下载:
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中药荆芥是唇形科Labiatae植物荆芥Schizonepeta tenuifolia干燥后的地上部分，有解表祛风、透疹止血等功效[1]。荆芥的挥发油、黄酮等活性成分被广泛用于医药、食品和化工等领域[2-3]。
HD-Zip (Homeodomain-leucine zipper protein)基因家族是植物界一类特有的转录因子，在植物的生长发育、适应环境及胁迫应答等方面起到重要作用。HD (Homeodomain)蛋白是由Homeobox (HB)基因编码的高度保守的蛋白质结构域，由60个氨基酸组成。该蛋白中存在1个特征性的三螺旋结构，可以特异结合DNA序列，以此对基因进行调控[4−5]。此外，HD-Zip基因家族还有1个亮氨酸拉链保守结构域(leucine zipper-loop-zipper，LZ)，这是蛋白形成二聚体所必需的结构。根据蛋白的序列保守性、蛋白功能、基因结构等，将该家族分为4个亚家族：HD-Zip Ⅰ ~Ⅳ[6]。Ⅰ亚家族主要参与非生物胁迫及环境适应性；Ⅱ亚家族主要与生长素响应相关；Ⅲ亚家族主要参与不同的发育事件，例如顶端分生组织、维管束的发育，还与植物激素调控相关；Ⅳ亚家族主要在植物的表皮中特异性表达，主要调节表皮的分化、毛状体形成等[7]。
目前，HD-Zip基因家族在多种植物中被鉴定并表征，例如拟南芥Arabidopsis thaliana[8]、水稻Oryza sativa[9]、小麦Triticum aestivum[10]等，但尚未有荆芥HD-Zip基因家族的相关研究。本研究以荆芥的基因组作为基础，利用生物信息学方法系统鉴定荆芥HD-Zip基因家族成员，并对其蛋白质理化性质、染色体定位、基因结构、共线性分析以及不同时期的表达规律进行分析，为今后深入研究荆芥基因家族的功能和调控机制奠定基础。
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基于已知的HD-Zip基因家族的保守结构域，在荆芥基因组数据中进行初步筛选，利用TBtools (v1.98741)的“Blast Compare Two Seqs”，下载的蛋白序列为Query Seq，荆芥基因组的蛋白序列为Subject Seq，设置E-value为10−10进行比对[11]。根据HD-Zip基因家族在美国国家生物技术信息中心(NCBI)中的比对结果，得到目的基因编码蛋白的保守结构域，使用“Visualize NCBI CDD Domain Pattern”进行保守结构域的可视化。利用在线网站ExPASy (
https://www.expasy.org/ )对蛋白序列的基本理化性质，如氨基酸数目、等电点和分子质量等进行预测。 -
在NCBI在线网站上下载已被表征的HD-Zip基因家族的蛋白序列。将经过筛选的荆芥HD-Zip蛋白序列与下载的蛋白序列利用MEGA X进行最大似然 (ML)进化树的构建。选择最优氨基酸替代模型，根据氨基酸模型结果构建ML树，设置bootstrap为1000，partial deletion为80%。利用在线网站iTOL (
https://itol.embl.de/# )对进化树进行美化。 -
在荆芥基因组中搜索HD-Zip基因在染色体上的具体位置和每条染色体的总长度，利用TBtools中的“Visualize Gene Structure (Basic)”功能，对筛选的基因ID进行基因结构的可视化。利用在线网站MEME (
https://meme-suite.org/meme/tools/meme )对筛选的荆芥HD-Zip基因编码的蛋白序列进行蛋白保守基序预测，设置基序数量为10个，选择“Zero or One Occurence Per Sequence (zoops)”分布基序。采用TBtools中的“Visualize MEME/MSAT Motif Pattern”进行保守基序的可视化处理。 -
利用TBtools的“Gene Location Visualize from GTF/GFF”进行基因在染色体分布的可视化。将筛选的基因序列利用TBtools中的“Gene Location Visualize fron GTF/GFF”功能进行染色体定位分析；提取荆芥HD-Zip基因序列的启动子部分(5′UTR上游2000 bp)，利用PlantCARE在线网站(
http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ )预测顺式元件并整理结果，再利用TBtools中的“Gene Structure View (Advanced)”对其进行可视化处理。使用MCScanX软件进行基因组内荆芥HD-Zip基因的共线性分析以及与拟南芥基因组间的共线性分析，并利用Circos软件绘制基因组内和基因组之间的共线性图谱。 -
根据HD-Zip基因ID于不同时期荆芥叶片(10、20、35 d)及根(35 d)的转录组数据中进行搜索，得到基因的FPKM (fragments per kilobase per million)值，利用TBtools的“HeatMap”绘制基因表达热图，探究HD-Zip基因家族的表达模式。
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荆芥基因组大小为798 Mb，Q20(碱基被测错的概率为1%)为94.67%，Q30(碱基被测错的概率为1‰)为89.41%，说明测序质量较好(Q20≥93%、Q30≥86%)，GC含量为39.34%，经过Hi-C组装后，共有696 Mb的基因组序列被定位到6条染色体上(Chr 01~06)，占比91.38%。以上数据说明荆芥的基因组质量较好，有助于完整地挖掘HD-Zip基因家族。为了鉴定荆芥中HD-Zip基因，根据4个亚家族HD-Zip Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的蛋白保守结构域进行筛选，共筛选到42条可能的HD-Zip基因家族序列，其中HD-Zip Ⅰ亚家族16条，HD-Zip Ⅱ亚家族7条，HD-Zip Ⅲ亚家族5条，HD-Zip Ⅳ亚家族14条，并通过在线网站Expasy网站进行蛋白分子量和等电点的预测(表1)。其中40条基因全部定位到对应染色体(Chr 01~06)，Sch000029960和Sch000004651未锚定在染色体上(图1)。荆芥HD-Zip基因仅在2~4号染色体上集中分布，说明该基因家族在染色体上分布不均匀。荆芥HD-Zip的基因长度为528~2586 bp；分子量为20.33~94.18 kDa；等电点为4.59~9.05。因此，HD-Zip的基因和蛋白长度跨度较大，HD-Zip Ⅲ和Ⅳ的基因长度约2000 bp，HD-Zip Ⅰ和Ⅱ在1000 bp以下，该结果与分子量具有相关性，而等电点主要取决于氨基酸中酸性氨基酸和碱性氨基酸的数量比，大多数蛋白(76.2%)等电点小于7.0，证明荆芥HD-Zip可能是一类酸性蛋白。
表 1 荆芥HD-Zip基因家族的蛋白特征
Table 1. Protein characteristics of HD-Zip gene family in S. tenuifolia
亚家族 基因ID CDS长
度/bp蛋白长
度/个分子量/
kDa等电点 染色体 亚家族 基因ID CDS长
度/bp蛋白长
度/个分子量/
kDa等电点 染色体 HD-Zip Ⅰ Sch000003181 900 299 33.847 4.88 Chr 01 Sch000003831 528 175 20.331 8.58 Chr 01 Sch000016777 897 298 34.379 6.55 Chr 04 Sch000019486 822 273 31.100 4.59 Chr 04 HD-Zip Ⅲ Sch000001735 2562 853 93.306 5.74 Chr 01 Sch000026498 927 308 35.350 5.01 Chr 06 Sch000019857 2511 836 91.461 5.94 Chr 04 Sch000008725 822 273 31.034 4.83 Chr 02 Sch000014693 2493 830 91.021 5.84 Chr 03 Sch000005997 912 303 34.369 4.97 Chr 02 Sch000026324 2586 861 94.183 6.14 Chr 06 Sch000020328 966 321 35.730 4.81 Chr 04 Sch000028231 2529 842 92.434 6.17 Chr 06 Sch000016424 867 288 32.633 6.32 Chr 04 Sch000017902 879 292 33.207 6.07 Chr 04 HD-Zip Ⅳ Sch000026062 2166 721 79.071 5.98 Chr 06 Sch000002474 876 291 32.531 5.7 Chr 01 Sch000008059 2163 720 79.056 6.23 Chr 02 Sch000008983 696 231 26.832 6.32 Chr 02 Sch000029960 2181 726 79.526 5.64 HiC_scaffold_8 Sch000006831 693 230 26.615 6.96 Chr 02 Sch000011892 2418 805 87.913 5.79 Chr 03 Sch000019278 600 199 22.673 8.44 Chr 04 Sch000009216 2196 731 79.888 5.79 Chr 02 Sch000021651 546 181 21.788 5.84 Chr 05 Sch000019506 2400 799 87.073 6.04 Chr 04 Sch000013738 654 217 24.934 7.59 Chr 03 Sch000012322 2490 829 91.502 5.41 Chr 03 Sch000016710 621 206 24.472 5.44 Chr 04 Sch000012213 2490 829 91.502 5.41 Chr 03 Sch000004651 2490 829 91.502 5.41 HiC_scaffold_100 HD-Zip Ⅱ Sch000028530 891 296 327.360 7.52 Chr 06 Sch000018911 2070 689 77.061 6.28 Chr 04 Sch000010966 879 292 32.623 7.62 Chr 03 Sch000005323 1944 647 73.264 7.27 Chr 02 Sch000019272 795 264 294.950 8.59 Chr 04 Sch000022402 2307 768 84.180 5.81 Chr 05 Sch000008316 783 260 29.093 8.12 Chr 02 Sch000024046 2274 757 84.279 6.15 Chr 06 Sch000025447 879 292 32.351 9.05 Chr 06 Sch000008675 1884 627 69.905 6.18 Chr 02 Sch000011951 645 214 24.334 8.24 Chr 03 说明：CDS指蛋白编码区 
图 1 荆芥HD-Zip基因家族的染色体定位
Figure 1. Chromosome mapping of HD-Zip gene family in S. tenuifolia
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将以上42条蛋白序列与已知的HD-Zip蛋白序列进行ML树的构建(图2)，可知：荆芥的HD-Zip和拟南芥及其他物种HD-Zip的蛋白序列被聚为四大支，与已表征HD-Zip基因家族的4个亚家族分类一致，且在荆芥基因组中，每个亚家族基因的占比与拟南芥的HD-Zip Ⅰ ~Ⅳ之间的比例相似，其中HD-Zip Ⅰ与Ⅳ占比最大，HD-Zip Ⅲ占比最少。从进化树中可以发现：HD-Zip Ⅲ先与Ⅳ聚为一支，再与HD-Zip Ⅰ和Ⅱ聚为一支，说明HD-Zip Ⅲ可能与Ⅳ的亲缘关系更近。
图 2 荆芥与拟南芥及其他物种HD-Zip基因家族的最大似然值进化树
Figure 2. ML evolutionary tree of HD-Zip gene family between S. tenuifolia and A. thaliana and other species
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利用TBtools软件绘制荆芥HD-Zip基因结构图，分析基因内含子和外显子的分布情况。图3显示：HD-Zip Ⅰ与Ⅱ的基因长度较为相近，内含子1~3个(实线)，外显子2~4个(黄色标识)，基因结构比较简单。HD-Zip Ⅲ与Ⅳ基因长度较为接近，内含子8~17个，外显子9~17，其中HD-Zip Ⅲ的内含子和外显子的数量最多。以上基因结构和长度结果与ML进化树聚类结果较为一致。
图 3 荆芥HD-Zip基因家族的基因结构分析
Figure 3. Gene structure analysis of HD-Zip gene family in S. tenuifolia
利用在线网站MEME对42条HD-Zip基因家族的蛋白序列进行保守基序(Motif)的检索，一共确认了10个不同的基序(图4)。其中，所有蛋白均存在Motif 1~3，这3个保守基序构成了HD-Zip基因家族特征的保守基序HD、LZ。HD-Zip Ⅲ和Ⅳ的Motif 4、Motif 5构成HD-Zip Ⅲ和Ⅳ特有的START保守结构域。从Motif结构分布上看到，HD-ZipⅢ和Ⅳ的Motif最为丰富，可能具有多样的生物学功能，每个亚家族之间的Motif分布较为一致。
图 4 荆芥HD-Zip基因家族的保守基序分析
Figure 4. Conservative motif analysis of HD-Zip gene family in S. tenuifolia
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提取荆芥HD-Zip的5′UTR上游的2 kb序列为启动子序列，利用在线网站PlantCARE进行顺式元件的预测，其中光响应的顺式元件出现频率最高，其次为脱落酸响应元件，MeJA响应元件，厌氧感应元件以及MYB结合的位点(图5)。说明该基因家族可能与以上的生物学功能相关。
图 5 荆芥HD-Zip基因家族的顺式作用元件分布
Figure 5. Distribution of cis-acting elements of HD-Zip gene family in S. tenuifolia
对荆芥的42个HD-Zip家族基因进行基因组内串联重复分析，发现Sch000008983和Sch000006831在Chr 02上串联重复，Sch000012213与Sch000012322在Chr 03上串联重复(图6)；经过基因组内的共线性分析发现，荆芥的9个HD-Zip家族基因在基因组内存在共线性，说明成对的共线性基因可能具有极为相似的功能(图7)。通过荆芥与拟南芥的基因组之间的共线性分析发现：一共有37对共线性的HD-Zip基因(图8)。综上，通过与拟南芥HD-Zip基因构建进化树分析及共线性分析，有助于利用拟南芥的基因功能推断荆芥HD-Zip中相应基因的功能。
图 6 荆芥HD-Zip基因家族的组内串联重复分析
Figure 6. Tandem repeat analysis of HD-Zip gene family in genome of S. tenuifolia
图 7 荆芥HD-Zip基因家族的组内共线性分析
Figure 7. Intra-group collinearity analysis of HD-Zip gene family in S. tenuifolia
图 8 荆芥HD-Zip与拟南芥基因组之间的共线性分析
Figure 8. Collinear analysis of HD-Zip gene between S. tenuifolia and A. thaliana genomes
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根据课题组前期观察，10 d幼苗的叶子和茎具有丰富的指状腺毛，20 d幼苗的叶子和茎具有较多的头状腺毛和腺鳞，35 d幼苗的叶子和茎具有丰富的腺鳞。因此，对荆芥不同生长时期叶片(10、20、35 d)及根(35 d)进行转录组分析，发现HD-Zip Ⅰ主要在幼叶10 d中表达，HD-ZipⅡ和Ⅲ主要在根中表达，HD-Zip Ⅳ亚家族主要在叶中表达(图9)。研究发现：HD-Zip Ⅳ基因主要调节表皮的分化[12]，结合荆芥腺毛的分布情况，推测荆芥的HD-Zip Ⅳ与荆芥腺毛和非腺毛的形成与分化相关。
图 9 HD-Zip家族基因表达模式
Figure 9. HD-Zip family gene expression pattern
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本研究从全基因组水平对荆芥的HD-Zip基因家族进行了系统的研究，共鉴定到42个HD-Zip家族的基因，根据识别的DNA序列、结构域、蛋白功能，可将这些序列分为4个亚家族，分别为HD-Zip Ⅰ ~Ⅳ，这与拟南芥、小麦、水稻、玉米Zea mays、土豆Solanum tuberosum、烟草Nicotiana tabacum等中的分类一致[7-9, 13-15]。HD-Zip Ⅰ只含有高保守的HD结构域和位于HD结构域羧基端的LZ结构域；HD-Zip Ⅱ除了HD-Zip Ⅰ具有的HD和LZ保守结构域外，还存在1个高度保守的N-末端；HD-Zip Ⅲ具有HD和LZ保守结构域，以及类固醇合成急性调节蛋白相关的脂质转运结构域(START)和氨基酸序列羧基端的MEKHLA基序，其中START结构域的长度为220个氨基酸且可以结合并转移脂质，MEKHLA基序与许多非生物胁迫应答相关[16-17]；HD-Zip Ⅳ结构与HD-Zip Ⅲ非常相似，具有HD、LZ、START结构域，但缺失了MEKHLA基序[18]。荆芥的HD-Zip Ⅰ和Ⅳ亚家族的基因所占比例最高，这与拟南芥HD-ZipⅠ和Ⅳ的比例相似。基因的进化树结果显示：HD-Zip Ⅰ与Ⅱ亲缘关系更近，HD-Zip Ⅲ与Ⅳ亲缘关系更近，由此可以推测以上2个分支可能是由相同的祖先进化而来，或者Ⅳ是由Ⅲ进化来，但在分化过程中丢失了MEKHLA基序[19]。结合基因的结构来看，HD-Zip Ⅲ和Ⅳ的结构比HD-Zip Ⅰ与Ⅱ的结构更为复杂，以上结果说明可能HD-Zip Ⅲ与Ⅳ相比于HD-ZipⅠ和Ⅱ进化程度更高，基因结构更为复杂，以上结果与保守结构域分析和进化树的分析结果一致。这说明HD-Zip家族在物种的亚群内部较为保守，但其具体的基因功能可能会由于基因复制或者进化，以及物种间的差异性从而出现一定的差异。
分析启动子发现：在每个亚族内部的基因启动子区顺式作用元件类型基本相同，例如MYB结合位点、脱落酸响应元件以及MeJA响应元件在HD-Zip Ⅳ高频出现。同时，同一亚族基因编码蛋白的保守基序也基本相同，HD-Zip Ⅰ ~Ⅳ的表达分析发现：HD-Zip Ⅰ ~Ⅳ具有不同的表达偏好性，说明荆芥中不同HD-Zip家族不同亚家族可能具有不同的生物学功能，但同一亚族各基因的生物学功能基本相同。
有研究表明：HD-Zip Ⅳ在表皮中特异表达，参与植物表皮细胞的分化，调节毛状体(腺毛和非腺毛)等形成与发育。如烟草中的NtHDG2，拟南芥的PDF2，黄花蒿Artemisia annua的AaHD1和AaHD8，番茄Solanum lycopersicum的SlCD2和SlWo均对毛状体具有调控作用，属于HD-Zip Ⅳ[14, 20-22]。本研究中发现荆芥的HD-Zip Ⅳ亚家族基因大部分在叶片表达，推测可能这些基因与毛状体的发育相关。结合拟南芥与荆芥HD-Zip基因家族的共线性分析，可以推测荆芥HD-Zip基因家族的生物学功能。结合文献，发现Sch000029960与AT4G21750.1及AT4G04890.2为同源基因，AT4G21750.1及AT4G04890.2分别编码拟南芥的GL2-like和PDF2，与拟南芥的表皮发育密切相关。Sch000024046与AT1G79840.2为同源基因，AT1G79840.2编码GL2，在拟南芥中影响表皮细胞的特性，包括毛状体、根毛发育等[23]。在荆芥的叶、茎、花穗等多个部位表面分布着多种腺毛及非腺毛，其中，盾状腺毛即腺鳞被认为是荆芥产生挥发油的“品质载体”[24-25]，但是调控荆芥腺鳞生长发育的分子机制还未被报道，本研究中筛选的HD-Zip Ⅳ亚基因家族可能为腺鳞发育调控的候选基因。通过对候选基因功能的验证、共表达分析等为腺鳞生长发育分子机制的阐明提供线索，同时为提高荆芥药用品质提供理论基础。
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本研究在荆芥全基因水平上筛选到42条HD-Zip基因序列，并对以上序列的基因结构、保守基序、顺式作用元件等进行了分析。系统发育分析可将42条序列分为4个亚家族(HD-Zip Ⅰ ~Ⅳ)。通过与拟南芥基因组之间的共线性分析、表达模式分析等推测，荆芥的HD-Zip Ⅳ亚家族基因可能在毛状体发育过程中起到重要作用。这些结果为后续荆芥的HD-Zip基因家族的功能研究及表征提供了理论基础。
Genome-wide identification and expression analysis of HD-Zip gene family in Schizonepeta tenuifolia
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摘要:
目的 鉴定荆芥Schizonepeta tenuifolia的HD-Zip基因家族，利用生物信息学方法分析其在全基因组中的分布和相关特征以及在不同时期中的表达规律，为该家族基因的进一步研究奠定基础。 方法 根据已经表征的HD-Zip基因，筛选荆芥基因组内的HD-Zip基因序列，利用MEME、PlantCARE、NCBI、MEGA X、MCScanX、Circos等在线网站及软件对蛋白序列进行基本理化性质分析、进化树构建、染色体定位、基因结构分析、共线性基因分析等。 结果 在荆芥全基因组中共鉴定到42条HD-Zip基因序列，它们可被分为4个亚家族，分别含有16、7、5、14个基因，亚家族之间的基因长度、结构及保守基序差异显著，但在亚家族内部保守，荆芥基因组与拟南芥Arabidopsis thaliana基因组共线性分析发现有37对基因，可能具有相似的生物学功能。荆芥的4个亚家族基因的顺式元件中均高频出现了光响应、脱落酸响应、MeJA响应等元件，在不同生长时期的叶片及部位的转录组数据中具有不同的表达趋势，Ⅰ亚家族主要在幼叶中表达，Ⅱ和Ⅲ亚家族主要在根中在表达，Ⅳ亚家族主要在叶中表达。 结论 在荆芥基因组中共获得42条HD-Zip基因序列，被分为4个亚家族(HD-ZipⅠ~Ⅳ)，亚家族内部高度保守，亚家族之间差异显著，其基因结构、保守结构域及表达模式不同。亚家族Ⅰ和Ⅱ，亚家族Ⅲ和Ⅳ亲缘关系更近，HD-Zip基因具有组织表达差异性，协同调控了荆芥的生长发育和次生代谢。图9表1参25 -
关键词:
- 荆芥 /
- HD-Zip基因家族 /
- 表达分析 /
- 系统进化
Abstract:Objective This study, with the identification of the HD-Zip gene family in Schizonepeta tenuifolia and an bioinformatic analysis of its distribution and related characteristics in the whole genome and expression pattern in different stages, is aimed to provide a basis for further study of this gene family. Method Genes in the genome were first screened in accordance with the characterized HD-Zip genes before MEME, Plant CARE, NCBI, MEGA X, MCScanX and Circos were used for the analysis of the basic properties of protein sequences, the construction of Maximum Likeliood (ML) tree, mapping of chromosomes and the analysis of gene structure and colinear gene respectively. Result (1) A total of 42 HD-Zip genes were identified and they could be divided into four subgroups(Ⅰ−Ⅳ), containing 16, 7, 5, 14 genes respectively. (2) The gene length, structure and Motif of the subgroups varied significantly from each though relatively reserved with in each of them. (3) The collinear analysis of the genome of S. tenuifolia and Arabidopsis thaliana showed that 37 pairs of genes may have similar biological functions with light response, abscisic acid response and MeJA response found in cis-elements of 4 subfamily genes promoters of S. tenuifolia, showing different expression profiles in the transcriptome data of different growth stages of leaves and different parts. (4) The HD-ZipⅠ was mainly expressed in young leaves, HD-Zip Ⅱ and Ⅲ were mainly expressed in roots whereas HD-Zip Ⅳ was mainly expressed in leaves. Conclusion The total 42 HD-Zip genes obtained from S. tenuifolia genome were divided into 4 subgroups (Ⅰ−Ⅳ) with highly conserved genes and significant differences among subgroups with their gene structure, motif, and expression pattern being different. HD-ZipⅠ and Ⅱ, and HD-ZipⅢ and Ⅳ are more closely related to each other with HD-Zip genes expressed specifically indifferent tissues and synergistically regulating the growth, development and secondary metabolism of S. tenuifolia. The results of this study provide a bioinformatic reference for the further study of this family’s biological functions. [Ch, 9 fig. 1 tab. 25 ref.] -
Key words:
- Schizonepeta tenuifolia /
- HD-Zip gene family /
- expression analysis /
- system evolution
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桂花Osmanthus fragrans为木犀科Oleaceae木犀属Osmanthus，是中国十大传统名花之一，也是园林造景常用植物。根据开花时间不同，桂花可以分为秋桂和四季桂；根据花色差异，秋桂又可以分为丹桂、金桂和银桂。已有研究分析了桂花不同花色品种呈色物质成分，证实类胡萝卜素的种类及其质量分数是决定桂花花色的最主要因素[1−2]。目前，桂花类胡萝卜素的定性定量及其代谢途径中相关催化酶基因已被陆续分离得到[3−5]。桂花不同花色品种花瓣所含的类胡萝卜素中，β-胡萝卜素相对含量最高[1]。桂花番茄红素β-环化酶OfLCYB具备使番茄红素两端环化转化为β-胡萝卜素的能力，且OfLCYB对番茄红素的底物亲和性强于其他番茄红素环化酶，是桂花类胡萝卜素代谢途径中的关键催化酶[6−7]。沈子又等[8]分离得到了OfLCYB基因启动子，发现其启动子序列均包含有TATA-box、CAAT-box响应元件及水杨酸、赤霉素、脱落酸等激素响应元件等，但目前有关桂花OfLCYB基因上游转录因子的筛选及鉴定鲜见报道。
已有研究认为：ERF[9]、MYB[10]、NAC[11]等转录因子参与调控植物类胡萝卜素代谢。AP2/ERF转录因子家族具有众多的家族成员。根据AP2/ERF结构域的数目和序列特征，AP2/ERF家族转录因子分为AP2、ERF、CBF/DREB、RAV和Soloist这5个亚组，其中ERF类转录因子仅含有1个AP2/ERF结构域。ERF转录因子通过结合下游靶基因的GCC (GCCGCC)或DRE (CCGAC)序列[12]调节基因的表达，参与调节植物生长发育、生物或非生物胁迫应答、调控果实成熟等。此外，在拟南芥Arabidopsis thaliana[9]、番茄Solanum lycopersicum[13]和苹果Malus domestica[14]中还发现B2亚组的ERF转录因子具有调控植物类胡萝卜素合成的功能。拟南芥B2亚组ERF转录因子包括At3g16770.1(AtERF72/AtRAP2.3)、At1g72360.2 (AtERF73)、At1g53910.1 (AtERF74/AtRAP2.2)等5个成员。AtRAP2.2蛋白可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上，从而调控相关基因的表达[15]。在苹果MdPSY1和MdPSY2基因启动子中也存在多个ATCTA顺式作用元件，能被AtRAP2.3的同源基因蛋白AP2D15强烈激活表达[14]。在黄龙胆Gentiana lutea[16]中，GlLCYB、GlLCYE、GlZEP、GlPDS、GlZDS、GlBCH基因的启动子上均存在ATCTA作用元件，说明ATCTA元件广泛存在于类胡萝卜素合成基因启动子上，表明B2亚组的ERF转录因子可能对一系列类胡萝卜素代谢基因具有调控作用。
本研究以桂花丹桂品种‘堰虹桂’O. fragrans ‘Yanhong Gui’为材料，首先对OfLCYB基因启动子的ATCTA顺式作用元件进行分析，再对桂花B2亚组的ERF转录因子基因进行序列分析和表达分析，利用酵母单杂交技术筛选和鉴定与OfLCYB互作的关键B2亚组的OfERF转录因子，不仅可以扩展桂花花色研究领域，同时为揭示桂花类胡萝卜素代谢的调控网络提供理论依据，为桂花品种培育和种质创新提供新的思路。
1. 材料与方法
1.1 材料
选择浙江农林大学桂花资源圃生长状况良好的地栽桂花品种‘堰虹桂’为材料，分别采集‘堰虹桂’的新鲜嫩叶以及顶壳期(S1)、铃梗期(S2)、初花期(S3)、盛开期(S4)的花瓣样品[17]，每个样品3次生物学重复，取样时间均为10:00。上述叶片与花瓣样品快速采集后放入液氮冷冻，随后保存于−80 ℃超低温冰箱，供后续使用。
1.2 方法
1.2.1 OfLCYB启动子序列分析、克隆及OfLCYB基因表达分析
根据诺禾致源的Ultraclean plant DNA purification Kit试剂盒操作说明提取‘堰虹桂’的嫩叶鲜样DNA。借助PlantCARE数据库(
http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ )分析启动子顺式作用元件。根据OfLCYB的启动子序列信息[8]设计引物，以‘堰虹桂’嫩叶DNA为模板扩增得到其启动子。以‘堰虹桂’不同时期的花瓣cDNA为模板，以OfLCYB基因序列设计表达引物，以桂花OfACT基因[18]为内参基因，按照TB Green® Premix Ex TM TapⅡ说明进行实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析。引物序列见表1。利用参照基因的2−ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。表 1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences引物名称 引物序列(5′→3′) LCYB-PRO-GW-F ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcCTGCTTCTTGTTGTTGTACG LCYB-PRO-GW-R ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcCAATTTTGGCATGTTCTTAG OfLCYB-qF GAAAGGAGACGCCAAAGGGAG OfLCYB-qR GGAAGAAATAGCCGAGATGATAAGA 说明：小写字母表示部分attB序列。 1.2.2 B2亚组OfERFs生物信息学分析
使用天根公司RNA perp Pure Plant Kit试剂盒，根据产品说明提取‘堰虹桂’不同时期的花瓣RNA。随后用紫外分光光度计和质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA浓度和质量。按照PrimeScriptTM RT Master Mix说明书将检验合格的盛花期RNA进行反转录。
应用Prot-Param在线软件 (
http://web.expasy.org/protparam/ ) 预测所编码蛋白的分子量、理论等电点、不稳定系数等；采用MEGAX软件中的邻位相邻法(NJ)进行同源聚类，建立系统发育树，并采用Bootstrap法(重复1 000次) 评估检测系统进化树。运用DNAMAN 7.0对4个OfERF基因推测所得的序列进行多序列比对分析。1.2.3 B2亚组OfERFs表达分析
以‘堰虹桂’不同时期的花瓣cDNA为模板，以筛选得到的桂花B2亚组OfERFs序列设计引物，以桂花OfACT为内参基因。分析方法参照1.2.1。引物序列见表2。
表 2 OfERFs基因RT-qPCR引物序列Table 2 RT-qPCR primer sequences of OfERFs引物名称 引物序列(5′→3′) 引物名称 引物序列(5′→3′) OfERF73a-qF CTGAAGAGAAACCGCCAACAA OfERF72a-qR GGGTAGTAAACTTCTTGTTGCTGCGTA OfERF73a-qR TTAACGCCATCAGAAGACACAAGT OfERF72b-qF CAAATATCCTATGTTCAGAGG OfERF73b-qF AATTGGGATGCCGCCTCA OfERF72b-qR ATAGCATACCATAACATACCA OfERF73b-qR TTAAATCCCACCAAACATAGCACT OfACT-qF CCCAAGGCAAACAGAGAAAAAAT OfERF72a-qF CCAACCCCACCGGCTC OfACT-qR ACCCCATCACCAGAATCAAGAA 1.2.4 OfERFs与OfLCYB启动子酵母互作验证
通过Gateway方法构建pAbAi-OfLCYB-pro载体，之后利用限制性内切酶BstB I线性化质粒pAbAi-OfLCYB-pro、阳性对照p53-AbAi以及阴性对照pAbAi载体。按照Yeastmaker™ Yeast Transformation System 2 User Manual产品说明制备酵母感受态，并将线性化的质粒转入感受态细胞中，涂布于尿嘧啶缺陷培养基(SD/-Ura)酵母板筛选培养基上，28 ℃倒置培养2~3 d。挑取单菌落扩大培养，提取酵母DNA。以粗提酵母DNA为模板，进行PCR检验。用质量分数为0.9% 的无菌氯化钠溶液稀释菌液，D(600)=0.002时，均匀涂布于金担子素A (AbA)不同浓度的SD/-Ura固体培养基上，倒置于28 ℃培养箱内培养2~3 d，以检测AbAr基因本底表达水平。将pGADT7-OfERF72a、pGADT7-OfERF72b、pGADT7-OfERF73a、pGADT7-OfERF73b和pGADT7-53、pGADT7分别转入诱饵菌株pAbAi-OfLCYB-pro和阳性对照p53-AbAi、阴性对照pAbAi的酵母感受态细胞，悬浮液均匀涂布于SD/-Leu缺陷培养基上，倒置于30 ℃培养箱内培养3~5 d，再将长出的单菌落分别在亮氨酸缺陷培养基(SD/-Leu)与含300 μg·L−1的亮氨酸缺陷培养基[SD/-Leu/AbA(300 μg·L−1)]点斑检测其互作情况。
2. 结果与分析
2.1 OfLCYB启动子序列分析及表达分析
由图1可见：桂花OfLCYB基因启动子序列含有2个ATCTA顺式作用元件。
图 1 OfLCYB启动子的ATCTA顺式作用元件分析Figure 1 Analysis of ATCTA cis-acting elements of the OfLCYB promoter通过荧光定量检测‘堰虹桂’不同发育时期花瓣中OfLCYB的表达水平(图2)，发现OfLCYB的表达量从顶壳期到盛开期逐渐升高，在盛开期表达量最高。
图 2 OfLCYB在‘堰虹桂’不同花期的表达Figure 2 Expression of OfLCYB at different flowering stages in O. fragrans ‘Yanhong Gui’2.2 B2亚组OfERFs生物信息学分析
通过对桂花转录组数据库分析，筛选获得4个B2亚组ERF有关的Unigene序列。利用MEGAX软件对4个桂花OfERFs氨基酸全长和拟南芥ERF家族的122个成员的氨基酸序列构建系统进化树，结果显示：4个桂花OfERFs与5个拟南芥ERF序列聚集在B2亚组(图3)。其中CL2088.Contig2和CL2088.Contig3聚为一小支，与拟南芥At3g16770.1 (AtERF72)的关系最为接近，将CL2088.Contig2和CL2088.Contig3分别命名为OfERF72a和OfERF72b。此外，CL550.Contig3、Unigene4342与拟南芥At1g72360.2 (AtERF73)关系较近，将CL550.Contig3和Unigene4342分别命名为OfERF73a和OfERF73b。
图 3 桂花B2亚组OfERFs系统发育分析Figure 3 Phylogenetic analysis of OfERFs in subgroup B2 of O. fragrans多序列比对分析发现(图4) ：4个OfERF基因均包含1个AP2保守结构域。4个OfERFs蛋白序列的基本理化性质(表3)分析发现：OfERF72a基因的氨基酸数量为232个，分子量为26 144 Da；OfERF72b基因的氨基酸数量为228个，分子量为25 841 Da；OfERF73a基因的氨基酸数量为386个，分子量为43 632 Da；OfERF73b基因的氨基酸数量为375个，分子量为41 607 Da。4个OfERF的理论等电点为4.63~5.33，均属于偏酸性蛋白质；总平均亲水指数均为负值，都属于亲水性蛋白。OfERF72a、OfERF72b、OfERF73a不稳定系数分别为43.67、54.42、43.21，判断为不稳定的蛋白质；OfERF73b不稳定系数为38.40，判断为稳定的蛋白质。
图 4 B2亚组OfERFs氨基酸序列比对分析Figure 4 Amino acid multiple sequence alignment analysis of OfERFs of subgroup B2表 3 B2亚组OfERFs基本理化性质分析Table 3 Analysis of basic physicochemical properties OfERFs of subgroup B2基因名称 氨基酸数量/个 分子量/Da 理论等电点 不稳定系数 总平均亲水指数 OfERF72a 232 26 144 5.33 43.67 −0.744 OfERF72b 228 25 841 5.30 54.42 −0.796 OfERF73a 386 43 632 4.63 43.21 −0.739 OfERF73b 375 41 607 5.01 38.40 −0.710 2.3 B2亚组OfERFs表达分析
利用RT-qPCR技术分析‘堰虹桂’不同发育时期花瓣中OfERF72a、OfERF72b、OfERF73a与OfERF73b相对表达量(图5)发现：从顶壳期到盛开期，OfERF72a、OfERF72b的相对表达量基本呈现逐渐下降的趋势，OfERF73a的相对表达量在顶壳期、铃梗期与盛花期之间差异较小，在初花期相对表达量略有下降。OfERF73b的相对表达量在顶壳期、铃梗期较高，随后在初花期相对表达量显著下降(P＜0.05)。
图 5 B2亚组OfERF在‘堰虹桂’不同花期的表达Figure 5 Expression of OfERF genes of subgroup B2 at different flowering stages in O. fragrans ‘Yanhong Gui’为了验证OfERFs与OfLCYB之间的关系，用y表示OfERFs的相对表达量取以10为底的对数，用x表示OfLCYB相对表达量取以10为底的对数进行相关性分析(图6)。其中，OfERF72a直线回归方程为y= − 0.987 6x − 0.010 0，决定系数(R2)为0.933 6，P=0.033 8；OfERF72b直线回归方程为y= − 1.208 0x − 0.077 9，R2=0.941 6，P=0.029 6。OfLCYB的表达水平与OfERF72a、OfERF72b呈显著负相关。
图 6 OfERFs与OfLCYB相对表达量的相关性分析Figure 6 Correlation analysis of relative expression levels of OfERFs with OfLCYB2.4 酵母单杂交分析B2亚组OfERFs与OfLCYB启动子互作
为了探究B2亚组OfERFs与OfLCYB启动子之间是否存在物理互作，同时将阴性对照pAbAi+pGADT7、阳性对照p53-AbAi+pGADT7-Rec-p53以及实验组pAbAi-OfLCYB-Pro+AD-OfERF分别接种于SD/-Leu与SD/-Leu/AbA (300 μg·L−1)的酵母培养基上，于30 ℃倒置培养3~5 d。结果发现(图7)：在SD/-Leu培养基上，酵母均能正常生长，而在SD/-Leu/AbA (300 μg·L−1)培养基上，只有阳性对照与pAbAi-OfLCYB-Pro+AD-OfERF72b正常生长，其余酵母菌均不能生长，表明OfERF72b可以与OfLCYB启动子物理结合。
图 7 OfERF蛋白与OfLCYB启动子互作验证Figure 7 Verification of physical interaction between OfERF proteins and OfLCYB promoter3. 讨论
本研究得到4个桂花‘堰虹桂’B2亚组的OfERFs基因，编码区长度为687~1 161 bp，编码228~386个氨基酸残基。拟南芥B2亚组ERF At1g53910.1、At1g72360.2、At2g47520.1、At3g14230.1以及At3g16770.1分别编码358、262、171、397和248个氨基酸残基[15]。牡丹Paeonia suffruticosa ERF家族中B2亚组基因PsERF1编码区长度为1 158 bp，编码385个氨基酸残基[19]。在番木瓜Carica papaya中，属于B2亚组的基因CpERF4、CpERF6、CpERF9则分别编码431、253、234个氨基酸残基[20]。而在番茄ERF中，其B2亚组的SlERF6、SlERF.E.1、SlERF90、SlERF91、SlERF.A.3分别编码255、260、386、1 454和372个氨基酸残基[21]。由此可以发现：同一物种B2亚组ERF基因编码不同长度的氨基酸序列，推测其不同成员的功能存在差异。
对4个桂花OfERFs基因的氨基酸序列进行系统进化分析，发现OfERFs与拟南芥B2亚组ERF聚集在一起，说明它们的同源性较高。其中2个基因与At3g16770.1 (AtERF72/AtRAP2.3)聚为一支，2个基因与At1g72360.2 (AtERF73/AtRAP2.2)聚为另一小支。据此将4个OfERFs基因分别命名OfERF72a与OfERF72b、OfERF73a与OfERF73b。桂花OfERF72与OfERF73均存在2个拷贝，说明桂花OfERF基因家族成员在进化和扩张过程中与基因重复事件有着紧密联系。在拟南芥中，AtERF72能够与缺铁反应基因IRT1、HA2和CLH1的启动子区域结合，负调控拟南芥的缺铁响应。与野生型植株相比，AtERF72突变体中铁和镁质量分数显著增加[22]。AtRAP2.3的同源基因SlERF6被证实是番茄中类胡萝卜素合成的负调控因子[13]。此外，在苹果中也有研究证明：AtRAP2.3的同源基因AP2D15可以负调控苹果PSY1和PSY2基因启动子序列中的ATCTA顺式作用元件[14]。拟南芥AtRAP2.2可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上调控基因的表达，过表达AtRAP2.2后导致植物体内类胡萝卜素降低[15]。
桂花花瓣中主要类胡萝卜素为β-胡萝卜素，其生物合成由OfLCYB直接催化生成，是桂花花瓣中类胡萝卜素代谢的重要催化酶[23]。OfLCYB基因启动子中存在2个ATCTA顺式作用元件，推测其响应B2亚组ERF转录因子的调控。AtRAP2.2蛋白可以结合到拟南芥AtPSY启动子和AtPDS启动子的ATCTA元件上，从而调控相关基因的表达[15]。在苹果MdPSY1和MdPSY2基因启动子中也存在多个ATCTA顺式作用元件，能被AtRAP2.3的同源基因蛋白AP2D15强烈激活表达[14]。进一步研究发现：OfERF72a和OfERF72b的表达趋势与OfLCYB基因呈显著负相关。酵母单杂交结果表明：OfERF72b与OfLCYB启动子存在物理结合，表明B2亚组的OfERF72b可能通过结合OfLCYB基因启动子ATCTA顺式作用元件调控其表达。ATCTA元件也存在于桂花OfPSY[24]和OfCCD1[25]等其他类胡萝卜素代谢基因的启动子上，其是否响应B2亚组的ERF转录因子的调控需要进一步研究。
4. 结论
本研究基于桂花‘堰虹桂’转录组数据筛选了4个OfERF基因，OfERF72a与OfERF72b基因表达量均随着开花进程逐渐下降，与OfLCYB基因的表达量显著负相关。OfLCYB基因启动子含有2个ATCTA顺式作用元件，OfERF72b与OfLCYB启动子之间存在互作，表明OfERF72b可能参与调控OfLCYB的表达。
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图 1 荆芥HD-Zip基因家族的染色体定位
Figure 1 Chromosome mapping of HD-Zip gene family in S. tenuifolia
图 2 荆芥与拟南芥及其他物种HD-Zip基因家族的最大似然值进化树
Figure 2 ML evolutionary tree of HD-Zip gene family between S. tenuifolia and A. thaliana and other species
图 3 荆芥HD-Zip基因家族的基因结构分析
Figure 3 Gene structure analysis of HD-Zip gene family in S. tenuifolia
图 4 荆芥HD-Zip基因家族的保守基序分析
Figure 4 Conservative motif analysis of HD-Zip gene family in S. tenuifolia
图 5 荆芥HD-Zip基因家族的顺式作用元件分布
Figure 5 Distribution of cis-acting elements of HD-Zip gene family in S. tenuifolia
图 6 荆芥HD-Zip基因家族的组内串联重复分析
Figure 6 Tandem repeat analysis of HD-Zip gene family in genome of S. tenuifolia
图 7 荆芥HD-Zip基因家族的组内共线性分析
Figure 7 Intra-group collinearity analysis of HD-Zip gene family in S. tenuifolia
图 8 荆芥HD-Zip与拟南芥基因组之间的共线性分析
Figure 8 Collinear analysis of HD-Zip gene between S. tenuifolia and A. thaliana genomes
表 1 荆芥HD-Zip基因家族的蛋白特征
Table 1. Protein characteristics of HD-Zip gene family in S. tenuifolia
亚家族 基因ID CDS长
度/bp蛋白长
度/个分子量/
kDa等电点 染色体 亚家族 基因ID CDS长
度/bp蛋白长
度/个分子量/
kDa等电点 染色体 HD-Zip Ⅰ Sch000003181 900 299 33.847 4.88 Chr 01 Sch000003831 528 175 20.331 8.58 Chr 01 Sch000016777 897 298 34.379 6.55 Chr 04 Sch000019486 822 273 31.100 4.59 Chr 04 HD-Zip Ⅲ Sch000001735 2562 853 93.306 5.74 Chr 01 Sch000026498 927 308 35.350 5.01 Chr 06 Sch000019857 2511 836 91.461 5.94 Chr 04 Sch000008725 822 273 31.034 4.83 Chr 02 Sch000014693 2493 830 91.021 5.84 Chr 03 Sch000005997 912 303 34.369 4.97 Chr 02 Sch000026324 2586 861 94.183 6.14 Chr 06 Sch000020328 966 321 35.730 4.81 Chr 04 Sch000028231 2529 842 92.434 6.17 Chr 06 Sch000016424 867 288 32.633 6.32 Chr 04 Sch000017902 879 292 33.207 6.07 Chr 04 HD-Zip Ⅳ Sch000026062 2166 721 79.071 5.98 Chr 06 Sch000002474 876 291 32.531 5.7 Chr 01 Sch000008059 2163 720 79.056 6.23 Chr 02 Sch000008983 696 231 26.832 6.32 Chr 02 Sch000029960 2181 726 79.526 5.64 HiC_scaffold_8 Sch000006831 693 230 26.615 6.96 Chr 02 Sch000011892 2418 805 87.913 5.79 Chr 03 Sch000019278 600 199 22.673 8.44 Chr 04 Sch000009216 2196 731 79.888 5.79 Chr 02 Sch000021651 546 181 21.788 5.84 Chr 05 Sch000019506 2400 799 87.073 6.04 Chr 04 Sch000013738 654 217 24.934 7.59 Chr 03 Sch000012322 2490 829 91.502 5.41 Chr 03 Sch000016710 621 206 24.472 5.44 Chr 04 Sch000012213 2490 829 91.502 5.41 Chr 03 Sch000004651 2490 829 91.502 5.41 HiC_scaffold_100 HD-Zip Ⅱ Sch000028530 891 296 327.360 7.52 Chr 06 Sch000018911 2070 689 77.061 6.28 Chr 04 Sch000010966 879 292 32.623 7.62 Chr 03 Sch000005323 1944 647 73.264 7.27 Chr 02 Sch000019272 795 264 294.950 8.59 Chr 04 Sch000022402 2307 768 84.180 5.81 Chr 05 Sch000008316 783 260 29.093 8.12 Chr 02 Sch000024046 2274 757 84.279 6.15 Chr 06 Sch000025447 879 292 32.351 9.05 Chr 06 Sch000008675 1884 627 69.905 6.18 Chr 02 Sch000011951 645 214 24.334 8.24 Chr 03 说明：CDS指蛋白编码区 
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