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掌叶覆盆子Rubus chingii，又称华东覆盆子、葛公等，为蔷薇科Rosaceae悬钩子属Rubus植物，药食同源，广泛分布于浙江、安徽、江西等省份的山地丘陵中，为中国特有的红树莓[1−2]。未成熟果实入药，具有益肾、固精和缩尿等功效，药用历史悠久[3−4]。成分分析和药理研究表明：掌叶覆盆子富含多糖、酚酸和萜类等物质，具消炎、抗氧化、抗癌、抗糖尿病、降血脂等多重作用[5−8]。成熟果实酸甜可口，营养丰富，富含酚酸、氨基酸、维生素PP、锰、锌等，深受消费者喜爱[1, 9]。但是，覆盆子果实小、鲜果极不耐储藏和运输，限制了其产业的发展。阐明影响覆盆子果实膨大和成熟软化的关键基因，对于推动药果和鲜果产业发展具有重要的意义。
植物细胞壁由纤维素、半纤维素和果胶等多糖组成。多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)是果胶水解酶的重要成员之一，含多个基因家族成员，与果胶甲酯酶(pectin methylesterase，PME)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, β-GAL)和鼠李糖半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase，RGase)等共同参与植物细胞壁果胶的水解，介导植物的种子萌发、侧根发育、器官脱落、逆境响应等发育和生理过程，在果实成熟与软化过程中发挥关键作用，已在拟南芥Arabidopsis thaliana、番茄Solanum lycopersicum、南瓜Cucumis sativus、西瓜Citrullus lanatus、玉米Zea mays和甘薯Ipomoea batatas等植物中被广泛关注[10−14]。
PG属于糖基水解酶28号家族(GH28)，该蛋白含有至少1个结构域GH28 (Pfam00295)。研究发现：PG基因家族成员均有其特定的氨基酸结构，包括4个典型的保守功能结构域：Ⅰ(SPNTDG)、Ⅱ(GDDC)、Ⅲ (CGPGHGISIGSLG)和Ⅳ (RIK)，其中，结构域Ⅲ的保守性较差，且在鼠李糖多聚半乳糖醛酸酶中缺失[15]。这4个保守结构域都具有特定的功能。结构域Ⅰ和Ⅱ中，NTD和DD中的天冬氨酸(D)残基是催化位点的组成部分，结构域Ⅲ中，组氨酸(H)残基起催化作用，而结构域Ⅳ可能与果胶底物的羧酸基团相互作用[16]。有学者在氨基酸水平上对PG基因家族进行分类，提出了2种分类系统。第一种由KIM等[17]提出，对来自拟南芥和水稻Oryza sativa的125个PGs进行系统发育分析，结果可分为3类(Class A~C)，每个类别可再细分出不同亚类； MAHMOOD等[18]根据此方法对来自54种植物的
2786 个PGs做出分类。另一种由PARK等[15]提出，对来自水稻和一种丝状真菌Aspergillus oryzae的225个PGs进行系统发育和基因结构分析，结果分为6个分支(Clade A~F)，同一分支的差异较小，内含子数量接近。之后，LIANG等[16]将拟南芥的QRT3及其在双子叶植物和单子叶中的14个同源蛋白归类为新分支(Clade G)，从而将557个PGs分为7个分支，即Clade A~G。尽管PG基因在许多植物种中已被鉴定出来，但是在掌叶覆盆子中的成员与功能仍不清楚。本研究基于掌叶覆盆子基因组，对其PG基因家族进行了全基因组鉴定和分析，并结合转录组数据与实时荧光定量PCR (RT-qPCR)，分析了果实不同发育阶段家族成员的表达模式，进而筛选出调控果实成熟软化的关键PG基因，以期为掌叶覆盆子PG基因功能的解析及分子育种和果实保鲜提供科学依据。
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掌叶覆盆子L7株系的果实，按其果实发育过程分为8个阶段(图1)：小绿(SG，花后7 d)，中绿(MG，花后14 d)，大绿Ⅰ(BG Ⅰ，花后21 d)，大绿Ⅱ(BG Ⅱ，花后28 d)，大绿Ⅲ(BG Ⅲ，花后35 d)，青转黄(GY，花后42 d)，黄转橙(YO，花后48 d)和红色(RE，花后54 d)[6]。分别采集各阶段果实液氮速冻后超低温保存。
图 1 掌叶覆盆子不同发育阶段的果实
Figure 1. Fruits of R. chingii at different developmental stages
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从蔷薇科植物数据库GDR网站(
https://www.rosaceae.org )、TAIR数据库(http://www.arabidopsis.org/ )和美国国家生物技术信息中心(NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov )中下载掌叶覆盆子、拟南芥和番茄的全基因组序列与蛋白质序列[12, 19]。以糖基水解酶28号家族(PF00295)结构域的隐马尔可夫模型(HMM)作为规范结构域，使用HMMER 3.3.1 (http://hmmer.org/ download.html )进行HMM搜索序列同源物(E≤10−5)，并利用Conserved Domain Database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi )和每千个碱基/百万个定位片段(PFAM) (https://pfam-legacy.xfam.org/search/sequence )确认，以确保含有PG保守结构域。 -
将掌叶覆盆子、拟南芥和番茄PG家族成员氨基酸序列进行多序列比对，用MEGA 11软件构建进化树，采用邻近法(NJ)，检验参数bootstrap设置为1 000。根据拟南芥分组的命名，结合染色体位置，对掌叶覆盆子PG基因进行重命名和分组。最后，通过Chiplot在线工具(https://www.chiplot.on line/)对构建的系统发育树进行注释和修饰。
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根据掌叶覆盆子基因组注释数据，使用TBtools软件的基因定位可视化，绘制RchPGs基因在染色体上的位置，并绘制外显子-内含子的基因结构。使用MEME在线网站(
http://memesuite.org/tools/meme )识别之前鉴定的RchPGs基因的保守基序，并在程序中将最大碱基数设置为10，预测结果通过TBtools展示[20]。掌叶覆盆子基因组内及其基因组与番茄基因组的共线性分析采用MCScanX，并用TBtools的advanced circos和dual synteny plot可视化。 -
选择典型的4个阶段果实(BG Ⅰ、GY、YO和RE)，每组3个生物学重复，送至华大基因有限公司测序[6]。分析掌叶覆盆子PGs基因在果实发育阶段的表达模式。
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使用全能型植物RNA提取试剂盒(CW25983)提取各阶段果实的总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测3条条带，测定浓度，使用逆转录试剂盒(RR036A)逆转录成cDNA。RT-qPCR使用实时荧光定量PCR仪(CFX 96)。生物学重复4次。数据采用单因素方差分析法(LSD)。
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通过HMM分析掌叶覆盆子的基因组数据，共鉴定出47个PGs基因(表1)。根据染色体位置分布，将47个RchPGs基因命名为RchPG1~RchPG47。氨基酸序列分析表明：RchPGs蛋白分子量为15.81~131.12 kDa，平均分子量为39.51 kDa。RchPGs蛋白等电点为5.00~9.49，说明RchPGs蛋白的酸碱性差异较大，其中47％为酸性，53％为碱性。亲疏水指数(GRAVY)为−0.585~0.056，其中91％的成员为亲水蛋白(GRAVY＜0)。约34%的RchPGs不稳定，其余成员较稳定。亚细胞预测表明：RchPGs蛋白均位于细胞壁上。对掌叶覆盆子PG基因编码的氨基酸进行多序列对比，47个RchPGs中，有28个都具有4个典型的保守结构域Ⅰ~Ⅳ；11个RchPGs不包含结构域Ⅲ，除RchPG41外，均属于Clade E (图2)。此外，还有一部分RchPGs蛋白保守基序中个别氨基酸发生变异，如SPNTDG中的“S”变成“A”，CGPGHG中的第2个“G”变成“D”等。
表 1 掌叶覆盆子RchPGs家族成员特征
Table 1. Characteristics of RchPGs family members in R. chingii
基因编码 基因名称 等电点 分子量/kDa 亲疏水
指数不稳定
系数分支 基因编码 基因名称 等电点 分子量/kDa 亲疏水
指数不稳定
系数分支 LG01.1059 RchPG1 5.96 51.08 −0.073 44.79 E LG04.283 RchPG25 8.63 57.49 −0.356 45.27 A LG01.1356 RchPG2 6.83 51.99 −0.127 44.12 E LG04.396 RchPG26 5.26 49.55 −0.183 33.24 B LG01.1565 RchPG3 8.11 42.23 0.056 29.10 C LG04.993 RchPG27 9.02 52.04 −0.278 44.66 A LG01.1665 RchPG4 6.43 39.40 −0.063 24.24 C LG05.1140 RchPG28 8.48 44.96 −0.174 42.43 E LG01.2532 RchPG5 6.08 47.67 −0.267 38.63 D LG05.1261 RchPG29 5.19 52.20 −0.018 38.83 E LG01.2853 RchPG6 9.09 55.47 −0.193 43.86 E LG06.1099 RchPG30 8.90 50.20 −0.242 28.08 D LG01.3312 RchPG7 8.23 58.83 −0.239 46.37 F LG06.1103 RchPG31 6.96 43.60 −0.148 23.68 D LG01.3577 RchPG8 8.52 15.81 0.008 38.87 C LG06.1105 RchPG32 8.98 42.48 −0.210 27.47 D LG01.3578 RchPG9 9.49 41.00 0.035 39.66 C LG06.1675 RchPG33 7.81 43.81 −0.197 35.69 F LG01.3579 RchPG10 9.48 107.01 −0.032 41.27 C LG06.2235 RchPG34 8.81 49.23 −0.059 43.94 B LG02.1098 RchPG11 8.01 40.06 −0.059 30.89 F LG06.272 RchPG35 7.48 53.19 −0.275 36.87 A LG02.1344 RchPG12 5.39 49.49 −0.063 43.95 E LG06.3272 RchPG36 5.50 51.64 −0.186 36.12 B LG02.1359 RchPG13 5.76 50.91 −0.192 39.89 D LG06.3274 RchPG37 5.00 45.35 −0.167 34.66 F LG02.1479 RchPG14 6.24 131.12 −0.585 51.01 D LG06.3368 RchPG38 5.65 52.96 −0.054 44.42 E LG02.1829 RchPG15 9.35 49.19 −0.451 34.18 B LG06.4848 RchPG39 7.16 48.48 −0.108 48.34 A LG02.1835 RchPG16 8.94 49.80 −0.288 30.39 B LG07.1450 RchPG40 8.95 48.86 −0.283 34.24 B LG02.2252 RchPG17 7.48 49.52 −0.254 38.72 D LG07.1820 RchPG41 7.94 40.24 −0.292 32.80 B LG02.4536 RchPG18 6.38 44.22 −0.015 31.62 D LG07.1821 RchPG42 6.30 48.45 −0.227 25.48 B LG03.1665 RchPG19 8.94 44.71 −0.181 27.06 D LG07.1856 RchPG43 6.44 48.39 −0.256 29.74 B LG03.5002 RchPG20 5.95 52.65 −0.228 40.49 D LG07.1859 RchPG44 7.80 48.12 −0.263 23.46 B LG04.1300 RchPG21 6.39 40.22 −0.357 27.43 F LG07.2143 RchPG45 5.19 45.73 −0.275 37.35 F LG04.1461 RchPG22 6.14 74.72 −0.390 57.75 A LG07.325 RchPG46 7.54 51.44 −0.076 37.22 E LG04.1621 RchPG23 6.14 46.91 0.094 48.01 E LG07.3923 RchPG47 6.09 49.37 −0.170 34.22 E LG04.1640 RchPG24 8.74 46.54 −0.105 33.44 D 
图 2 RchPGs蛋白的保守结构域
Figure 2. Conserved domains of RchPGs proteins
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将47个RchPGs蛋白和68个拟南芥AtPGs以及54个番茄SlPGs蛋白序列，使用邻接法构建系统进化树(图3)。这169个PGs蛋白被分为7个亚家族，分别是Clade A~G。其中Clade D包含11个RchPGs家族成员，Clade B和Clade E均包含10个RchPGs家族成员，Clade F包含6个RchPGs，Clade A和Clade C均包含5个RchPGs家族成员。在拟南芥和番茄中还有Clade G分支，分别包含At4G20050和SlPG71 (Solyc02g068400.2)。RchPG16属于Clade B分支，与RchPG36、RchPG43、RchPG42、RchPG41和RchPG44亲缘关系最近。
图 3 掌叶覆盆子与拟南芥、番茄PG家族成员的系统发育树
Figure 3. Phylogenetic tree of PG family members from R. chingii, A. thaliana, and S. lycopersicum
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RchPGs基因结构显示：外显子为2~13个，内含子为1~12个(图4)。Clade E分支的RchPGs除了RchPG38含3个外显子外，其余均含有5~6个外显子；Clade B分支中大部分RchPGs含有7~9个外显子；Clade D分支大部分RchPGs含有4~7个外显子。不同分支的外显子和内含子结构不同，但同一分支外显子和内含子的位置和长度相对保守。使用MEME网站鉴定和分析47个RchPGs蛋白的保守基序，命名为Motif 1~10 (图5~6)。47条RchPGs蛋白均存在Motif 6、Motif 4和Motif 2；其中仅RchPG8、RchPG38、RchPG41、RchPG23和RchPG12不含Motif 1。Clade E成员均不含有Motif 9，且Motif 8只存在于Clade E中。Clade A中的RchPG39和RchPG22、Clade C中除RchPG8的其他成员和Clade D中的所有成员都含有除了Motif 8以外的9个基序。但是RchPG8仅含有Motif 6、Motif 4和Motif 2。此外，这些保守基序在PG蛋白序列中的组成和位置顺序在进化分支中大体相似，这表明了用于亚科分类的系统发育分析的可靠性。
图 4 掌叶覆盆子RchPGs基因家族结构分析以及系统发育树
Figure 4. Gene structures analyses of RchPGs families and phylogenetic tree of RchPGs in R. chingii
图 5 掌叶覆盆子RchPGs 蛋白家族保守基序预测
Figure 5. Motif prediction of RchPGs family members in R. chingii
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RchPGs基因在掌叶覆盆子的LG01~LG07染色体上均存在，并且分布不均匀(图7A)。LG01和LG06上RchPGs基因分布最多，均有10条；其次是LG02和LG07，分布有8条RchPGs基因；接着是LG04，含有7条RchPGs基因。LG03和LG05上分布最少，分别仅有2条RchPGs基因。在这些PGs基因中，发生了4次串联复制事件，分别是RchPG8~RchPG10、RchPG15和RchPG16、RchPG30~RchPG32以及RchPG36和RchPG37。共线性分析表明：掌叶覆盆子中存在5个PG编码基因对，包括RchPG12和RchPG23、RchPG13和RchPG24、RchPG29和RchPG47、RchPG36和RchPG40以及RchPG41和RchPG43 (图7B)。此外，番茄和掌叶覆盆子PGs基因间共有25个共线对：RchPG11分别和SlPG64、SlPG68、SlPG70存在共线性，RchPG12和RchPG23均和SlPG48-2存在共线性，RchPG28和SlPG49存在共线性，RchPG29分别和SlPG55-2、SlPG56-1、SlPG56-3存在共线性，RchPG36分别和SlPG16、SlPG15、SlPG14存在共线性等(图7C)。
图 6 掌叶覆盆子RchPGs 蛋白家族保守基序序列分析
Figure 6. Motif sequence analysis of RchPGs family members in R. chingii
图 7 RchPGs基因染色体定位和共线性分析
Figure 7. Chromosomal location and synteny analyses of RchPGs in R. chingii
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图8A结果表明：46条RchPGs基因家族成员均可在果实中检测到，其中RchPG1、RchPG2、RchPG6、RchPG10、RchPG16、RchPG17、RchPG22、RchPG23、RchPG25、RchPG28、RchPG38和RchPG47等在果实发育过程中表达量较高；而RchPG3~RchPG5、RchPG7~RchPG9、RchPG13~RchPG15、RchPG18~RchPG21、RchPG24和RchPG27等在果实中表达量很低，推测它们可能在根、茎、叶等其他器官发育过程中起作用。其中，RchPG6、RchPG1、RchPG12、RchPG23和RchPG29在果实发育早期起作用，介导果实膨大过程中的细胞壁水解，它们均属于Clade E分支。RchPG47 (Clade E)和RchPG25 (Clade A)在果实早期表达也较高，且RchPG25在GY阶段表达明显升高，而RchPG47在GY阶段表达量未明显升高，YO阶段表达量略微升高，此后又急剧下降。RchPG2、RchPG28、RchPG38、RchPG10和RchPG16等基因在果实发育后期表达量升高，介导果实成熟与软化。其中RchPG16基因表达量差异最大，BG Ⅰ阶段的表达量水平为1.78 (FPKM)，GY阶段升高至236.54，YO阶段下降，最后在RE阶段急剧升高至
3859.35 ，是未成熟BG Ⅰ时期的2168.17 倍。
图 8 掌叶覆盆子RchPGs基因表达量转录组分析与RT-qPCR鉴定
Figure 8. Transcriptome analysis and RT-qPCR identification of RchPGs genes expression in R.chingii
选取8个发育阶段的果实，提取总RNA，逆转成cDNA后，RT-qPCR检测RchPG1、RchPG6、RchPG12、RchPG23、RchPG25、RchPG47、RchPG2、RchPG10、RchPG38和RchPG16等基因的相对表达量(以GY时期RchPG1的表达量为参照值1)，结果表明各基因的表达量与转录组测序结果基本一致。RchPG16基因有两次表达量急剧增加，第1次是从BG Ⅲ到GY时期表达量增加了约285.71倍，第2次是从YO进入RE时期表达量增加了83.26倍，RE时期的表达量是BG Ⅰ时期的283.08倍(图8B)。
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PG属于糖基水解酶28号家族(GH28)，在1988年首次被发现。已在不少高等植物中鉴定了PG基因，其中在拟南芥、水稻、杨树Populus、黄瓜、西瓜、甘薯中分别鉴定到68、46、75、53、62和103个PGs基因[14]。本研究在覆盆子中鉴定到47个RchPGs基因，不均匀分布在7条染色体上，系统发育可分为6个分支(Clade A~F)。PG基因家族从最初分为3个进化枝(Clade A~C)，扩展到6个(Clade A~F)和7个进化枝(Clade A~G)[15−17, 21]。研究表明同一分支具有相似的生物学功能，可以为基因功能分析提供参考[14]。
染色体定位结果表明：RchPGs基因随机不均匀分布在掌叶覆盆子的7条染色体上，且发生了4次串联复制事件。番茄中28个PGs基因也不均匀分布在12条染色体上，且有5个串联重复基因簇[12]。其中，在掌叶覆盆子染色体上存在2个三基因串联重复区域(RchPG8、RchPG9、RchPG10和RchPG30、RchPG31、RchPG32基因簇)，分别位于系统发育树的Clade C和Clade D分支上。WANG等[22]在无花果Ficus carica中也发现了2个五基因的串联重复区域，也分别位于Clade C和Clade D分支上。这表明不同物种的PG基因分布模式相似，且存在基因扩张现象。
转录组分析结果表明：Clade E分支中，除RchPG46以外的PG基因在果实发育过程中表达量较高，但表达模式有差异。其中，RchPG6、RchPG29、RchPG1、RchPG12和RchPG23在果实发育早期起作用，参与果实膨大过程中的细胞壁水解；相反地，RchPG2、RchPG28、RchPG38在果实发育后期起作用，介导果实成熟与软化。且共线基因对RchPG29和RchPG47、RchPG12和RchPG23的表达模式相近。这些蛋白中均缺少完整的结构域Ⅲ，属于鼠李型PGs。拟南芥、番茄和甘薯的Clade E分支PGs蛋白成员也缺少结构域Ⅲ[12, 14, 17]。结构域Ⅰ和Ⅱ可能构成催化位点，结构域 Ⅲ可能参与催化反应，结构域Ⅳ可能与底物中羧酸分子的离子基团相互作用[14]。可见，在介导果实发育时PG的结构域Ⅲ可能是非必需的。另一方面，Clade C分支中的RchPG10和Clade B分支中的RchPG16在果实发育后期表达量剧增，为介导果实成熟软化的关键PG基因。它们均具有完整的4个典型结构域。KE等[12]研究发现：SlPG14、SlPG15和SlPG49基因在番茄果实发育后期有较高表达水平，并通过影响细胞壁裂解过程来调控番茄果实成熟软化[12]。共线性分析结果表明：SlPG49和RchPG28具有共线性。系统发育分析结果表明：RchPG16和SlPG14及SlPG15亲缘关系最近，这些结果进一步证实了RchPG28和RchPG16在掌叶覆盆子果实成熟软化过程中的主导作用。据推测，Clade A和Clade B的成员包含内切型PGs，Clade C和Clade D成员包含外切型PGs，Clade E成员包含鼠李型PGs，Clade F成员既不是外切型PGs也不是内切型PGs。由于不同类型的PG酶具有不同的底物和产物，每个分支所催化的果胶组分的差异可能是进化差异导致的[14]。掌叶覆盆子PG家族成员在发育过程中各司其职，协同促进果实的膨大与成熟软化。
掌叶覆盆子的育种目标之一是增大药果果型。果实的膨大受到细胞壁的限制。果实成熟过程中大小和硬度的变化包括纤维素、半纤维素和果胶等物质的溶解和解聚，以及它们之间的重塑。PG可降解果胶，催化果胶分子中α-1,4-聚半乳糖醛酸的裂解，使其降解为寡聚半乳糖醛酸和半乳糖醛酸，进一步被果胶裂解酶(PL)催化裂解[23]。而对于鲜果市场，口感佳是更重要的育种目标，若果实大硬度高，影响口感，因此需选育出花托软的品种。PG家族成员丰富，在果实发育过程中相互协调。樱桃Cerasus pseudocerasus在发育过程中，PG和PL在果实膨大期迅速升高，促进了原果胶的分解，可溶性果胶含量显著增加；而转色期PG活性显著降低[24]。梨Pyrus communis PcPG1和苹果Malus domestica MdPG1在果实成熟过程中表达量逐渐上升[25−26]；番茄PG基因的表达量随乙烯的增加而增强；外源乙烯处理可通过增强PG基因的表达而促进番茄软化；在番茄中过表达红树莓Rubus idaeus RiPG2基因可加速果实软化[27−28]。草莓Fragaria × ananassa FaPG2的高表达是启动果实软化的因素之一[29]。曾燕如等[30]通过硼酸处理芒果Mangifera indica果实，发现PG基因表达量下降，延缓果实成熟。陈迪飞等[31]对莲雾Syzygium samarangense喷施外源脱落酸(ABA)，发现果实中PG基因活性显著提高，促进果实的成熟与软化。在本研究中，不同覆盆子PG家族成员在果实发育阶段所起的作用不同，介导果实膨大和果实软化的成员不同。因此根据不同的育种目标，要针对性地选择合适的基因做分子标记或基因工程育种。
此外，RchPG3~RchPG5、RchPG7~RchPG9、RchPG13~RchPG15等基因在果实中表达量较低，推测它们可能在根、茎、叶等其他器官发育过程中起作用。相关研究表明：PG基因家族除作用于果实外，还在植物其他器官中呈现高表达水平。陈迪飞等[31]发现莲雾SsPG12、SsPG13和SsPG24在根中特异性表达，SsPG2和SsPG4在根、茎、叶中呈现高表达水平；霍如雪等[32]发现桃prunus persica 中PpaPG60在茎中呈现高表达量，PpaPG80在叶中呈现高表达量。关于掌叶覆盆子PG基因在根、茎、叶等其他器官发育过程的表达与调控有待后续深入研究。
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本研究从掌叶覆盆子基因组中鉴定到47个RchPGs基因，可分为6个分支(Clade A~F)。RchPGs基因在掌叶覆盆子果实发育不同阶段差异表达，RchPG6和RchPG29等基因在果实发育早期高表达，而RchPG16和RchPG28等基因在果实成熟软化时强烈表达，说明RchPGs不同成员协同调控果实的膨大与软化。
Genome-wide identification of the polygalacturonase gene family in Rubus chingii and its roles in fruit development
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摘要:
目的 对掌叶覆盆子Rubus chingii果胶水解酶中的多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)基因家族进行鉴定与分析，找出果实发育过程中的关键编码基因PGs，可为实现药果果型大或红果花托软的育种目标提供理论参考。 方法 基于掌叶覆盆子基因组，利用生物信息学方法筛选和鉴定掌叶覆盆子PG基因家族成员，并利用转录组测序和实时荧光定量PCR (RT-qPCR)进行表达模式分析。 结果 共鉴定了47个覆盆子RchPGs基因，不均匀地分布在7条染色体上，根据系统发育可分为6个分支(Clade A~D)。其中28个RchPGs蛋白都具有完整的4个结构域Ⅰ (SPNTDG)、Ⅱ (GDDC)、Ⅲ (CGPGHGISIGSLG)和Ⅳ (RIK)；11个RchPGs蛋白不包含结构域Ⅲ。转录组测序结果表明：RchPG6、RchPG29、RchPG1、RchPG23和RchPG12等在果实发育早期起作用，参与果实膨大过程中的细胞壁水解；而RchPG16、RchPG2、RchPG10、RchPG28和RchPG38等则在果实发育后期表达量升高，介导果实成熟与软化。尤其是RchPG16，红果期表达量急剧升高，每千个碱基/百万个定位片段(FPKM)是未成熟大绿(BGⅠ)时期的 2168.17 倍，说明RchPG16对果实成熟与软化具有至关重要的作用。结论 RchPG基因家族成员在掌叶覆盆子果实发育不同阶段差异表达，分别促进果实膨大和软化，其中RchPG16和RchPG28在果实成熟软化过程中可能起到关键作用。图8表1参32 Abstract:Objective The polygalacturonase (PG) gene family members of pectin hydrolase in Rubus chingii were identified and analyzed in this study, and the vital PG-coding genes during fruit development were screened, which could provide a theoretical reference for achieving the breeding goals to expand the fruit size or inprove fruit softening. Method Genome-wide identification and bioinformatics methods were used to identify the PG gene family members of R. chingii. Transcriptome sequencing and RT-qPCR were used to analyze expression patterns of PG genes during fruit developmental stages. Result A total of 47 RchPGs were predicted, which were unevenly distributed on 7 chromosomes. Phylogenetic relationships showed they could be divided into 6 clades (Clade A−D). Among these, 28 RchPGs proteins had integrated 4 domains, Ⅰ (SPNTDG), Ⅱ (GDDC), Ⅲ (CGPGHGISIGSLG), and Ⅳ (RIK), while 11 RchPGs missed domain Ⅲ. The result of the transcriptome sequencing showed that RchPG6, RchPG29, RchPG1, RchPG23 and RchPG12 involved in hydrolysis of cell wall for fruit expansion at earlier stages of fruit development. Oppositely, RchPG16, RchPG2, RchPG10 and RchPG38 were highly expressed at later stages and might be essential for fruit ripening and softening. In particular, the expression level (FPKM values from RNA-seq) of RchPG16 was dramatically increased at the red fruit stage, and the FPKM value was 2168.17 times higher than that at the immature big green (BGⅠ) stage, indicating that it played a significant role in fruit ripening and softening.Conclusion RchPG gene family in R. chingii were differentially expressed in different stages of fruit development to improve fruit expansion and softening. Among them, RchPG16 and RchPG28 genes may play a key role in the ripening and softening of R. chingii. [Ch, 8 fig. 1 tab. 32 ref.] -
Key words:
- polygalacturonase /
- Rubus chingii /
- fruit expanding /
- ripening and softening /
- bioinformatics
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园艺植物是指提供人类食用或观赏的植物，包括果树、蔬菜、观赏植物等，具有较高的经济价值和美化用途[1]。在现代社会中园艺植物产品已成为人们生活中不可缺少的部分，且市场需求在逐年增加。目前，园艺植物生产面临育种周期长、选择范围有限等问题，已经不能满足日益增长变化的市场需求[2]。研究园艺植物生长发育的内在机制对解决上述问题至关重要，并可有效提高其产量和质量。园艺植物通过光合作用产生的碳水化合物，需经过复杂的方式运输到库器官(如根、茎、嫩叶、果实)，具体包含有机同化物在源端韧皮部的装载、经韧皮部长距离运输、库器官韧皮部的卸出、韧皮部后运输等一系列过程[3−4]。其中，韧皮部卸载对光合同化物在器官之间的运输和分配有着重要作用，是决定园艺植物产量和生产力的重要因素[5]。韧皮部卸载指在韧皮部运输的同化物从筛分子伴胞复合体(SE-CC)卸出的筛分子卸载和韧皮部短距离后运输2个密切相关的过程，是目前植物研究的热点领域之一。简言之，韧皮部卸载即光合同化物从维管束韧皮部转移到库细胞以促进植物生长发育和能量储存的过程[6−7]。
韧皮部运输的主要糖成分是研究韧皮部卸载的重要基础，植物体内糖的转运不仅对植物的生理活动如光合作用和碳分配等有直接影响，还影响植物的营养发育和花芽分化等过程[8]。本研究从韧皮部运输的主要糖分形式、韧皮部卸载方式、韧皮部卸载的研究方法及对园艺植物的影响等4个方面对园艺植物韧皮部卸载研究进行评述，旨在为后续研究提供参考和借鉴。
1. 韧皮部运输的主要糖分形式
在研究同化物卸载途径前，首先应该清楚韧皮部运输同化物的主要形式。还原糖类在运输过程中极易被氧化，因此，能进行韧皮部长距离运输的糖类为非还原糖或糖醇。大多数高等植物以蔗糖作为光合产物的主要运输形式[9]，但自然界也存在以其他形式的糖作为光合产物主要运输形式的植物，如约5%的植物以棉子糖系列寡糖或者山梨醇为主，园艺植物中如黄瓜Cucumis sativus、西瓜Citrullus lanatus等葫芦科Cucurbitaceae植物以棉子糖为主[10−11]，蔷薇科Rosaceae以山梨醇为主[12]。需注意区分同化物的储藏形式和运输形式，如西瓜尽管以棉子糖系列寡糖为主要运输糖分，但果实储存糖分则是以蔗糖为主[11]。
2. 韧皮部卸载的方式
虽然韧皮部卸载包括筛分子卸载和韧皮部后运输2个主要过程[6]，但是不同的园艺植物在不同的发育时期以及不同的组织器官中，韧皮部卸载的方式也存在很大差别[13]。韧皮部卸载方式主要包括共质体途径、质外体途径或两者交替途径。其中共质体途径又可称为胞间转运，而质外体途径又可称为质膜转运[7]。
2.1 共质体卸载途径
共质体卸载途径指光合同化物通过胞间连丝从筛分子伴胞复合体中将同化物运输到周围韧皮部薄壁细胞，并进一步运送到库器官的过程[14−16]。共质体卸载途径主要受胞间连丝与中间细胞影响，属于顺浓度梯度的被动运输过程。近期研究表明：胞间连丝的种类(如漏斗型)、分叉情况、是否处于闭合态等均会影响胞间连丝的功效，即意味着有时即便存在胞间连丝，但若胞间连丝是闭合态，也无法采用共质体运输[17−19]。在硬骨凌霄Tecoma capensis的研究中发现：中间细胞与周围韧皮部薄壁细胞存在大量的胞间连丝，这进一步证实了中间细胞是共质体卸载的又一重要形态标志[16, 20]。此外，糖类代谢酶在韧皮部卸载过程中有显著作用，如蔗糖合酶(SuSy)与共质体卸载途径密切相关(图1A)，可见对关键代谢酶的研究尤为重要，是证明共质体卸载方式的重要证据。
2.2 质外体卸载途径
质外体卸载途径是指光合同化物从筛分子伴胞复合体中跨膜进入质外体空间，再经过机体代谢和(或)跨膜蛋白转运，被周围韧皮部薄壁细胞吸收并运输到库器官的过程[14]。因此，质外体卸载途径与共质体卸载途径的主要区别：一是质外体卸载不通过胞间连丝，二是质外体卸载需借助各类糖转运蛋白逆浓度梯度的主动运输过程[16]。以质外体卸载为主的研究中，转移细胞是判断质外体卸载途径的主要形态标志[16, 21]。在拟南芥Arabidopsis thaliana韧皮部薄壁转移细胞的功能研究中发现，蔗糖通过影响韧皮部薄壁转移细胞中蔗糖输出活性来调节细胞壁向内生长[22]，这与先前关于增加的质膜表面积从而提高物质跨膜运输效率的假设是一致的[15]。在代谢酶方面，细胞壁酸性转化酶是调控韧皮部质外体卸载的主要酶，可在胞外空间分解蔗糖(图1B)，细胞壁酸性转化酶活性及转录本的表达变化常与共质体向质外体转化时间变化相一致[23−24]。
3. 韧皮部卸载的研究方法
用于研究同化物卸载途径的传统方法主要有空中皮技术、新浆果杯法和组织圆片技术等[14−15]。植物体内物质运输细胞学路径的方法也得到较大程度的革新，目前植物组织及细胞学路径研究的主要方法包括透射电子显微镜技术、荧光染料示踪法、绿色荧光蛋白示踪法、胶体金免疫定位技术等。
3.1 韧皮部超微结构观察
韧皮部及其周围薄壁细胞的超微结构观察可为同化物韧皮部卸载提供细胞学证据。如以‘富有’甜柿Diospyros kaki ‘Fuyu’果实为研究对象，发现韧皮部伴胞与维管薄壁细胞上均分布一定数量的胞间连丝，说明韧皮部卸载路径为共质体路径[26]。此外，有研究表明栽培枣Ziziphus jujuba和野生酸枣Z. jujuba var. spinosa在果实成熟阶段胞间连丝密度以及可溶性糖含量差别较大，前者存在大量胞间连丝，加速了以蔗糖为代表的可溶性糖的显著积累，后者胞间连丝很少且可溶性糖积累不明显[27−28]。这表明超微结构可用于揭示韧皮部卸载强度，是完成卸载的结构基础。
3.2 荧光法鉴别卸载途径
3.2.1 共质体类
目前最常用的共质体标记物为羧基荧光素 (carboxyfluorescein, CF)，CF可长距离运输，属“膜不透性”探针[10, 29−30]，但会受到质体外微环境pH和液泡区隔化的限制[31]。与CF不同的是，荧光黄染料 (lucifer yellow CH, LYCH)不受pH影响，在生理pH值下有较高的解离度，故不易透膜，因此，同样可以作为共质体标记物[32]。目前CF广泛应用于园艺植物的根、茎、叶、果实[11, 33−40]中，用以判断卸载路径的变化。由表1可见：在大部分已研究的园艺植物中都用该方法来研究韧皮部卸载路径。前期研究也采用CF表明：东方百合‘索邦’Lilium ‘Sorbonne’[24]和石蒜Lycoris radiata[41]的鳞茎形成后期以共质体运输为主。
表 1 园艺植物韧皮部卸载研究汇总Table 1 Summary of studies on phloem unloading of horticultural plants分类 种名 研究内容 研究方法 卸载方式 参考文献 果树 ‘富有’甜柿Diospyros kaki ‘Fuyu’ 果实发育 半薄切片法 共质体 [26] 扁桃Prunus dulcis 种皮发育 半薄切片法 共质体 [52] 果实发育 质外体 [53] 核桃Juglans regia 种皮发育 半薄切片法、胶体金免疫
定位技术、CFDA示踪共质体 [32, 47] 果皮发育 质外体 桃Amygdalus persica 果实发育 半薄切片法 质外体 [55] 蓝莓Vaccinium uliginosum 果实发育 半薄切片法、CFDA示踪 质外体 [46] 苹果Malus domestica 果实发育 胶体免疫金定位技术、CFDA示踪 质外体 [39, 54] 草莓Fragaria ananassa 果实发育 CFDA示踪 质外体 [37] 鸭梨Pyru bretschneideri 果实发育 CFDA示踪 质外体 [38] 猕猴桃Actinidia chinensis 果实发育 半薄切片法、CFDA示踪 质外体 [36] 荔枝Litchi chinensis 果皮发育 CFDA示踪 质外体 [40] 葡萄Vitis vinifera 果实发育 绿色荧光蛋白、CFDA示踪 共质体-质外体 [44] 无花果Ficus carica 果实发育 CFDA示踪 共质体-质外体 [56] 文冠果Xanhoceras sorbifolium 果实发育 半薄切片法、CFDA示踪 共质体-质外体-共质体 [61] 蔓越橘Vaccinium macrocarponl 果实发育 半薄切片法、CFDA示踪 共质体-质外体-质外体 [60] 枣Ziziphus jujuba 果实发育 胶体免疫金定位技术、CFDA示踪 共质体-质外体-质外体 [57−59] 质外体-共质体-质外体 [28, 30, 49] 蔬菜 豌豆Pisum sativum 茎发育 14CO2标记 共质体 [63] 蚕豆Vicia faba 茎发育 14CO2标记 共质体 [64] 黄瓜Cucumis sativus 果实发育 绿色荧光蛋白、CFDA示踪 质外体 [10, 65] 西瓜Citrullus lanatus 果实发育 CFDA示踪 质外体 [11] 甜菜Beta vulgaris 叶片发育 14CO2标记 共质体 [67−69] 根发育 共质体-质外体 番茄Solanum lycopersicum 果皮发育 CFDA示踪 共质体-质外体 [66] 观赏植物 黄梁木Neolamarckia cadamba 叶柄发育 CFDA示踪 共质体 [35] 云南箭竹Fargesia yunnanensis 地上茎发育 CFDA示踪 共质体 [70−71] 硬骨凌霄Tecoma capensis 叶脉 半薄切片法 共质体 [20] 南林-95杨Populus × euramericana ‘Nanlin95’ 叶发育 CFDA示踪 共质体 [33] 茎发育 共质体 根发育 质外体 毛地黄Digitalis purpurea 蜜腺 半薄切片法 质外体 [72] 龟背竹Monstera deliciosa 气根发育 14CO2标记 质外体 [73] 牡丹Paeonia suffruticosa 叶柄发育 半薄切片法、CFDA示踪 生长期：共质体为主，质外体为辅 [34] 茎发育 休眠期：共质体 根发育 慈竹Bambusa emeiensis 地上茎发育 CFDA示踪 共质体-质外体 [35] 油茶Camellia oleifera 果实发育 CFDA示踪 共质体-质外体-共质体 [74−75] 绿色荧光蛋白是直观性极强的遗传标记物，属共质体探针，与CF相比，可获得更准确的示踪结果[15]；该方法在拟南芥[42]、木薯Manihot esculenta[43]卸载路径鉴定上得到了很好的应用，但在园艺植物中应用较少，仅在葡萄Vitis vinifera上有报道[44]。
3.2.2 质外体类
Esculin可被蔗糖转运蛋白(SUT)及专一运输蔗糖的SWEET等运输，可指示是否为韧皮部质外体卸载途径[11, 45]。此PTS (trisodium, 3-hydroxy-5,8,10-pyreno trisulfonate)和SRG (sulphorhoda-mine G)等荧光染料只限制在质外体中，不能被细胞壁偶联，也是较为理想的质外体标记物[46]。综合来看，荧光染料可通过不同注射技术引入韧皮部，代谢多久可观察到明显荧光则由园艺植物种类决定，一般为12~72 h[23, 46]；绿色荧光蛋白则较为稳定，但其应用受转化体系建立与否的制约，耗时相对长。以上荧光观察均可通过荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜进行，从而辅助明确卸载路径。
3.3 代谢酶
3.3.1 亚细胞定位
在质外体卸载的研究中，常用胶体金免疫定位技术研究酸性转化酶在植物器官内的亚细胞定位，以此明确韧皮部卸载的机制[14]。该方法在园艺植物研究中仅涉及到核桃Juglans regia[32, 47]、枣[30]和苹果Malus domestica[39]等少数植物。
3.3.2 酶活性与基因表达
蔗糖是韧皮部运输的主要糖分之一，研究酸性转化酶和蔗糖合酶的活性与基因表达对韧皮部卸载有重要意义。在慈竹Bambusa emeiensis幼笋韧皮部卸载研究中发现：竹笋后期细胞壁酸性转化酶活性及表达量与前期相比明显升高，且同一时期韧皮部卸载方式由共质体向质外体转变，说明细胞壁酸性转化酶与韧皮部卸载方式变化保持一致[48]，相似的结果在枣[49]、黄瓜[10]中也有体现。相反，蔗糖合酶活性在马铃薯Solanum tuberosum块茎形成过程中，由质外体途径向共质体途径转变时同步增高[50]，蔗糖合酶表达量则在‘索邦’百合[24]和石蒜[41]鳞茎形成的后期阶段显著提高。
4. 园艺植物韧皮部卸载研究
4.1 果树韧皮部卸载研究
韧皮部通过质外体和(或)共质体途径对光合同化物等进行转运来调控果实发育，故韧皮部卸载在提高果树果实质量及产量方面有重要作用[51]。目前对果树韧皮部卸载的研究相对较多。大多数果树卸载路径为单一路径，即只有共质体或质外体卸载路径，还有一些果实韧皮部卸载路径存在转换。由表1可见：蓝莓Vaccinium uliginosum等10种果实的卸载方式为单一路径，且以质外体卸载路径为主；扁桃Prunus dulcis果实维管束结构中没有发现筛分子伴胞复合体与周围韧皮部薄壁细胞存在胞间连丝[52−53]，而且其余9种果实在研究中发现荧光染料CF均未从维管束中卸出[26, 36−40, 46, 54−55]。表明其韧皮部卸载路径是质外体路径，现有报道中仅甜柿Diospyros kaki果实的卸载方式因胞间连丝的存在被判定为共质体卸载路径[20, 26]。
共质体卸载路径和质外体卸载路径并不相互排斥，而是可以互相转化的，在果实韧皮部卸载研究中，同化物在果实的不同发育期呈现不同的卸载路径。葡萄、灵武长枣Ziziphus jujuba ‘Lingwuchangzao’、中宁圆枣Ziziphus jujuba ‘Zhongningyuanzao’、无花果Ficus carica和蔓越橘Vaccinium macrocarponl等果实的韧皮部卸载都遵循共质体到质外体路径的转变过程，有相似也有差异。其中葡萄和无花果果实存在发育前期和发育后期2个生长期，在发育前期两者筛分子伴胞复合体和韧皮部薄壁细胞之间均存在大量的胞间连丝，但在发育后期不存在胞间连丝[44, 56]。枣果实的生长期包括膨大前期、快速膨大期、着色期和完熟期。灵武长枣和中宁圆枣的研究发现：荧光染料CF只在膨大前期从维管束中卸出，其他时期CF均未卸出[57−58]，通过超微结构观察，进一步验证了灵武长枣果实的卸载路径[59]。而在另一些枣品种中却在果实发育前中后期存在由质外体—共质体—质外体卸载路径相互转换的过程[30, 49]。蔓越橘果实的生长期分为幼果期、膨果期、转色期与成熟期，胞间连丝只在幼果期与膨果期被发现，在转色期和成熟期均未被发现[60]。对核桃果肉韧皮部及其周围薄壁细胞组织定位研究[32]发现：核桃果皮韧皮部卸载主要采取质外体路径，而种皮内则采用共质体路径，说明在果实不同部位存在差异。文冠果Xanthoceras sorbifolium果实在发育前期筛分子伴胞复合体与韧皮部薄壁细胞存在胞间连丝，发育中期未发现胞间连丝，但发育后期胞间连丝重新出现，表明在果实发育过程中韧皮部卸载途径存在共质体—质外体—共质体的转化过程[61]。因此，韧皮部卸载路径可能随着果实的发育进程会出现一次甚至多次的转化，应结合发育阶段准确分析，且具有品种(种)特异性，不同部位也会呈现差异。
4.2 蔬菜韧皮部卸载研究
蔬菜类包括茎菜类、根菜类、果菜类等。蔬菜通过光合作用产生的化合物经韧皮部运输到库器官，而不同库器官之间的光合产物分配被认为是影响其产量的主要因素[62]。目前蔬菜韧皮部卸载研究主要在果菜类和根菜类，尤以果菜类的相关研究较多。针对果菜类不同器官及不同发育过程卸载方式均有研究(表1)。在豌豆Pisum sativum根尖发育过程中发现卸载方式主要以共质体卸载路径为主[63]，在蚕豆Vicia faba中也有相似结果[64]；在水苏糖运输型植物黄瓜[10]和西瓜[11]的研究中，均发现荧光染料CF并未从维管束中卸出，表明韧皮部卸载路径以质外体为主，此外，己糖转运蛋白CsSUC4在黄瓜果实发育过程中均被限制在韧皮部内，进一步证实黄瓜韧皮部卸载为质外体路径[65]。但在同样为果菜类的番茄Solanum lycopersicum中发现：前期CF可以在番茄果皮薄壁细胞间移动，但后期则不可。表明番茄幼果期以共质体路径为主，发育后期则转变成质外体路径[66]。
近年对根菜类甜菜Beta vulgaris韧皮部卸载的研究较为透彻，不仅包括肉质根还涉及到叶片。通过对甜菜肉质根中细胞壁酸性转化酶和蔗糖合酶表达模式研究，明确了在直根发育过程中韧皮部卸载存在从共质体向质外体转化[67]；在叶片研究中，将PCMBS (parachloromercuribenzene sulfonic acid)引入发育中的甜菜叶片，发现同化物的输入未受到影响，且同化物从韧皮部的卸出也未经过跨膜运输，故其韧皮部卸载路径以共质体为主[68−69]。可见，各类蔬菜的韧皮部卸载路径会因器官和发育阶段的不同而有所差异，且在不同器官的发育过程中存在转化现象。后续相关研究应根据蔬菜品种具体分析。
4.3 观赏植物韧皮部卸载研究
4.3.1 观形植物
观形植物多以树形优美的乔木为主，但在观形植物研究方面很少涉及韧皮部卸载途径。在‘南林95杨’Populus ×euramericana ‘Nanlin95’[33]研究中发现：CF在“库”叶、茎尖和根尖都可以卸出，表明韧皮部卸载方式为共质体路径，而在次生茎和次生根中无法卸出，则证明其主要采用质外体路径。同样在黄梁木Neolamarckia cadamba叶柄研究中也发现：CF可在韧皮部薄壁细胞内卸载，证实其卸载方式以共质体路径为主[35]。
4.3.2 观花植物
观花植物的研究对象既有草本也有木本植物，木本植物的韧皮部卸载路径较草本植物多变。在硬骨凌霄叶脉中发现中间细胞与周围韧皮部薄壁细胞存在大量胞间连丝，证明其韧皮部卸载方式为共质体[20]。在毛地黄Digitalis purpurea蜜腺中发现：在花蜜分泌过程中质外体占主导地位[72]。而在油茶Camellia oleifera果实研究中发现：在果实发育的早、中、晚期蔗糖运输途径有差异，遵循从共质体—质外体—共质体的转换规律[74]，该结论同样在油茶品种‘华硕’C. oleifera ‘Huashuo’中得到验证[75]。另外，在牡丹Paeonia suffruticosa的研究中发现：牡丹在生长期和休眠期同化物运输方式各不相同，生长期除根部外，各器官之间均存在胞间连丝，即光合同化物在韧皮部中以共质体卸载为主，质外体卸载为辅；但在休眠期光合同化物的运输则以共质体卸载为主[34]。
4.3.3 观叶植物
观叶类植物的研究目前只涉及竹Bambusoideae和龟背竹Monstera deliciosa，但是关于竹笋或竹秆中糖的韧皮部卸载和卸载后路径的信息较少。已有研究发现：慈竹幼笋CF能够扩散出韧皮部，但被限制在维管束内，表明蔗糖在维管束内的卸载以共质体路径为主，但在维管束与周围薄壁细胞间为质外体路径[35]；在云南箭竹Fargesia yunnanensis韧皮部卸载过程中存在很多胞间连丝，确定其韧皮部卸载为共质体路径[70−71]；龟背竹气根中的蔗糖被细胞壁酸性转化酶分解，经己糖转运至库细胞，这为质外体卸载提供了有力证据[73]。
5. 问题与展望
韧皮部卸载是园艺植物生长发育过程中的关键，是植物体内多因素共同作用的结果，包括自身细胞结构、代谢酶和蔗糖转运蛋白等。通过了解韧皮部卸载的途径与内部机制有助于提高园艺植物的产量与质量。目前对园艺植物韧皮部卸载的研究正处于发展阶段，研究由初期的细胞层面过渡至生理生化层面，并开始关注到分子层面。单种方法可能带来错误的表征，后续研究可综合采用细胞学，糖含量、酶活性及基因表达等定量方法从生理化及分子等多层面明确卸载路径。有研究表明蔗糖代谢酶以及蔗糖转运蛋白与韧皮部卸载途径的变化有关，但在园艺植物韧皮部卸载方面的研究还很欠缺。因此，需重视园艺植物韧皮部卸载与代谢酶以及糖转运蛋白的联系。
现有的报道认为蔷薇科植物以山梨醇为主要运输糖，葫芦科植物以棉子糖类为主，但同科内物种研究仍较少，应扩大研究科内物种数量，寻找不同物种卸载路径中的共性与个性。决定园艺植物质量和产量的重要性状大多与糖的转运密切相关，集中在果实的糖含量、地下变态器官的碳储藏等方面，因此韧皮部卸载在相关生物学过程中可发挥极为重要的作用，但现有研究并未揭示韧皮部卸载路径的精确调控机制。
总体而言，园艺植物韧皮部卸载机制的研究已取得了一些进展，但仍有很多问题未解决。今后的研究重点可包括：①从细胞学、生理生化学及分子生物学等不同层面进行研究，明确卸载路径中的系统性、有效性及互证性；②不同运输糖类在韧皮部卸载中的异同；③糖信号是否介导了韧皮部卸载路径的根本性改变；④结合突变体，深入阐述糖韧皮部卸载的调控机制。应结合分子生物学、基因工程学等领域，进一步揭示韧皮部卸载在园艺植物生长发育中的作用机制，为园艺植物的质量与产量的提升提供更深入的理论支撑。
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图 3 掌叶覆盆子与拟南芥、番茄PG家族成员的系统发育树
Figure 3 Phylogenetic tree of PG family members from R. chingii, A. thaliana, and S. lycopersicum
图 4 掌叶覆盆子RchPGs基因家族结构分析以及系统发育树
Figure 4 Gene structures analyses of RchPGs families and phylogenetic tree of RchPGs in R. chingii
图 5 掌叶覆盆子RchPGs 蛋白家族保守基序预测
Figure 5 Motif prediction of RchPGs family members in R. chingii
图 6 掌叶覆盆子RchPGs 蛋白家族保守基序序列分析
Figure 6 Motif sequence analysis of RchPGs family members in R. chingii
图 7 RchPGs基因染色体定位和共线性分析
Figure 7 Chromosomal location and synteny analyses of RchPGs in R. chingii
图 8 掌叶覆盆子RchPGs基因表达量转录组分析与RT-qPCR鉴定
Figure 8 Transcriptome analysis and RT-qPCR identification of RchPGs genes expression in R.chingii
表 1 掌叶覆盆子RchPGs家族成员特征
Table 1. Characteristics of RchPGs family members in R. chingii
基因编码 基因名称 等电点 分子量/kDa 亲疏水
指数不稳定
系数分支 基因编码 基因名称 等电点 分子量/kDa 亲疏水
指数不稳定
系数分支 LG01.1059 RchPG1 5.96 51.08 −0.073 44.79 E LG04.283 RchPG25 8.63 57.49 −0.356 45.27 A LG01.1356 RchPG2 6.83 51.99 −0.127 44.12 E LG04.396 RchPG26 5.26 49.55 −0.183 33.24 B LG01.1565 RchPG3 8.11 42.23 0.056 29.10 C LG04.993 RchPG27 9.02 52.04 −0.278 44.66 A LG01.1665 RchPG4 6.43 39.40 −0.063 24.24 C LG05.1140 RchPG28 8.48 44.96 −0.174 42.43 E LG01.2532 RchPG5 6.08 47.67 −0.267 38.63 D LG05.1261 RchPG29 5.19 52.20 −0.018 38.83 E LG01.2853 RchPG6 9.09 55.47 −0.193 43.86 E LG06.1099 RchPG30 8.90 50.20 −0.242 28.08 D LG01.3312 RchPG7 8.23 58.83 −0.239 46.37 F LG06.1103 RchPG31 6.96 43.60 −0.148 23.68 D LG01.3577 RchPG8 8.52 15.81 0.008 38.87 C LG06.1105 RchPG32 8.98 42.48 −0.210 27.47 D LG01.3578 RchPG9 9.49 41.00 0.035 39.66 C LG06.1675 RchPG33 7.81 43.81 −0.197 35.69 F LG01.3579 RchPG10 9.48 107.01 −0.032 41.27 C LG06.2235 RchPG34 8.81 49.23 −0.059 43.94 B LG02.1098 RchPG11 8.01 40.06 −0.059 30.89 F LG06.272 RchPG35 7.48 53.19 −0.275 36.87 A LG02.1344 RchPG12 5.39 49.49 −0.063 43.95 E LG06.3272 RchPG36 5.50 51.64 −0.186 36.12 B LG02.1359 RchPG13 5.76 50.91 −0.192 39.89 D LG06.3274 RchPG37 5.00 45.35 −0.167 34.66 F LG02.1479 RchPG14 6.24 131.12 −0.585 51.01 D LG06.3368 RchPG38 5.65 52.96 −0.054 44.42 E LG02.1829 RchPG15 9.35 49.19 −0.451 34.18 B LG06.4848 RchPG39 7.16 48.48 −0.108 48.34 A LG02.1835 RchPG16 8.94 49.80 −0.288 30.39 B LG07.1450 RchPG40 8.95 48.86 −0.283 34.24 B LG02.2252 RchPG17 7.48 49.52 −0.254 38.72 D LG07.1820 RchPG41 7.94 40.24 −0.292 32.80 B LG02.4536 RchPG18 6.38 44.22 −0.015 31.62 D LG07.1821 RchPG42 6.30 48.45 −0.227 25.48 B LG03.1665 RchPG19 8.94 44.71 −0.181 27.06 D LG07.1856 RchPG43 6.44 48.39 −0.256 29.74 B LG03.5002 RchPG20 5.95 52.65 −0.228 40.49 D LG07.1859 RchPG44 7.80 48.12 −0.263 23.46 B LG04.1300 RchPG21 6.39 40.22 −0.357 27.43 F LG07.2143 RchPG45 5.19 45.73 −0.275 37.35 F LG04.1461 RchPG22 6.14 74.72 −0.390 57.75 A LG07.325 RchPG46 7.54 51.44 −0.076 37.22 E LG04.1621 RchPG23 6.14 46.91 0.094 48.01 E LG07.3923 RchPG47 6.09 49.37 −0.170 34.22 E LG04.1640 RchPG24 8.74 46.54 −0.105 33.44 D 
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