下载:
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不同树种木材的天然耐腐性差异大，据统计每年全球因木材腐朽造成的损失占采伐利用木材的10%以上，严重影响木材的加工利用[1]。木材腐朽主要由腐朽菌和变色菌等真菌侵蚀木材细胞所引起，而木材的天然耐腐性则依靠自身代谢物的生物杀菌、抑菌活性来实现[2]。闽楠Phoebe bournei为樟科Lauraceae楠属Phoebe植物，是中国特有的珍稀用材与绿化树种。楠木具有极强耐腐性，阴沉木历经千年不腐，被誉为“木中之玉”，市场俗称“金丝楠乌木”[3]。闽楠和桢楠Phoebe zhennan作为“金丝楠木”最主要的产材树种，树干挺拔，木材颜色呈淡黄色，坚硬细密，纹理美观具有芳香香气，属上等家具良材[4]。因此，闽楠可作为研究木材天然耐腐性的良好材料，闽楠全基因组测序的完成为基因挖掘和功能研究提供了重要基础。
已有研究发现：从木材分离的木脂素(lignan)类化合物具有抗菌活性，参与植物防御系统，增强木材耐久性和抗真菌能力。例如北美乔柏Thuja plicata心材中提取的木脂素通过清除自由基和螯合亚铁来干扰真菌氧化还原循环提高木材耐腐性[5]，南洋杉Araucaria araucana中提取的松脂素(pinoresinol)和开环落叶松脂素(secoisolariciresinol)对木材腐朽菌具有较好抗性[6]。然而，关于木脂素生物合成调控途径尚不明确，从而限制其深入研究与生产应用。
松脂素还原酶Pinoresinol-lariciresinol reductase (PLR)是一种编码松脂醇的落叶松脂素还原酶基因，属木脂素生物合成的关键酶，一分子松脂素在PLR松脂素-落叶松脂素还原酶作用下经两步还原成落叶松脂素和异落叶松脂素，也是木脂素生物合成途径中重要限速步骤之一。目前已从模式植物拟南芥Arabidopsis thaliana[7]和富含木脂素的植物(连翘Forsythia suspense[8-9]、菘蓝Isatis indigotica[10]、亚麻属Linum[11-13])中克隆得到PLR基因。迄今为止，所有以重组纯化蛋白为特征的PLR均可以将松脂素还原为落叶松树脂素以及将落叶松树脂素还原为异落叶松树脂素，但AtPrR1对落叶松树脂素的活性比松脂素低约35倍，AtPrR2对作为底物的落叶松树脂素完全没有催化活性。因此，MIN等[14]将它们命名为松脂醇还原酶，而不是松脂醇-落叶松树脂醇还原酶。PLR的表达受激素的调控，不同物种在不同激素处理下松脂醇-落叶松树脂醇还原酶的表达模式有所不同。在脱落酸(ABA)处理下，LuPLR1的表达增强，LuPLR1的表达似乎是由在种子成熟和休眠中起关键作用的植物激素ABA触发的[12-13]。所以赤霉酸(GA)对LuPLR1的表达具有相反的调节作用[13]。在茉莉酸甲酯(MeJA)的处理下，LuPLR2的表达量有明显提高，因为亚麻在MeJA处理和伤害后，LuPLR2基因表达和叶酸蛋白产量增加，这与这些木脂素参与植物防御反应一致。本研究选择耐腐性强的闽楠解析木脂素合成重要限速酶PLR基因，利用闽楠基因组数据，对PLR基因家族成员进行鉴定和基因结构、保守基序及染色体定位分析，构建系统发育进化树预测闽楠PLR (PbPLR)催化酶的立体选择性，为进一步研究PbPLR基因在闽楠木脂素合成过程中的生物学功能提供基础。
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采用BLAST和hmmsearch鉴定闽楠PLR家族成员。首先在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库(
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ )下载拟南芥PLR家族蛋白序列，通过BLASTP同源比对检索，用HMMER 3.1软件[15]搜索闽楠PLR基因家族的候选序列。搜索获得的基因成员在人工筛选后提交至SMART数据库[16]确认保守结构域，确定PLR基因成员，并依据染色体位置进行命名。 -
采用MapChart软件绘制PbPLR基因在闽楠基因组上的位置信息，并利用MCScanX软件分析PbPLR基因的共线性区域和复制情况。
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根据PbPLR基因编码区序列和基因组序列，采用在线GSDS (
http://gsds.gao-lab.org )分析PbPLR基因结构。并通过在线工具MEME Suite (http://meme-suite.org/ )分析PbPLR氨基酸序列中保守基序，设置保守基序个数为20。最后利用SnapGene软件进行PbPLR蛋白序列比对。 -
利用植物蛋白数据库下载的拟南芥、亚麻、台湾杉Taiwania cryptomerioides等物种PLR蛋白序列，与PbPLR家族成员进行系统进化分析。利用MEGA X软件构建进化树，采用邻接法(neighbor-joining method，NJ)，重复1 000次(Bootstrap为1 000)，利用在线工具ITOL (
https://itol.embl.de/ )美化MEGA X软件输出的进化树。 -
根据闽楠基因组数据，利用TBtools软件提取PbPLR基因序列转录起始位点上游2 000 bp序列，使用在线软件PlantCARE (
http://intra.psb.ugent.be:8080/PlantCARE/ )预测PbPLR基因启动子序列中的顺式调控元件。 -
选取1.5年生长势一致的闽楠半同胞家系苗进行激素处理，分别采集叶、茎和根进行PbPLRs基因表达分析。基于前期预实验结果，本研究分别使用1 mmol·L−1 ABA、1 mmol·L−1水杨酸(SA)和2 mmol·L−1 MeJA处理闽楠实生苗，对土壤上部植株均匀喷洒激素，使土壤表面被激素浸湿，同时，以喷洒水为对照(ck)。激素喷施时间为2021年10月1日9:30、10月2日11:00、10月3日11:30、10月3日22:00、10月4日9:00、10月4日9:30。在处理后1、3、12、24、48和72 h取样并液氮速冻。采用CTAB法提取RNA，使用Takara公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)试剂盒反转录合成cDNA。利用在线网站(
http://primer3.ut.ee/ )设计PbPLRs特异性引物(表1)用于实时荧光定量PCR实验。定量PCR反应体系(10 μL)为：SYBR Green 5.0 μL，上下游引物(10 μmol·L−1)各0.2 μL，模板0.8 μL，双蒸水3.8 μL。反应程序为：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s (此步完成时采集荧光信号)，共40个循环。利用CFX96™ Real-Time PCR检测系统(Bio-Rad，美国)。内参基因为PbEF1α，按照$2^{-\Delta \Delta {{C}}_{t}}$ 法计算目的基因相对表达量。运用SPSS软件对定量数据进行分析。表 1 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)引物信息
Table 1. RT-qPCR primer information
引物名称 引物序列(5′→3′) PbPLR1 F: GGCACAAATCTCATCAGCAA; R: GCCAGCTTTTATGGCCTGTA PbPLR2 F: TCTGGATTACGTGCAACAGG; R: AGCGTTTGAGATAGTCCTTCG PbPLR3 F: AGGTCTGGATTACGCACAGC; R: CGTTTGAGATAGTCCTTCACTCG PbPLR4 F: GGAATTCCTTGCTCAAATGAAA; R: TTTCGAAATTTGCCAGACAAC PbPLR5 F: GTGGAACAAGAGCCCAAATG; R: CTGGCAAGTGGGTGAAAAAT PbPLR6 F: ATGGGGTGGATAGCAATGAC; R: CCATAACACGCTCTTTATATGAACC PbPLR7 F: AAGCAAGCAGTCAAACAACC; R: AAAGAAGCCTACGGCATGG PbPLR8 F: GTCGCCGGAAACCACTTG; R: AGTTATTTGGTAAACCAACCTTGA PbEF1α F: CATTCAAGTATGCGTGGGT; R: ACGGTGACCAGGAGCA -
基于拟南芥AtPrRs蛋白序列，应用BLAST和HMMER 3.1软件在闽楠基因组中搜索PLR家族成员。利用BLAST在闽楠基因组中鉴定出12个候选PLR基因，通过HMMER 3.1鉴定出10个成员，去除重复和结构域鉴定后，共鉴定出8个PLR基因家族成员(表2)，按照其在染色体上位置命名为PbPLR1~PbPLR8。
表 2 闽楠PLR基因家族的基本信息
Table 2. Basic information of PLR gene family in P. bournei
基因名称 平均分子量/kDa 等电点 起始位置 染色体位置 氨基酸数量/个 PbPLR1 35 441.98 5.90 82085409~82088341 chr01 336 PbPLR2 35 320.24 6.23 82091009~82098484 chr01 312 PbPLR3 35 378.05 6.32 111385794~111390362 chr02 312 PbPLR4 37 844.40 7.74 80076163~80082267 chr05 312 PbPLR5 35 378.05 6.32 81056124~81058143 chr05 284 PbPLR6 34 970.24 6.41 52893843~52901318 chr10 316 PbPLR7 34 910.23 6.10 52876836~52885817 chr10 316 PbPLR8 13 320.63 8.76 52801277~52802274 chr10 123 -
PbPLRs基因不均匀地分布在闽楠第1、2、5和10号染色体，其中10号染色体上数目最多，含3个PbPLRs成员，2号染色体仅1个成员。闽楠基因复制事件检测结果表明：PbPLR1和PbPLR3经历了片段复制，而PbPLR1和PbPLR2以及PbPLR6、PbPLR7和PbPLR8经历了串联复制。
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利用GSDS软件绘制PbPLRs基因结构图(图1A)可见：8个PbPLRs均含有至少2个外显子，其中PbPLR2、PbPLR3、PbPLR4和PbPLR7各含4个外显子，每个成员均有内含子。
图 1 PbPLR基因结构及蛋白保守基序分析
Figure 1. Analysis of PbPLR gene structure and protein conserved motifs
对PbPLR蛋白序列进行保守基序(Motif)分析，共检测到14个保守基序(图1B)。多序列比对分析发现：PbPLRs都具有保守的NADPH结合位点和赖氨酸(Lys)活性位点(图1C)，PbPLR1含有特异Motif 11、Motif 13和Motif 14；PbPLR 6和PbPLR 8含有特有的Motif 10。
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为研究PbPLRs家族的进化关系并预测其催化酶功能，选取裸子植物台湾杉、北美乔柏，以及被子植物拟南芥、连翘和亚麻等物种的PLR蛋白序列构建系统进化树(图2)。系统进化分析表明：裸子植物的台湾杉TcPLRs和北美乔柏TpPLRs属同一分支，即裸子植物和被子植物PLRs不论其底物立体选择性如何，均可分为2分支群[17-20]。然而，被子植物PLRs根据其底物立体选择性而分属不同支群，根据位于同一分支的LcPLR1、LaPLR1和LuPLR2的底物偏好，推测PbPLR1、PbPLR6、PbPLR7和PbPLR8偏好(+)-松脂醇[(+)-pinoresinol]和(+)-落叶松脂醇[(+)-lariciresinol]；而PbPLR2、PbPLR3和PbPLR4同属于一个小分支，与偏好(−)-松脂醇和(−)-落叶松脂醇的LuPLR1和偏好(+)-松脂醇和(−)-落叶松脂醇的LpPLR1亲缘关系较近，推测PbPLR2、PbPLR3和PbPLR4可将(−)-松脂醇还原为(−)-落叶松脂醇。PbPLR5与其他PLR成员亲缘关系较远，不能预测其选择性。
图 2 闽楠和多个物种的PLR家族系统发育树
Figure 2. PLR family phylogenetic tree of P. bournei and several species
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启动子区域的顺式调控元件可能影响基因表达模式。分别提取PbPLR基因上游2 000 bp序列进行顺式作用元件分析，发现启动子区域具多种类型响应元件(图3A)，主要包括激素响应元件如脱落酸(ABA)响应元件、赤霉素(GA)响应元件、茉莉酸甲酯(MeJA)响应元件和水杨酸(SA)响应元件，与环境胁迫响应元件等，对PbPLR基因启动子区的激素响应元件统计分析表明：PbPLRs含有5种激素响应元件：脱落酸、水杨酸、赤霉素、茉莉酸甲酯和生长素(Auxin)，每个PbPLRs至少含有2个激素响应元件，其中PbPLR2激素响应元件最多(6个)，PbPLR4仅2个(图3B)。在全部PbPLR启动子区域的响应元件中，激素响应元件最多的是脱落酸(9个)，其次为赤霉素(7个)，生长素最少仅2个(图3C)。
图 3 PbPLR家族基因的顺式作用元件分析
Figure 3. Analysis of putative cis-elements in the promoter regions of PbPLRs
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应用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)反应检测了ABA、SA和MeJA处理后根、茎和叶中的PbPLRs基因的表达水平(图4~6)。结果表明：8个PbPLRs基因对ABA、SA和MeJA均有响应，处理1~48 h，基因表达水平显著上调，48 h时达最高值，之后上调幅度降低。其中，ABA处理48 h后根部PbPLR2表达量上调倍数最大，为ck的400倍，茎部表达水平上调为ck的300倍，但叶片中表达上调不明显。相较于在根部和叶部，ABA处理后的PbPLR6在茎部表达量上调倍数最大，48 h时的表达量上调倍数为ck的35倍；ABA处理48 h后的PbPLR4在叶中上调倍数最大，为ck的30倍(图4)。
图 4 PbPLRs基因在ABA处理下的表达模式
Figure 4. Expression patterns of PbPLRs under ABA treatment
SA处理后，根中PbPLR2表达量上调倍数最大，为ck的400倍，PbPLR6在根、茎、叶中均上调表达，而PbPLR1、PbPLR4和PbPLR8上调倍数较低(图5)。
图 5 PbPLRs基因在SA处理下的表达模式
Figure 5. Expression patterns of PbPLRs under SA treatment
MeJA处理48 h后，根中PbPLR2表达量上调倍数为ck的500倍，且茎中也达400倍；PbPLR3在根中表达上调为ck的140倍(图6)。PbPLR5对MeJA处理响应不明显，茎和根中表达量上调幅度均较低，但ABA(图4)和SA(图5)处理后PbPLR5的表达量上调显著(P＜0.05)，该结果与PbPLR5启动子区域含有的激素响应元件一致。
图 6 PbPLRs基因在MeJA处理下的表达模式
Figure 6. Expression patterns of PbPLRs under MeJA treatment
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木脂素类化合物具有较为广泛的应用前景，PLR作为植物木脂素生物合成的重要限速酶基因之一，引起了广泛的关注。例如，在亚麻中鉴定到2个PLR基因(LuPLR1和LuPLR2)[12]，模式植物拟南芥中共有2个PrR基因(AtPrR1和AtPrR2)[7]，台湾杉中发现了3个PLR基因(TcPLR1、TcPLR2和TcPLR3)等[21]。本研究从闽楠基因组中共鉴定到8个PbPLRs基因，不均等分布于闽楠的4条染色体上，且均含有PLR家族保守的NADPH结合位点和赖氨酸活化位点。PLR属于short-chain dehydrogenase/reductase (SDR)超级家族，该家族广泛参与植物初级代谢和次级代谢过程，且在高等植物中具有明显功能分化[22]。闽楠中数量较多的PLR成员可能参与不同代谢通路，并发生功能分化。
利用不同物种PLR蛋白构建系统进化树，发现裸子植物PLR蛋白单独聚为一类，而被子植物PLR系统聚类与催化酶的立体选择性相关，该结果与前人研究结果相一致。NAKATSUBO等[7]发现被子植物PLR (FiPLR1、LaPLR1、LuPLR1、LpPLR1、AtPrR1和AtPrR2)和裸子植物PLR (TpPLR1和TpPLR2)分别聚类。PLR催化酶的底物立体选择性直接决定了下游木脂素的结构骨架，是形成木脂素类化合物结构多样性的关键节点。PLR立体选择性最早是在金钟连翘Forsythia intermedia中发现，功能研究发现2个FiPLR都偏好选择催化(+)-松脂醇和(+)-落叶松脂醇为(−)-异落叶松脂醇[9]。随后，在其他物种中鉴定的PLRs同样具有明显立体选择性[23]。拟南芥AtPrR1可催化2种松脂醇异构体，而AtPrR2仅能催化(−)-松脂醇形成(−)-落叶松脂醇[7]。根据已有催化酶的功能研究，推测闽楠PbPLR1、PbPLR6、PbPLR7和PbPLR8偏好选择(+)-松脂醇和(+)-落叶松脂醇，而PbPLR2、PbPLR3、PbPLR4和PbPLR5聚类的PLR蛋白的立体选择性不同，无法通过系统进化树推测其底物偏好性。FUJITA等[24]研究发现：北美乔柏的TpPLRs聚类为一个分支却具有相反的立体选择性。PLR家族成员的蛋白序列差异与底物立体选择性并不完全等同，对底物的选择偏好性可能随物种共同经历多次进化；或形成于物种进化的早期，随后的碱基突变并不影响其催化功能[25]。
通过启动子顺式作用元件分析发现：PbPLR基因的启动子区域具有多种响应元件，推测PbPLR表达模式可能受生物及非生物因素调控。例如光响应、厌氧诱导、耐旱和防御等响应元件，推测PbPLR表达可能受光信号及非生物胁迫等因素影响，并通过次生代谢物的催化合成而参与植物防御系统。此外，PbPLRs基因启动子区域具有多种激素响应调控元件，其中ABA、MeJA和SA等3种响应元件数目最多。不同物种PLR基因表达受不同激素调控。例如，ABA处理下亚麻LuPLR1和菘蓝LiPLR1表达显著上调[10, 12-13]；MeJA诱导LuPLR2、IiPLR1和鬼臼草Podophyllum hexandrum PhPLR表达量上调[10, 25]；而GA对LuPLR1表达起抑制作用[21]。对PbPLR表达分析表明：PbPLR对ABA、MeJA和SA均有响应，这与启动子元件分析相吻合。MeJA处理下PbPLR2响应最显著，在处理48 h根部表达量最高；ABA处理下PbPLR4响应最为显著，在处理48 h时叶片表达量最高；SA处理下PbPLR6响应最为显著，在处理48 h时茎表达量最高。本研究表明：PbPLR调控模式较为复杂，可能受不同植物激素诱导，同时PbPLRs组织特异性表达可能与其结构功能分化相关但与系统进化分支无关。推测闽楠木脂素合成具有较为复杂的调控网络，需进一步研究其生物合成调控机制。
Identification of PLR gene family and expression of responsive hormones in Phoebe bournei
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摘要:
目的 解析闽楠Phoebe bournei木脂素合成途径关键酶基因Pinoresinol-lariciresinol reductase (PLR)特征及不同激素处理下的表达模式，探索闽楠PLR基因家族的生物学功能。 方法 利用生物信息学方法鉴定闽楠基因组中的PLR基因家族成员，分析基因结构、保守基序、染色体定位、系统进化、启动子顺式作用元件和激素响应。 结果 从闽楠全基因组内共鉴定出8个闽楠PLR (PbPLR)成员，不均匀地分布于第1、2、5和10号染色体。系统进化分析表明：PbPLR功能可能与底物立体选择性有关。启动子元件分析发现：PbPLRs启动子区域存在脱落酸、水杨酸和茉莉酸甲酯等激素响应元件；基因表达分析表明：PbPLRs基因的表达具有组织特异性和激素响应特征，其中PbPLRs基因在根中表达量最高，其次茎，叶中表达量较低；3种激素处理时，PbPLR2表达诱导最强。 结论 从闽楠基因组中鉴定出的8个PbPLRs基因，其基因特征和不同成员可能具有不同催化酶立体选择性，成员表达模式多样化，可能受多种激素诱导，具有组织特异性。图6表2参25 Abstract:Objective Pinoresinol-laricisinol reductase (PLR) is a key enzyme gene involved in lignan biosynthesis. This study aims to clear the characteristics of PLR gene family in Phoebe bournei and the expression patterns under different hormone treatments, so as provide basis for further exploring the biological function of PLR gene family in P. bournei. Method The members of PLR gene family in P. bournei genome were identified by bioinformatics methods, and the gene structure, conserved motifs, chromosome location, phylogeny, cis acting elements of promoter and hormone response were analyzed. Result A total of 8 PLR (PbPLR) members were identified from the genome of P. bournei, which were unevenly distributed on chromosomes 1, 2, 5 and 10. Phylogenetic analysis indicated that PbPLR function may be related to substrate stereoselectivity. Promoter element analysis showed that there were hormone response elements such as bascisic acid (ABA), salicylic acid (SA), and methyl jasmonate (MeJA) in the promoter region of PbPLRs. Gene expression analysis showed that the expression of PbPLRs gene had the characteristics of tissue specificity and hormone response. The expression of PbPLRs gene was the highest in roots, followed by stems and leaves. The expression of PbPLR2 was the strongest when treated with 3 hormones. Conclusion The 8 PbPLRs gene identified from the genome of P. bournei have different gene characteristics, and different members may have different stereoselectivity of catalytic enzymes. The expression patterns of members are diverse, which may be induced by various hormones and have tissue specificity. [Ch, 6 fig. 2 tab. 25 ref.] -
Key words:
- Phoebe bournei /
- PLR gene family /
- phylogenetics /
- hormone treatment /
- expression analysis
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植物的蒸腾作用是其水分利用的主要方式，拉动水分在“土壤—植物—大气”连续体体系中不断循环迁移。蒸腾耗水与植物生命表征直接联系，决定着植物的水分盈缺和灌溉与否[1]。对活立木蒸腾耗水的准确测定，可以为低耗水树种选择、合理密度配置以及城市园林绿化等工作提供理论依据和参考[2]。树木蒸腾耗水产生的水势差会拉动水分通过木质部向上运输进而形成液流，因此树干液流可作为评估树木蒸腾耗水能力的一项重要指标[3-4]。目前，有多种方法可以评估树木蒸腾耗水能力，多数是通过测定树木液流速率来估算蒸腾耗水量和耗水能力。不同树干液流测定方法测量精度不同，在选择树干液流速率测量方法时需要考虑实验研究目的、活立木树种的生理条件和实验研究所处的自然环境等因素。目前液流速率的测量主要有同位素示踪法和热技术法[5] 2类。其中同位素示踪法通过将化学同位素作为示踪剂注射到树木木质部，从而检测树木液流速率；但该方法在野外应用不便，且测定精度较低，有待改进[6]。利用热技术法测定树干液流不受外界环境和树木自身结构影响，安装布置操作相对简易，并且对树木组织结构损伤较小，具有一定的应用优势[7]，因此被广泛应用于树干液流测定、液流速率与环境因子的关系研究中[8-10]。如王檬檬等[11]应用热技术法研究了晋西黄土区苹果Malus pumila树液流速率与太阳辐射、大气水份等的关系；温淑红等[12]应用热技术法分析了宁南黄土陵区山桃Amygdalus davidiana树树干液流速率与太阳辐射、温度、风速的关系；杨洁等[13]应用热技术法研究了树干液流时滞效应，并精确估算树木的蒸腾耗水；还有学者[14-15]应用热技术法探究树干木质部径向不同深度的液流速率和不同时间尺度下的液流速率特征等。目前常用的测量树干液流的热技术法主要有热脉冲法(Heat Pluse Velocity Method，HPVM)、热平衡法、热扩散法、热场变形法以及外热比法等，前3种方法在国内应用较多，后2种方法在国外有较为详细的应用描述，但在国内的研究有限。鉴于此，本研究综述了现有的树干液流无损检测方法，阐述这些方法的基本原理、装置布置、应用领域和最新研究案例，对不同热技术方法的测量精度、适用范围、潜在优势以及今后改进方向等方面进行讨论和比较，并对不同研究目标和实验条件下适用的测定方法给出建议，展望各自在液流研究方面的应用前景。
1. 基于热技术的液流检测方法
1.1 热脉冲法
热脉冲法最早由HUBER等[16]提出，首次用热作为液体流动的示踪剂，利用热脉冲测量植物液流速率。该装置由加热元件和2个热电偶组成探针块，通过测量加热器发出热脉冲随着液流上升到达热电偶处所需的时间，计算液流速率(图1A)。由于热传导和对流会使得测量结果偏高，MARSHALL[17]利用热流方程建立了热脉冲法的模型框架，为热脉冲法的进一步发展提供了理论基础。
基于脉冲加热的方法包括补偿热脉冲法、最大温差法(T-max法)以及热比率法。其中补偿热脉冲法(Compensation Heat Pulse Method，CHPM)通过测量2个对称放置在线性加热器两侧的温度传感器达到相同温度时的时间来计算液流密度，该装置安装探针时会对周围木材组织造成损伤而导致液流速率失真，因此需要根据不同探针间距设置校正参数[18]，从而使液流速率的测量值更接近真实值。T-max法[19]的装置由加热器和1个温度探针组成，通过记录从发出热脉冲至温度探针到达最大温度时的时间，再根据MARSHALL的基础理论计算液流速率。该方法设备简单，仅需确定被测树干边材的导热系数，即可计算树干液流密度。热比率法(Heat Ratio Method，HRM)基于补偿热脉冲法提出[20]，测量范围可以达到零值甚至延伸至负值，其装置由1个加热器和2个安装在加热器上下游的温度探针组成，通过测定2个探针的增温比即可计算液流速率。
1.2 热平衡法
热平衡法(Heat Balance Method，HBM)的原理是当树干内通过一定量液流时，加热元件作为热源会向树干提供已知的热量，直至树干温度趋于稳定。若不考虑热传导以及隔热层损失热量，热源提供的热量应与被液流带走的热量相等，可根据这种热平衡关系计算液流速率。热平衡法可分为茎热平衡法和树干热平衡法[21]。
1.2.1 茎热平衡法
茎热平衡法(Stem Heat Balance，SHB)[22]以环形加热元件作为热源，提供稳定的热量，热量散失途径包括树干液流带走、热传导向树干上下方散失和对流散失。装置(图1B)设计为包裹式，利用包裹式隔热层(通常为聚苯乙烯泡沫)防止热辐射造成的热量散失(树干周围的热辐射忽略不计)。加热元件上下方安装2对热电偶，用来测定液流通过后的温差，依据热量平衡关系计算液流。SHB法适用于测定胸径较小的树干，其优点是检测时不需要标定，不需要将热电偶插入树干中，对树木无直接损伤。
1.2.2 树干热平衡法
树干热平衡法(Trunk Heat Balance，THB)[23]的原理与茎热平衡法类似，均通过热量平衡关系计算液流，不同点是THB法测量装置(图1C)由插入树干的加热片和1对热电偶组成，2个热电偶分别安装在紧挨加热片上端(温度场最大值)和加热片下端(不受温度场影响)位置，通过记录液流通过前后树干温度差来计算液流。THB法同样不需要标定，并且可测定胸径较大的树干。但THB法设备较多，安装相对复杂，易对树干造成微损伤。目前热平衡法的应用较为广泛，通常用来研究环境因子与液流速率的关系以及耗水特性。
1.3 热扩散法
热扩散法(Thermal Dissipation Method，TDM)[24]又称Granier法，是目前应用最广泛的液流测定方法。该装置(图1D)包含2个传感器探针，沿液流方向插入树干中。下游(上部)探针包括加热元件(长约20 mm)，并缠绕在装有热电偶的钢针上，热电偶尖端正对加热元件的中间；下游(上部)探针不加热，用作参考探头，以测量木质部的环境温度。工作时下游探针以恒定功率(0.2 W)连续加热，受液流的散热影响，2个探头间存在温度差异，因此可通过温差与液流速率间的关系计算液流速率。
TDM法常用来研究树干液流与环境因子的关系。万艳芳等[25]应用热扩散技术测定并分析了青海云杉Picea crassifolia树干液流密度与环境因子的关系，确定液流密度的主要环境影响因子是太阳辐射。朱敏捷等[26]利用热扩散法测定了尾叶桉Eucalyptus urophylla树干液流，研究了树干液流的方位差异以及与环境因子的关系。姚增旺等[27]应用热扩散探针测定梭梭Haloxylon ammodendron树干液流，研究了树干液流与环境因子之间的时滞效应。另外，通过测定单株树干液流还可以推算林分蒸腾量。王志超等[28] 研究了林分蒸腾耗水规律后发现：忽略夜间林分蒸腾耗水量会导致对林分蒸腾耗水量的估计不准确。
1.4 热场变形法
基于热脉冲法测量树木液流密度时，需要测量热脉冲前后温度，获得温度差，这就要求木材具有较高的热稳定性；热脉冲法两侧测量需要时间间隔，可以测得液流密度的最大值为45 cm3·cm−2·h−1，说明该方法具有一定的局限性。为解决以上问题，NADEZHDINA等[29]提出了热场变形法(Heat Field Deformation，HFD)，通过记录线性加热器周围的木质部中不同径向位置的热场变化，将热场变形与树干木质部的液流密度联系起来。热场变形法液流检测系统(图1E)包括3个探针和1个加热器，其中2个探针沿轴向对称安装在加热器的上游和下游，另1个探针沿切向平行于加热器水平安装在加热器侧边，轴向探针测量对称温差，切向探针测量不对称温差。通过测定加热器周围轴向和切向的温度差来表征由树液流动而产生的热场变化，进而确定液流密度。液流密度q (cm3·cm−2·h−1)的一般计算公式为：
$$ q=3\; 600D_{{\rm{st}}}(K＋T_{{\rm{s}}-{\rm{a}}})/T_{{\rm{as}}}Z_{{\rm{ax}}}Z_{{\rm{tg}}}L_{{\rm{sw}}}。 $$ 其中：Dst表示树干边材热扩散率(m2·s−1)；(K＋Ts-a)/Tas表示温差比率；ZaxZtg表示传感器探针间距离的校正因子；Lsw表示边材深度。K表示零液流下Ts-a的绝对值，其中Ts-a为Tsym与Tas的差。Tsym表示对称探针间的温差；Tas表示非对称探针间的温差；Zax表示轴向上游探针与加热器的距离；Ztg表示切向探针与加热器的距离。
HFD传感器也可以记录反向流量，即将Tsym改为负值。因此，计算公式转换为：
$$ q＝－3 \;600D_{{\rm{st}}}(－K+T_{{\rm{s}}-{\rm{a}}})/T_{{\rm{as}}}Z_{{\rm{ax}}}Z_{{\rm{tg}}}L_{{\rm{sw}}}。 $$ 用HFD法测量液流密度，非零液流下，利用线性外推法能准确测得零液流密度，相比其他热技术方法优势显著。同时HFD法结合了对称与非对称温差测量，利用对称温差测量低液流密度较为有效，而测得的高液流密度与实际蒸腾量线性关系不显著，因此高液流密度准确性不够[30]。而利用非对称温差测量是中高液流密度准确性较高。因此，HFD法对于低液流量和高液流量都可以准确测定。
HFD法广泛应用于液流指数(the sap flow index，SFI) 的测定。SFI是植物水分状况的敏感指标，用来决定植物是否需要灌溉。SFI值通过在加热器周围轴向等距安装差动热电偶测得，是液流速率测定的原始数据之一[31]。此外，HFD法可以直接监测木质部的水分运动[32]，通过沿着木质部半径的不同深度，用围绕普通线性加热器的传感器进行液流测定，具有快速响应和高度敏感的特性。NADEZHDINA[33]在对枫树Acer spp. 水运输路径的研究中，利用HFD法测定枫树木质部液流，证实了枫树的维管结构具有完整拓扑结构。
1.5 外热比法
外热比法(External Heat-Ratio，EHR)是在热比率法的基础上提出的，用外部加热元件代替插入式加热元件，其基本原理与激光脉冲法(laser heat-pulse gauge，LHPG)类似。不同点是后者用近红外激光源代替插入式加热元件，并通过红外摄像机从外部监控热量传播，热脉冲速度由温度数据确定，并与液流速率相关。HELFTER等[34]利用激光脉冲法对小茎木本植物的液流速率进行了测定，发现小茎木本植物韧皮部与木质部液流速率几乎一致。CLEARWATER等[35]首次提出了外热比法(图1F)，将1个微型外部加热器(电子芯片电阻)和温度传感器(精密热电偶)粘在软木块上，并压在茎干表面。释放热脉冲后，根据2个热电偶的增温比来计算液流密度。利用外热比法可以测定灌木液流速率[36]，研究植物水动力学，对直径较小的茎干具有良好的适用性。外热比法最小可测直径为5 mm，可测液流密度为0.36~50.00 cm3·cm−2·h−1，较少应用于直径较大的茎干。因此，下一步可改进EHR技术，用于测定较大茎段植物的液流密度。
2. 问题与建议
2.1 热技术方法的不足与改进
探针的使用会对树干边材造成一定的破坏，使得探针处树干边材的热均匀性改变，从而降低测量结果的准确性。GREEN等[37]用二维的“热-液流”模型确定不同伤口大小的校正因子，给出了补偿脉冲法和T-max法的校正因子表，并通过比较美洲黑杨Populus deltoides与白柳Salix alba的液流通量值与实际蒸腾速率值的关系证明了校正因子的有效性。TESTI等[38]在补偿热脉冲法的基础上提出了校准平均梯度法(calibrated average gradient，CAG)，有效测定了低速液流，使用也较为简易。
LANGENSIEPEN等[39] 发现：为更好地适应小麦Triticum aestivum茎的解剖结构和热物理特性，在应用茎热平衡法测量小麦液流速率时，通过引入降噪方程可有效提高液流计的测量精度。TRCALA等[40]利用热场变形法的温度场理论，通过改变传感器的几何形状(从垂直到水平)来改善热平衡法的传感性能，实现了零液流和反向液流的测定。这种方法也被称为线性热平衡法[41]，是从基础传导—对流传热方程解析得出的精确方程，不仅提高了液流测定的精度，而且基于热导率信息实现了水含量的估算。NAKANO等[42]发现：对金柑Fortunella crassifocia进行环剥处理后，可利用热平衡法测定其韧皮部和木质部的液流速率。
TDM法测定液流速率需要估算线性回归关系，确定零液流状态下的温差，而这个过程会产生一定误差[43]，许多情况下准确性受到质疑[44]。因此用热扩散法确定树木的蒸腾量时，有必要对测量树种液流量估计方程进行校准[45-47]。
外热比法也存在一些不足。首先，大多数加热传感器从加热芯片的中心到两侧感温元件有一定的窄间距。随着热量沿横截面向内传播和沿茎轴上下传播，热量到达木质部导管时变得非常分散，来自液流的热比率信号会减弱。其次，加热器和温度传感器被安置在1个矩形的不导电硅酮/软木块中，无法有效隔绝环境温度对检测温度的影响，增加了液流检测结果的误差。再次，矩形加热芯片横压在圆柱形树干上，载荷不均匀，加热器元件使用窄的矩形芯片电阻，比圆形芯片更容易断开。为此，王胜[48]开发了1种新设计的EHR加热传感器，增加了加热元件至温度传感器的间距，使之更适应直径较大的茎干。改良后的装置茎干直径检测范围扩大，可用于胸径较小的树木测量。
2.2 基于热技术液流速度测量的常用方法比较
目前，基于热技术的树干液流测定方法日趋完善，不同方法具有相对应的优势和劣势。由表1可知：不同热技术方法液流测定装置均包括为加热器提供能量的能量供应单元和用于收集检测数据的数据记录仪。具体来看，热脉冲法不受环境条件以及树冠结构及根系特性的影响，装置简洁，但存在一定的灵敏度和精度问题。热平衡法无需标定，测量精度有所提高，但仅适于测定高液流密度。热扩散法是目前研究蒸腾耗水特性应用最广泛的方法，测定结果较准确，仪器成本较低，安装简单，有较成熟的商业化产品，但测定结果容易被低估。热场变形法操作复杂，应用较少，但该方法能够准确测定零液流以及逆向液流，测定精度与范围也有很大的提升。外热比法与激光脉冲法均可实现精确的零破坏检测，但仅适用于胸径较小的树干，另外，激光脉冲法装置成本昂贵，未能普及。
表 1 树干液流的测定方法对比Table 1 Comparison of methods for sap flow measurement方法 装置 优点 缺点 热脉冲法 加热器，2个热电偶 不受环境条件，树冠结构及根系特性的影响，简洁准确， 经济可行[49] 存在测定精度问题[37−38] 热平衡法 探针，加热元件 无需标定，进一步提高了测量精度[22−23] 不适用于液流速率较高的 植物[50] 热扩散法 加热探针，参照探针 测定结果较准确，仪器成本较低，安装简单，有较成熟的 商品化产品[51] 液流可能被低估[43] 激光热脉冲法 近红外激光源，红外摄像机 无须将热源插入植物茎干内，避免对茎干内组织破坏而造 成误差[34] 成本较高 热场变形法 加热器，3根探针 能够准确地测定零液流量以及逆向液流[52] 测定过程较复杂[29] 外热比法 微型外部加热传感器 精确、无损地测定胸径较小的树干中的双向液流[53] 微型外部量规的配置尚存 在问题[35−36] 2.3 活立木液流测定方法选择建议
利用热技术方法测定液流速率，可以精确估算树木蒸腾耗水量[54]，但不同热技术方法的测量精度、测定范围以及适用性不尽相同，实际应用时应根据不同实验条件选择不同的热技术方法。选择热技术方法测定树干液流通常需要考虑树木胸径大小、热技术方法的误差范围、热技术方法的测定精度、热技术方法的可行性等因素。
首先，不同胸径活立木应选用不同的热技术方法，外热比法和茎热平衡法适合测定胸径较小的树木，树干热平衡法适合测定胸径较大的树木。其次，不同热技术方法可测得的液流速率范围不同，补偿热脉冲法、T-max法以及热扩散法测定低速液流的误差较大，茎热平衡法测定高液流速率时误差较大，热比率法和热场变形法测定液流范围较广。热场变形法和外热比法可以测定逆向液流，热场变形法还可以准确测定零液流。热脉冲法、热平衡法和热扩散法较成熟[55]，应用较广泛，可行性较高。另外，将不同测定范围的热技术方法组合使用，可以有效提高测定精度。不同植物的液流速率不同。向日葵Helianthus annuus和玉米Zea mays等植物的液流速率相对较低，在利用T-max方法测定时，测量值总是略高于实际值[56]；换成热比率法测定也不够精确，而采用T-max法与热比率法组合测量则较为准确。
3. 热技术方法应用展望
利用热技术方法测定液流速率约80多年的研究，方法不断得到改进与创新，在校准度、测定范围和测定精度上均有所提高，同时，实验操作不断简化，数据实现自动化采集和存储，并逐步实现连续时间以及多层空间的同步测定[57]。其中，热脉冲法、热平衡法、热扩散法经一系列的发展与完善，极大程度上减小了测量误差[58]。热扩散法还形成了成熟的商业化产品，并得到了广泛的应用。虽然利用外热比法和热场变形法测定活立木液流速率的研究有限，但外热比法实现了精确的零破坏检测，热场变形法液流速率测定范围广，并可准确的测定零液流和逆向液流。在利用外热比法测定液流速率时，需要针对不同样本以及实验条件设计不同的量规，这是外热比法的不足之处。因此，外热比法和热场变形法亟待更为深入研究。
目前，热技术方法成为液流测量的首要选择。在未来，应用热技术测定树干液流仍需关注以下热点：在完善研究活立木蒸腾耗水特点的同时，结合土壤生物因子和气象因子与树干液流的关系，进一步深入研究活立木生理作用；从微观和宏观方面监控水分运动，研究水分利用与树木生长的关系；在生产实际方面，进一步完善活立木单株和森林林区的数据监控，为实现高效的林区治理提供有力依据。
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图 1 PbPLR基因结构及蛋白保守基序分析
Figure 1 Analysis of PbPLR gene structure and protein conserved motifs
图 2 闽楠和多个物种的PLR家族系统发育树
Figure 2 PLR family phylogenetic tree of P. bournei and several species
图 3 PbPLR家族基因的顺式作用元件分析
Figure 3 Analysis of putative cis-elements in the promoter regions of PbPLRs
表 1 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)引物信息
Table 1. RT-qPCR primer information
引物名称 引物序列(5′→3′) PbPLR1 F: GGCACAAATCTCATCAGCAA; R: GCCAGCTTTTATGGCCTGTA PbPLR2 F: TCTGGATTACGTGCAACAGG; R: AGCGTTTGAGATAGTCCTTCG PbPLR3 F: AGGTCTGGATTACGCACAGC; R: CGTTTGAGATAGTCCTTCACTCG PbPLR4 F: GGAATTCCTTGCTCAAATGAAA; R: TTTCGAAATTTGCCAGACAAC PbPLR5 F: GTGGAACAAGAGCCCAAATG; R: CTGGCAAGTGGGTGAAAAAT PbPLR6 F: ATGGGGTGGATAGCAATGAC; R: CCATAACACGCTCTTTATATGAACC PbPLR7 F: AAGCAAGCAGTCAAACAACC; R: AAAGAAGCCTACGGCATGG PbPLR8 F: GTCGCCGGAAACCACTTG; R: AGTTATTTGGTAAACCAACCTTGA PbEF1α F: CATTCAAGTATGCGTGGGT; R: ACGGTGACCAGGAGCA 
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表 2 闽楠PLR基因家族的基本信息
Table 2. Basic information of PLR gene family in P. bournei
基因名称 平均分子量/kDa 等电点 起始位置 染色体位置 氨基酸数量/个 PbPLR1 35 441.98 5.90 82085409~82088341 chr01 336 PbPLR2 35 320.24 6.23 82091009~82098484 chr01 312 PbPLR3 35 378.05 6.32 111385794~111390362 chr02 312 PbPLR4 37 844.40 7.74 80076163~80082267 chr05 312 PbPLR5 35 378.05 6.32 81056124~81058143 chr05 284 PbPLR6 34 970.24 6.41 52893843~52901318 chr10 316 PbPLR7 34 910.23 6.10 52876836~52885817 chr10 316 PbPLR8 13 320.63 8.76 52801277~52802274 chr10 123
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链接本文:
https://zlxb.zafu.edu.cn/article/doi/10.11833/j.issn.2095-0756.20220351
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