ABA生物合成开始的场所[13]。ABA在叶绿体中与逆境胁迫相关基因表达的蛋白互作调控植物对逆境的适应性。如小立碗藓Physcomitrella patens中，ABA介导了叶绿体蛋白PpCOR413im对植物低温逆境适应性的调控[26]。拟南芥中过表达匍匐剪股颖Agrostis stolonifera叶绿体定位蛋白AsHSP26.8a，可以通过调控ABA信号途径提高转基因植株对低温的抗性水平[27]。EgrCIN1的过表达株系对外源ABA表现出敏感性提高的表型，同时转基因植株对低温的抗性也得到了增强，这与AsHSP26.8a作用相似。暗示ABA合成或者信号途径可能也参与了EgrCIN1对低温逆境响应的调控。同时，在巨桉中，ABA的处理也能在一定程度上诱导EgrCIN1的表达，表明ABA合成或者信号途径可能也参与了EgrCIN1功能发挥的调控。因此，EgrCIN1一方面可能受到低温等非生物逆境信号诱导而参与ABA生物合成或者信号转导对逆境响应的调控；另一方面，ABA也极可能直接影响EgrCIN1的表达，参与其功能的调控。另外，干旱、高盐也能强烈诱导EgrCIN1的表达，但实验过程中EgrCIN1拟南芥过表达转基因株系并未表现出明显的耐旱、耐盐表型，显示EgrCIN1在拟南芥和巨桉的非生物逆境响应中发挥的功能可能不同，同时也表明EgrCIN1在植物非生物逆境响应中发挥的功能比较复杂，需要进一步研究以揭示其在巨桉低温等非生物逆境响应中的功能。
本研究表明：EgrCIN1是巨桉中特有的一个基因，受低温强烈诱导，在叶绿体中表达。其拟南芥过表达转基因株系提高了对低温的耐受性，同时对ABA的敏感程度也被增强。这表明EgrCIN1有可能是存在叶绿体中，通过与ABA互作，以ABA依赖形式的途径参与了植物对低温逆境的响应。但仍有很多问题需要进一步深入研究，如EgrCIN1是否与叶绿体的发育有关系，与ABA采用什么样的互作方式共同参与植物对低温逆境适应性的调控，在干旱、高盐等其他非生物逆境响应中的作用等。
Response of Eucalyptus grandis EgrCIN1 to abiotic stress
-
摘要:
目的 对巨桉Eucalyptus grandis中特有的低温响应基因EgrCIN1 (Eucgr.B02882)序列及其表达特征进行分析，并探索其在植物低温响应中发挥的功能，以丰富桉树抗寒基因资源。 方法 利用生物信息学手段分析EgrCIN1基因、蛋白序列的特征和启动子上的顺式作用元件信息；采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)技术分析EgrCIN1在巨桉不同组织及4 ℃不同时间、干旱、300 mmol·L−1氯化钠(NaCl)、100 μmol·L−1脱落酸(ABA)和100 μmol·L−1茉莉酸甲酯(MeJA)处理下植株叶片中的表达特征；通过EgrCIN1::GFP载体瞬时转化烟草Nicotiana tabacum进行亚细胞定位；并构建CaMV35S启动子驱动的过表达载体异源转化拟南芥Arabidopsis thaliana，获得3个转基因纯合株系后，对其进行−6 ℃低温、0.5 μmol·L−1ABA等逆境处理，分析EgrCIN1在低温胁迫响应中发挥的功能。 结果 EgrCIN1是巨桉中特有的基因，不含内含子，没有跨膜结构，启动子含有多个与逆境响应相关的顺式作用元件。该基因在茎和叶片中都有表达，而在根中不表达；在叶片中其表达受低温处理强烈诱导；同时，干旱、高盐和ABA等非生物逆境因子也能诱导叶片中EgrCIN1的表达，其编码蛋白被定位在叶绿体中。拟南芥中EgrCIN1过表达转基因株系对低温耐受性提高，对外源ABA敏感程度增强。 结论 EgrCIN1是在叶绿体表达，并可能通过ABA依赖途径参与植物低温胁迫响应，提高植物对低温的抗性。图8表2参27 Abstract:Objective The objective is to analyze the sequence and expression characteristics of EgrCIN1 (Eucgr.B02882), a unique low temperature response gene in Eucalyptus grandis, and to explore its function in plant low temperature response, so as to enrich gene resources to cold resistance. Method Bioinformatics methods were used to analyze the characteristics of EgrCIN1 gene, protein sequence and cis-acting elements on the promoter. The expression pattern of EgrCIN1 in different tissues, at 4 ℃ in different time, under drought condition, under treatment of 300 mmol·L−1 NaCl, 100 μmol·L−1 ABA and 100 μmol·L−1 MeJA were analyzed by RT-qPCR method. Subcellular localization of EgrCIN1 was completed by transient transformation of Nicotiana tabacum with EgrCIN1::GFP vector. Besides, an overexpression vector driven by CaMV35S promoter was constructed and transformed into Arabidopsis thaliana. Three transgenic lines were obtained and treated with low temperature (−6 ℃) and ABA (0.5 μmol·L−1) to analyze the function of EgrCIN1 in response to low temperature stress. Result EgrCIN1 was a unique gene induced by low temperature in E. grandis. It did not contain introns and had no transmembrane structure. The promoter contained multiple cis acting elements related to stress response. The gene was mainly expressed in leaves and stems, but not in roots. Moreover, its expression in leaves was strongly induced by low temperature treatment. Meanwhile, abiotic stress factors such as drought, high salt and ABA could also induce EgrCIN1 expression in leaves. The encoded protein of EgrCIN1 was localized in chloroplasts. In Arabidopsis, EgrCIN1 overexpression transgenic lines were more tolerant to low temperature and more sensitive to exogenous ABA. Conclusion EgrCIN1 is expressed in chloroplasts and may participate in plant cold stress response possibly through ABA-dependent pathway to improve plant cold resistance. [Ch, 8 fig. 2 tab. 27 ref.] -
Key words:
- Eucalyptus grandis /
- EgrCIN1 /
- cold response /
- chloroplast /
- ABA
-
绿色植物通过光合作用固定二氧化碳(CO2)并转变成有机物质的过程被称为植物碳汇[1−2]，是降低大气中CO2浓度最主要的途径。但受到植物呼吸消耗、微生物分解和环境条件变化的影响，绝大部分被固定的碳都无法长期稳定存在[1]。植硅体(phytolith)是植物在生长过程中，通过根系吸收的无定型硅酸[Si(OH)4]经维管束输送后在植物细胞内腔或细胞间隙中形成的硅包碳化合物，几乎存在于所有植物体中，在竹亚科Bambusoideae植物中植硅体尤其丰富[3−4]。植硅体碳是在植硅体形成过程中被封存于植硅体内的有机碳[5]，随植物体死亡分解进入土壤后，可以稳定存在数千年甚至上万年之久[6−7]，成为陆地土壤长期碳封存的重要机制之一。这种长期的生物地球化学碳封存形式被认为在减少大气CO2，缓解温室效应方面具有很大的潜力[8]。
毛竹Phyllostachys edulis已被证明是一种植硅体碳汇能力很强的植物[6−8]，在中国广泛分布。在毛竹的经营管理过程中一直有施用氮肥的习惯，氮肥的施用直接促进毛竹的光合作用，进而提高单位面积毛竹笋材产量。研究表明：在毛竹的生长过程中除了氮素以外，对硅也有很强的富集能力[9−10]，而毛竹体内硅、植硅体及植硅体碳的质量分数具有极显著的相关关系[11]。氮施用后虽然增强了毛竹光合能力[12]，但对硅的吸收利用以及毛竹植硅体碳汇能力的影响还需进一步探索。
本研究以毛竹为研究对象，开展氮、硅二因素三水平栽培试验，采集毛竹不同器官，并测定不同器官硅、植硅体和植硅体碳质量分数，以明确不同器官对外源氮、硅添加的响应，揭示外源氮、硅添加对毛竹植硅体碳汇的影响机理，为提升中国竹林生态系统植硅体碳汇能力提供参考。
1. 试验设计与方法
1.1 试验设计
本研究设计为氮、硅二因素三水平盆栽试验。具体设计见表1。
表 1 试验设计及氮、硅用量Table 1 Experimental design and N, Si application rate处理 尿素/
(mg·kg−1)硅酸钠/
(mg·kg−1)处理 尿素/
(mg·kg−1)硅酸钠/
(mg·kg−1)处理 尿素/
(mg·kg−1)硅酸钠/
(mg·kg−1)N0Si0 0 0 N1Si0 250 0 N2Si0 500 0 N0Si1 0 75 N1Si1 250 75 N2Si1 500 75 N0Si2 0 150 N1Si2 250 150 N2Si2 500 150 说明：氮和硅用量按照生产上常规施肥量，即尿素750和225 kg·hm−2，有效土层深度30 cm，容重1.01 g·cm−3计算。 试验盆栽栽培于福州市晋安区新店镇福建省林业科学研究院苗圃(26°09′05″N，119°17′03″E，海拔为103.8 m)。试验栽培容器长、宽、高分别为30、20、30 cm，距容器底部2 cm侧面设直径为0.5 cm的小孔，保证排水通气。栽培用土壤来源于福州市闽侯县三叠井森林公园自然分布毛竹林。挖取土壤前清除地表植被和凋落物，挖取0~30 cm土层土壤，挑除石子、动植物残体后于干燥通风处晾干，过2 mm筛后备用。土壤容重为1.01 g·cm−3，土壤有机质为20.3 g·kg−1，土壤pH为5.51，土壤碱解氮、有效磷、速效钾、有效硅质量分数分别为245.00、2.93、116.60、54.10 mg·kg−1。
试验用毛竹苗来源于四川峨眉廷富育苗有限公司培育的毛竹1年生袋装实生幼苗，种源为广西桂林。栽培时竹苗呈丛状分生，4~5株·丛−1，蔸部具完整根鞭，苗高30 cm左右，生长健壮，无病虫害。栽培之前将每片竹叶剪去60%，以降低蒸腾速率，增加成活率。
每盆置风干土10.0 kg，浅栽生长均匀的幼苗4株，浇透水，至容器侧面小孔有水溢出，再取10.0 kg风干土均匀铺盖于湿土之上，保湿保水防结块，置于通风防雨透光玻璃温室中培养。栽培期间17:00浇水1次，浇水量为当地前10 a平均日降雨量。
1.2 样品采集
竹苗生长的过程中定时定量浇水，分别收集不同处理凋落物，及时烘干储存。毛竹苗生长2 a后，采用全株采集法采集每盆毛竹样品，清洗干净后分不同器官烘干储存备用。
1.3 样品分析
不同处理和不同器官毛竹样品在分析测定前进行粉碎(＜0.5 mm)。样品植硅体的提取采用微波消解法，之后用0.800 0 mol · L−1重铬酸钾溶液对植硅体进行检验，确保植硅体表面有机物质完全被去除，提取后的植硅体于65 ℃烘箱中烘干48 h，称量[13]。植硅体碳采用碱溶分光光度法测定[14]，在样品测定的同时加入植物标准样(GBW07602)对测定的准确性进行检验。每个样品重复3次。样品总硅采用偏硼酸锂熔融-比色法测定[15]，样品碳和氮采用碳氮元素分析仪测定。
1.4 数据处理与统计
使用SPSS 18.0进行数据统计分析，Duncan新复极差法测验不同处理的差异显著性，Origin 8.5作图。植硅体质量分数(g·kg−1)=植硅体质量(g)/样品干质量(kg)，植硅体碳质量分数(g·kg−1) =植硅体碳质量(g)/样品干质量(kg)。
2. 结果与分析
2.1 毛竹不同器官硅、植硅体、植硅体碳、碳和氮质量分数
由表2可知：在毛竹不同器官及凋落物中，硅、植硅体和植硅体碳质量分数从高到低依次均为凋落物、叶、枝、篼、秆，变化范围分别为2.2~78.4、1.9~151.9和0.78~3.93 g·kg−1。与硅、植硅体和植硅体碳不同，碳质量分数在毛竹不同器官及凋落物中从高到低依次为秆、叶、篼、枝、凋落物，变化范围为372.0~466.0 g·kg−1。不同器官及凋落物氮质量分数则表现为毛竹叶中最高，为18.8 g·kg−1，凋落物最低，为4.4 g·kg−1。差异显著性分析结果表明：凋落物中硅和植硅体质量分数均显著高于其他器官(P＜0.05)，且植硅体质量分数在枝、秆和篼之间均具有显著差异(P＜0.05)，而硅质量分数在枝、秆和篼之间不具有显著差异。与植硅体相似，植硅体碳在枝、秆和篼之间具有显著差异(P＜0.05)，但植硅体碳质量分数在凋落物和叶之间不具有显著差异。碳质量分数除了在叶和篼之间不具有显著差异外，在其他器官及凋落物之间均具有显著差异(P＜0.05)。氮质量分数在不同器官之间均具有显著差异(P＜0.05)，但在凋落物中没有表现出显著低于枝的现象。
表 2 毛竹不同器官和凋落物硅、植硅体、植硅体碳、碳和氮质量分数Table 2 Content of Si, phytolith, PhytOC, C and N in different organs and litterfall of Ph. edulis样品 硅/(g·kg−1) 植硅体/(g·kg−1) 植硅体碳/(g·kg−1) 碳/(g·kg−1) 氮/(g·kg−1) 叶 26.8±2.8 b 42.3±3.8 b 3.78±0.17 a 452±4 b 18.8±0.9 a 枝 6.7±0.3 c 22.1±1.0 c 2.84±0.19 b 439±1 c 5.8±0.3 d 秆 2.2±0.1 c 1.9±0.1 e 0.78±0.10 d 466±1 a 7.7±0.6 c 篼 5.2±0.4 c 11.7±0.8 d 1.55±0.13 c 448±2 b 11.8±0.3 b 凋落物 78.4±2.8 a 151.9±3.4 a 3.93±0.15 a 372±4 d 4.4±0.2 d 说明：数据为平均值±标准误。不同小写字母表示不同器官间差异显著 (P＜0.05)。 2.2 不同处理硅、植硅体、植硅体碳、碳和氮质量分数
由表3可知：毛竹叶、枝、秆、篼硅质量分数均表现为N0Si2处理最高，分别为42.2、8.4、2.9和6.6 g·kg−1，处理N2Si0最低，分别为18.4、5.6、1.8和3.5 g·kg−1。差异显著性分析结果表明： N0Si2和N0Si1处理叶硅质量分数显著高于除N0Si0处理以外的所有处理(P＜0.05)，而枝、秆和篼硅质量分数在不同处理之间均无显著差异。与叶、枝、秆、篼不同，凋落物硅质量分数表现为N2Si2处理最高，为91.8 g·kg−1，在N0Si0处理中最低，仅为60.9 g·kg−1。差异显著性分析结果表明： N2Si2处理中硅质量分数显著高于N0Si1和N0Si0处理(P＜0.05)，凋落物硅质量分数在其他处理间均不具有显著差异。
表 3 各处理毛竹不同器官和凋落物硅质量分数Table 3 Contents of Si in different organs and litterfall of Ph. edulis under different treatments处理 各处理毛竹不同部位硅质量分数/(g·kg−1) 叶 枝 秆 篼 凋落物 N0Si0 33.1±4.7 ab 6.1±3.0 a 2.3±1.0 a 3.7±0.7 a 60.9±5.3 c N0Si1 36.5±2.8 a 6.8±0.4 a 2.3±0.4 a 5.7±1.6 a 74.1±2.2 bc N0Si2 42.2±2.1 a 8.4±0.3 a 2.9±0.2 a 6.6±0.3 a 78.9±7.0 ab N1Si0 20.0±2.5 c 5.9±2.8 a 2.0±0.5 a 3.5±0.8 a 77.0±2.1 ab N1Si1 24.3±2.4 bc 6.2±0.5 a 2.1±0.5 a 5.4±0.2 a 77.2±2.9 ab N1Si2 24.4±1.2 bc 8.0±1.1 a 2.5±0.6 a 6.3±0.1 a 79.2±1.7 ab N2Si0 18.4±3.8 c 5.6±1.5 a 1.8±0.2 a 3.5±0.7 a 80.3±0.3 ab N2Si1 20.3±1.5 c 5.9±0.2 a 1.9±0.4 a 5.6±2.2 a 86.1±1.7 ab N2Si2 21.9±1.9 c 7.5±0.9 a 2.4±0.2 a 6.3±0.8 a 91.8±9.3 a 说明：数据为平均值±标准误。不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)。 由表4可知：随着硅添加量的增加，大部分处理植硅体质量分数呈增加的趋势。具体来看，不同处理毛竹叶植硅体质量分数为30.3~59.5 g·kg−1，其中N0Si2处理叶植硅体质量分数最高，N2Si0处理最低。N2Si2处理枝植硅体质量分数最高，为26.6 g·kg−1， N1Si0处理最低，仅为18.6 g·kg−1。不同处理秆和篼植硅体质量分数变化规律较为一致，均表现为N2Si2处理最高，分别为2.2和14.9 g·kg−1， N0Si0处理最低，分别为1.6和9.1 g·kg−1。N0Si2处理凋落物植硅体质量分数最高，为169.5 g·kg−1，比N1Si0处理高24.3%。差异显著性分析结果表明：仅叶中植硅体质量分数在N0Si0、N0Si1、N0Si2处理与其他处理间具有显著差异(P＜0.05)。
表 4 各处理毛竹不同器官和凋落物植硅体质量分数Table 4 Contents of phytolith in different organs and litterfall of Ph. edulis under different treatments处理 各处理毛竹不同部位植硅体质量分数/(g·kg−1) 叶 枝 秆 篼 凋落物 N0Si0 51.8±7.8 a 19.8±3.3 a 1.6±0.1 a 9.1±2.8 a 156.6±23.0 a N0Si1 59.2±2.3 a 20.6±4.0 a 1.9±0.4 a 9.5±0.2 a 160.8±10.4 a N0Si2 59.5±2.8 a 24.2±4.3 a 2.0±0.2 a 14.0±4.7 a 169.5±3.8 a N1Si0 35.4±1.2 b 18.6±2.4 a 1.8±0.1 a 10.1±2.8 a 136.4±19.5 a N1Si1 35.7±0.9 b 20.8±2.2 a 1.9±0.5 a 12.3±0.8 a 154.6±9.9 a N1Si2 37.8±0.9 b 26.2±3.3 a 2.1±0.5 a 14.7±0.2 a 155.3±6.4 a N2Si0 30.3±0.2 b 20.7±2.5 a 1.9±0.1 a 10.1±2.2 a 144.3±15.6 a N2Si1 34.4±3.0 b 21.1±1.9 a 2.0±0.3 a 11.0±1.7 a 144.7±0.7 a N2Si2 36.3±1.9 b 26.6±5.1 a 2.2±0.2 a 14.9±1.7 a 144.7±28.7 a 说明：数据为平均值±标准误。不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)。 由表5可知：毛竹不同器官植硅体碳质量分数在不同处理之间差异较小。总体来看，随着硅添加量的增加，不同器官及凋落物植硅体碳质量分数均具有上升趋势。不同处理叶、枝、秆、篼及凋落物植硅体碳质量分数分别为3.15~4.68、2.10~3.47、0.30~1.18、1.09~2.15和3.21~4.63 g·kg−1，均表现为N2Si2处理最高， N0Si0处理最低，表明氮和硅的添加能够促进植硅体碳质量分数增加。差异显著性分析结果表明：仅秆植硅体碳质量分数在N0Si1和N0Si0与N2Si2处理间具有显著差异(P＜0.05)。
表 5 各处理毛竹不同器官和凋落物植硅体碳质量分数Table 5 Contents of PhytOC in different organs and litterfall of Ph. edulis under different treatments处理 各处理毛竹不同部位植硅体碳质量分数/(g·kg−1) 叶 枝 秆 篼 凋落物 N0Si0 3.15±0.24 a 2.10±0.56 a 0.30±0.04 c 1.09±0.22 a 3.21±0.81 a N0Si1 3.20±1.05 a 2.25±0.66 a 0.39±0.10 bc 1.11±0.07 a 3.83±0.92 a N0Si2 3.82±0.55 a 3.12±0.63 a 0.61±0.40 abc 1.54±0.50 a 4.14±2.25 a N1Si0 3.59±0.67 a 2.28±0.59 a 0.70±0.33 abc 1.13±0.47 a 3.52±0.67 a N1Si1 4.01±0.12 a 3.10±0.54 a 0.91±0.13 abc 1.77±0.51 a 3.73±1.05 a N1Si2 4.31±0.98 a 3.38±0.46 a 1.06±0.14 ab 1.79±0.32 a 4.46±0.20 a N2Si0 3.63±1.17 a 2.45±1.28 a 0.86±0.19 abc 1.58±0.18 a 3.81±0.51 a N2Si1 4.05±0.20 a 3.39±0.28 a 1.00±0.27 abc 1.84±0.62 a 4.01±0.17 a N2Si2 4.68±0.41 a 3.47±0.98 a 1.18±0.05 a 2.15±0.33 a 4.63±1.60 a 说明：数据为平均值±标准误。不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)。 由表6可知：与植硅体碳质量分数相似，毛竹不同器官碳质量分数在不同处理间差异均较小并具有随着氮添加量增加不断增加，随着硅添加量的增加不断降低的趋势。不同处理叶、枝、秆、篼碳质量分数分别为436~478、436~441、462~471和441~456 g·kg−1，可知叶碳质量分数在不同处理之间差异最大。不同处理凋落物碳质量分数随氮和硅添加量的增加均不断增加，为348~387 g·kg−1。差异显著性分析结果表明： N2Si1处理叶碳质量分数显著高于其他处理，N0Si2处理枝碳质量分数显著低于N1Si0处理， N1Si0处理和N2Si0处理秆碳质量分数显著高于除N2Si1处理以外的其他处理， N2Si2处理凋落物碳质量分数显著高于N0Si0处理(P＜0.05)。
表 6 各处理毛竹不同器官和凋落物碳质量分数Table 6 Contents of C in different organs and litterfall of Ph. edulis under different treatments处理 各处理毛竹不同部位碳质量分数/(g·kg−1) 叶 枝 秆 篼 凋落物 N0Si0 440±2 b 440±3 ab 463±2 b 443±5 b 348±17 b N0Si1 439±2 b 437±3 ab 463±2 b 442±3 b 372±6 ab N0Si2 436±3 b 435±2 b 462±2 b 441±4 b 376±5 ab N1Si0 453±2 b 442±2 a 471±0 a 452±3 ab 365±11 ab N1Si1 453±2 b 439±1 ab 466±2 b 450±5 ab 368±14 ab N1Si2 453±3 b 438±3 ab 465±1 b 449±4 ab 369±3 ab N2Si0 454±4 b 441±1 ab 471±2 a 456±1 a 381±16 ab N2Si1 478±21 a 441±1 ab 467±0 ab 451±4 ab 384±2 ab N2Si2 459±4 ab 439±2 ab 465±1 b 449±2 ab 387±11 a 说明：数据为平均值±标准误。不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)。 由表7可知：毛竹不同器官氮质量分数在不同处理之间差异均较大，叶、枝、秆、篼和凋落物氮质量分数最低的处理分别为N0Si1、N0Si2、N0Si1、N0Si0和N0Si1处理，其氮质量分数分别为14.5、4.3、5.0、10.0和3.4 g·kg−1；最高的处理分别为N2Si1、N2Si0、N1Si2、N2Si0和N2Si0处理，比最低值分别增加54.5%、79.1%、90.0%、29.0%和50.0%。差异显著性分析结果表明：叶、枝、秆、篼和凋落物氮质量分数在不同处理间变化规律均不明显，氮质量分数在部分处理间存在显著差异(P＜0.05)。
表 7 各处理毛竹不同器官和凋落物氮质量分数Table 7 Contents of N in different organs and litterfall of Ph. edulis under different treatments处理 各处理毛竹不同部位氮质量分数/(g·kg−1) 叶 枝 秆 篼 凋落物 N0Si0 16.9±0.8 cde 5.4±0.9 bcd 6.5±1.0 abc 10.0±0.2 b 3.4±0.1 c N0Si1 14.5±0.9 e 4.6±0.1 cd 5.0±0.3 c 10.7±0.3 b 3.6±0.1 bc N0Si2 15.7±0.9 de 4.3±0.1 d 5.6±0.2 bc 10.8±0.1 b 3.4±0.1 c N1Si0 19.1±1.0 bc 6.3±0.6 abc 8.7±1.6 ab 12.3±0.2 ab 4.4±0.2 ab N1Si1 20.8±0.8 ab 6.1±0.2 abcd 8.6±0.6 abc 12.4±0.8 ab 4.8±0.3 a N1Si2 18.4±1.0 bcd 5.4±0.3 bcd 9.5±0.1 a 12.1±0.3 ab 4.8±0.3 a N2Si0 20.9±1.1 ab 7.7±0.7 a 9.3±2.2 a 12.9±1.1 a 5.1±0.4 a N2Si1 22.4±0.4 a 6.7±1.0 ab 7.7±0.8 abc 12.3±0.4 ab 5.1±0.6 a N2Si2 20.2±0.6 ab 5.8±0.5 abcd 8.4±1.3 abc 12.6±0.2 a 4.7±0.1 a 说明：数据为平均值±标准误。不同小写字母表示不同处理间差异显著(P＜0.05)。 2.3 毛竹硅、植硅体、植硅体碳、碳和氮质量分数之间的相关关系
相关性分析结果(表8)表明：毛竹硅与植硅体、植硅体与植硅体碳以及硅与植硅体碳质量分数之间均存在极显著正相关关系(P＜0.01)，硅与氮质量分数之间存在极显著二次相关关系(P＜0.01)，植硅体碳与碳质量分数之间存在极显著负相关关系(P＜0.01)。
表 8 毛竹硅、植硅体、植硅体碳、碳和氮质量分数之间的相关关系Table 8 Correlation between Si and phytolith, phytolith and PhytOC, Si and PhytOC, Si and N, C and PhytOC contents of Ph. edulisx y 拟合方程 决定系数(R2) 显著性水平 植硅体 硅 y = 0.088 + 0.517x 0.958 4 P＜0.001 植硅体 植硅体碳 y = 1.839 + 0.016x 0.463 2 P＜0.001 硅 植硅体碳 y = 1.837 + 0.031x 0.481 8 P＜0.001 硅 氮 y = 7.004 + 0.507x−0.007x2 0.493 3 P＜0.001 碳 植硅体碳 y = 472.8−14.5x 0.318 3 P＜0.001 2.4 植硅体、植硅体碳与碳质量分数的氮-硅交互作用
交互作用分析结果表明：对于毛竹植硅体、植硅体碳与碳质量分数来说，氮与硅之间均不存在交互作用的显著性(表9)。
表 9 植硅体、植硅体碳与碳质量分数的氮-硅交互作用Table 9 Interaction between N and Si for phytolith, PhytOC, and C contents指标 自由度 均方 F 显著性水平 $ {\eta }_{p}^{2} $ 植硅体 4 15.858 0.005 1.000 0.000 植硅体碳 4 0.069 0.030 0.998 0.001 碳 4 0.555 0.044 0.996 0.001 说明：$ {\eta }_{p}^{2} $表示植硅体和植硅体碳分别对组间变异的贡献率。 2.5 毛竹不同器官植硅体碳占总碳比
由图1可知：毛竹叶、枝、秆、篼和凋落物中植硅体碳占总碳的比例分别为5.7%~8.6%、4.8%~7.9%、0.7%~2.5%、2.5%~4.8%和9.2%~12.1%。与不同器官相比，凋落物中植硅体碳占总碳的比例平均最高，为10.5%。不同处理凋落物之间，N1Si2处理植硅体碳占总碳的比例最高，N0Si0处理最低。不同器官之间，不同处理植硅体碳占总碳的比例从高到低依次为叶、枝、篼、秆，平均分别为6.9%、6.5%、3.5%和1.7%。同一器官不同处理之间，在同一氮添加水平下随着硅添加量的增加，植硅体碳占总碳的比例不断升高。
3. 讨论
3.1 毛竹植硅体、植硅体碳的形成与硅密切相关
硅是地壳中第二大元素，其蕴藏量仅次于氧，在地球化学碳循环中起着重要的作用[16]。研究表明：植物对硅的吸收利用分为对单硅酸的跨膜吸收和沿维管束的运输2个过程，其中植物对硅的吸收能力取决于土壤溶液中单硅酸的浓度和植物根系硅转运蛋白的表达量[17]。动力学研究表明：外部单硅酸浓度的升高能够有效促进其以被动扩散或主动运输的形式被跨膜吸收[18−19]。土壤中的有效硅到达植物根部后才能开始随蒸腾流沿着维管束运输的第2个过程，并且具有边运输边形成聚合硅酸的能力[20]，最终在植物组织的蒸腾末端沉积，形成稳定的无定型二氧化硅颗粒，表明植物对硅的吸收利用最终依赖于特异性硅转运蛋白和蒸腾作用。
植硅体在植物抗寒、抗逆等方面[4, 21]具有重要的作用。硅被植物吸收后主要以植硅体的形式存在于植物体内，因此植物体内植硅体质量分数取决于植物吸收利用硅的能力。本研究中毛竹不同器官之间硅与植硅体质量分数差异较大，但表现出相同的变化规律和极显著相关关系，表明毛竹不同器官对硅利用的能力不同，也表明了硅与植硅体之间存在的密切联系。这与ZUO等[22]对黍Panicum miliaceum、粟Setaria italica的研究，LI等[23]对湿地芦苇Phragmites australis的研究，PARR等[24]对竹林的研究及SONG等[25]对中国草原植被的研究结果相同，证明了植物体中植硅体质量分数明显受植物对硅富集能力的影响。
植硅体碳形成于植硅体积淀的过程中。LI等[26]在对白洋淀芦苇的研究中指出：植硅体碳质量分数与植物吸收利用CO2速率有直接的关系。SONG等[13]在中国不同森林类型植硅体碳封存估测的研究中提出：植硅体碳质量分数与硅质量分数之间存在密切的联系，并且以硅质量分数的3%作为计算植硅体碳的标准。本研究设计硅外源添加以增加毛竹对硅的吸收利用，同时设计氮外源添加提高毛竹光合作用效率及吸收利用CO2的能力，并对不同处理硅、植硅体和植硅体碳质量分数进行分析，发现硅、植硅体和植硅体碳在毛竹不同器官之间的变化规律呈现高度的一致性，并且随着外源氮和硅添加量的变化，毛竹不同器官植硅体与植硅体碳仍然表现出相似的变化规律；除此之外，植硅体与植硅体碳之间及硅与植硅体碳质量分数之间均存在极显著的正相关关系。这一结果与已有竹类植物植硅体碳相关研究结果一致[8, 13, 27]，反映了竹林生态系统中硅与植硅体碳之间的内在联系，表明外源硅的添加是毛竹不同器官植硅体碳质量分数增加的主要原因，证明了硅的添加能够促进毛竹植硅体碳汇能力提升。
3.2 毛竹不同器官对外源氮添加的响应差异明显
氮是植物生长最重要的营养元素之一，对于植物光合效率的提高及养分的吸收、利用、积累具有直接的影响[12]。植物对氮的吸收过程复杂且多样，主要包括主动性和被动性吸收2个途径，与光照、温度、pH等环境因素密切相关，与硅的吸收利用相关性较小。本研究中氮-硅交互作用分析结果表明：氮与硅之间均不存在交互作用的显著性，也进一步说明毛竹对氮和硅的吸收是2个相互独立的过程。毛竹叶中碳、氮和植硅体碳质量分数均随着外源氮添加量的增加不断提高，但硅与植硅体质量分数却不断下降 ，主要是由于外源氮的添加极大地促进了叶的生长，导致净生物量在短期内快速积累，而植物对硅的吸收动力主要来源于蒸腾作用[12]，在短期内并不会出现大幅变化，因此造成了净生物量积累与植硅体积累不协调的现象，也说明了虽然本研究中硅的添加促进了毛竹对硅的吸收，但氮的添加增加了有机物质的积累，对植硅体形成了稀释效应，因此表现为低氮添加处理植硅体质量分数更高的现象。
随着叶片的老化，大部分氮被转移再利用[28]，凋落物氮和碳质量分数均大幅降低，但硅、植硅体和植硅体碳质量分数却并未随之下降，且随着外源氮添加量的增加，凋落物中硅和植硅体碳质量分数有所增加，植硅体质量分数却有所降低，表明尽管外源氮的添加促进了硅的吸收和有机物质的积累，但被吸收的硅并没有形成稳定的植硅体，对植硅体碳的贡献有限，也说明尽管毛竹对氮和硅的吸收利用交互作用不显著，但硅的吸收仍然与氮的添加有关。
进一步对不同处理不同器官及凋落物中植硅体碳占总碳比进行分析，可以更清晰地表明：单纯的氮添加能够促进有机物质的快速积累，但对于提高植硅体碳在总碳中的比例作用有限，而硅的添加对提高植硅体碳在总碳中的比例作用更为明显，这一点也被外源氮添加后碳和植硅体碳呈极显著负相关所证明。
3.3 氮和硅添加对植硅体稳定性的影响
植硅体的稳定性主要决定于其形态、颗粒大小、组分和结构[29−32]。有研究表明：外源硅的添加增加了土壤溶液中单硅酸的浓度，外源氮和硅的添加共同促进了毛竹对硅的吸收，进而增加植硅体在植物体内的积累[33−35]，但是这种靠人为因素增加的植硅体已被证明主要是轻组植硅体[31]，其稳定性、抗腐蚀能力等均远小于重组植硅体[34, 36]，且氮的添加促进了毛竹对氮的吸收利用，改变了植硅体组成成分[31]，因此尽管高氮处理促进了毛竹凋落物硅质量分数的增加，但植硅体质量分数仍较低。表明虽然氮的添加对毛竹吸收硅的影响不显著，但对毛竹吸收硅后形成的植硅体的稳定性有显著影响。
4. 结论
毛竹叶中氮质量分数最高，秆中碳质量分数最高，凋落物中硅、植硅体和植硅体碳质量分数均最高。外源氮添加有助于毛竹对硅的吸收和有机物质的积累，外源硅添加有助于毛竹植硅体和植硅体碳质量分数的增加以及植硅体碳占碳比例的提高。
-
图 1 4 ℃低温处理不同时间下EgrCIN1的定量表达
Figure 1 Relative expression of EgrCIN1 gene under 4 ℃ low temperature treatment for different time
图 2 EgrCIN1蛋白二级结构(A)和跨膜结构(B)预测
Figure 2 Prediction of EgrCIN1 protein secondary structure (A) and transmembrane structure (B)
图 3 EgrCIN1在巨桉不同组织中的定量表达
Figure 3 Quantitative expression of EgrCIN1 in different tissues of E. grandis
图 4 EgrCIN1蛋白在烟草表皮细胞中的表达(标尺为50 μm)
Figure 4 Expression of EgrCIN1 protein in tobacco epidermis cell(the bar is 50 μm)
图 5 野生型和EgrCIN1过表达转基因株系中EgrCIN1的半定量PCR
Figure 5 Semi-quantitative PCR of EgrCIN1 in wild type and EgrCIN1 overexpression transgenic lines
图 6 野生型和EgrCIN1转基因株系低温处理后的表型(A)和存活率(B)
Figure 6 Phenotype (A) and survival (B) of wild-type and EgrCIN1 transgenic lines after cold treatment
图 7 野生型和EgrCIN1过表达株系0.5 μmol·L−1 ABA处理10 d后的表型
Figure 7 Phenotypes of wild-type and EgrCIN1 overexpression lines treated with 0.5 μmol·L−1 ABA after 10 days
图 8 巨桉幼苗高盐、干旱(A)和ABA、MeJA(B)处理下EgrCIN1的定量表达
Figure 8 Quantitative expression of EgrCIN1 in E. grandis seedlings under high salt, drought (A) and ABA, MeJA (B) treatments
表 1 引物列表
Table 1. Primers
用途 引物名称 引物序列(5′→3′) 35S::EgrCIN1载体构建 35S::EgrCIN1-F cgggggtaccATGGCTTCTTCACCTTGCAAAA 35S::EgrCIN1-R gctctagaTCATCGGACATGGGGAATTACA 35S::EgrCIN1::GFP载体构建 EgrCIN1::GFP-F gctctagaATGGCTTCTTCACCTTGCAAAA EgrCIN1::GFP-R cgggggtaccTCGGACATGGGGAATTACA 半定量PCR EgrCIN1-F AGCCTATGCTTGTACTCCACCA EgrCIN1-R TTGCCGCCCTCGGCGCGGATGA AtACTIN-F TAGGCCAAGACATCATGGTGTCAT AtACTIN-R GTTGTACGACCACTGGCGTACAAG RT-qPCR EgrACTIN-F CCCGCTATGTATGTCGC EgrACTIN-R AAGGTCAAGACGGAGGAT qEgrCIN1-F ATGGCTTCTTCACCTTGCAAAA qEgrCIN1-R TCATCGGACATGGGGAATTACA 说明：引物前小写字母为酶切位点及保护碱基 
下载: 导出CSV
表 2 EgrCIN1基因启动子上的顺式作用元件
Table 2. Cis-elemtents in the promoter of EgrCIN1
名称 位置 基序(5′→3′) 数量 功能 ABRE 1 165−、1 165+ GTGCAC 2 ABA响应元件 ERE 706+ ATTTAAA 1 乙烯响应元件 LTR 420− AAAGCC 1 低温响应元件 MYB 1 378+、1 152−、1 330+、1 378+ TAACCA 4 干旱、ABA响应元件 MYC 104−、935−、630−、622+、1 015−、668+ CATTTG 6 干旱、ABA响应元件 W-box 1 012−、1 280−、1 149− TTGACC 3 真菌诱导反应元件 说明：+表示正义链，−表示反义链
下载: 导出CSV
-
[1] 任延靖, 郭怡婷, 赵孟良. 植物应答低温胁迫的研究进展[J]. 分子植物育种, 2020, 18(14): 4775 − 4781. REN Yanjing, GUO Yiting, ZHAO Mengliang. Research progress of response to low temperature stress in plant [J]. Mol Plant Breed, 2020, 18(14): 4775 − 4781. [2] RAMANKUTTY N, EVAN A T, MONFREDA C, et al. Farming the planet (1) Geographic distribution of global agricultural lands in the year 2000 [J]. Glob Biogeochem Cycles, 2008, 22(1): 1 − 19. [3] RITONGA F N, CHEN S. Physiological and molecular mechanism involved in cold stress tolerance in plants [J]. Plants, 2020, 9(5): 1 − 13. [4] 成京晋, 李浩, 早浩龙, 等. 植物响应低温胁迫的分子调控机制[J]. 分子植物育种, 2021, 19(9): 3104 − 3115. CHENG Jingjin, LI Hao, ZAO Haolong, et al. Molecular regulation mechanism of plant response to cold stress [J]. Mol Plant Breed, 2021, 19(9): 3104 − 3115. [5] PARK S, LEE C M, DOHERTY C J, et al. Regulation of the Arabidopsis CBF regulon by a complex low-temperature regulatory network [J]. Plant J, 2015, 82(2): 193 − 207. [6] DING Yangling, HUI Li, ZHANG Xiaoyan, et al. OST1 kinase modulates freezingtolerance by enhancing ICE1 stability in Arabidopsis [J]. Dev Cell, 2015, 32(3): 278 − 289. [7] MARUYAMA K, SAKUMA Y, KASUGA M, et al. Identification of cold-inducible downstream genes of the Arabidopsis DREB1A/CBF3 transcriptional factor using two microarray systems [J]. Plant J, 2004, 38(6): 982 − 993. [8] EREMINA M, ROZHON W, POPPENBERGER B. Hormonal control of cold stress responses in plants [J]. Cell Mol Life Sci, 2016, 73(4): 797 − 810. [9] DREYER A, DIETZ K J. Reactive oxygen species and the redox-regulatory network in cold stress acclimation [J]. Antioxidants, 2018, 7(11): 169 − 184. [10] ÖQUIST G, HUNER N P. Photosynthesis of overwintering evergreen plants [J]. Ann Rev Plant Biol, 2003, 54(1): 329 − 355. [11] LEFEVERE H, BAUTERS L, GHEYSEN G. Salicylic acid biosynthesis in plants [J]. Front Plant Sci, 2020, 11: 1 − 7. [12] WASTERNACK C, HAUSE B. The missing link in jasmonic acid biosynthesis [J]. Nat Plants, 2019, 5(8): 776 − 777. [13] MILBORROW B. The pathway of biosynthesis of abscisic acid in vascular plants: a review of the present state of knowledge of ABA biosynthesis [J]. J Exp Bot, 2001, 52(359): 1145 − 1164. [14] SZABADOS L, SAVOURE A. Proline: a multifunctional amino acid [J]. Trends Plant Sci, 2010, 15(2): 89 − 97. [15] CHAN K X, PHUA S Y, CRISP P, et al. Learning the languages of the chloroplast: retrograde signaling and beyond [J]. Ann Rev Plant Biol, 2016, 67(1): 25 − 53. [16] MANTRI N, PATADE V, PENNA S, et al. Abiotic stress responses in plants: present and future[M]//AHMAD P, PRASAD M. Abiotic Stress Responses in Plants. New York: Springer, 2012: 1 − 19. [17] OBERSCHELP G P J, GUARNASCHELLI A B, TESON N, et al. Cold acclimation and freezing tolerance in three Eucalyptus species: a metabolomic and proteomic approach [J]. Plant Physiol Biochem, 2020, 154: 316 − 327. [18] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR [J]. Methods, 2002, 25(4): 402 − 408. [19] CROSATTi C, RIZZA F, BADECK F W, et al. Harden the chloroplast to protect the plant [J]. Physiol Plant, 2013, 147(1): 55 − 63. [20] ZHOU Aimin, SUN Hongwei, FENG Suang, et al. A novel cold-regulated gene from Phlox subulata, PsCor413im1, enhances low temperature tolerance in Arabidopsis [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2018, 495(2): 1688 − 1694. [21] XIN K X, PAN T, GAO S, et al. A transcription factor regulates gene expression in chloroplasts [J]. Int J Mol Sci, 2021, 22(13): 6769 − 6779. [22] de CLERCQ I, van de VELDE J, LUO Xiaopeng, et al. Integrative inference of transcriptional networks in Arabidopsis yields novel ROS signalling regulators [J]. Nat Plants, 2021, 7(4): 500 − 513. [23] THALHAMMER A, BRYANT G, SULPICE R, et al. Disordered cold regulated15 proteins protect chloroplast membranes during freezing through binding and folding, but do not stabilize chloroplast enzymes in vivo [J]. Plant Physiol, 2014, 166(1): 190 − 201. [24] AGARWAL P, JHA B. Transcription factors in plants and ABA dependent and independent abiotic stress signalling [J]. Biol Plant, 2010, 54(2): 201 − 212. [25] GUO Qianqian, LI Xia, NIU Li, et al. Transcription-associated metabolomic adjustments in maize occur during combined drought and cold stress [J]. Plant Physiol, 2021, 186(1): 677 − 695. [26] RUIBALl C, CASTRO A, FLEITAS A L, et al. A chloroplast COR413 protein from Physcomitrella patens is required for growth regulation under high light and ABA responses [J/OL]. Front Plant Sci, 2020, 11: 845[2022-04-10]. doi: 10.3389/fpls.2020.00845. [27] SUN Xinbo, ZHU Junfei, LI Xin, et al. AsHSP26.8a, a creeping bentgrass small heat shock protein integrates different signaling pathways to modulate plant abiotic stress response [J]. BMC Plant Biol, 2020, 20(1): 1 − 19. -
-
链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20220348
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 522
- HTML全文浏览量: 135
- PDF下载量: 137
- 被引次数: 0
